第二章 蛋白激酶基本介紹
2.1 蛋白激酶的分類
酵素上某些胺基酸的側鏈對於酵素反應的專一性及催化能力而言是很重要的，因為 在酵素固有的構形中，會迫使這些旁鏈集中在一起，形成活性區 (active site)。活性區包 含兩個重要的區域：受質結合區(binding domain)負責辨識並和受質結合，催化區(catalytic domain)則是在受質結合後負責催化反應。在某些酵素中，催化區就是受質結合區的一 部分，而在其它酵素，這兩個區域的結構就如同它們功能一樣有很大的差異。蛋白激酶 是激酶酵素，會在蛋白質的絲氨酸(serine, S)、蘇氨酸(threonine, T)或酪氨酸( tyrosine, Y) 殘基由化學修正加入磷酸根（磷酸化），直接或是間接來調控蛋白質的功能。蛋白激酶 作用絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y)的磷酸化位置上的殘基具有保留性。它們有趣的 研究是在分子演化的部份。在序列和結構的基本上，這些酵素形成關係密切的超家族 (superfamily) 與組氨酸激酶和其它的磷酸轉移酵素截然不同 [6]。1988 年的時候 Steven K. Hanks 等人把真核細胞（eukaryotic cell）中的蛋白激酶分成五大類 AGC，CAMK，
CMGC，PTK 和其它類[7, 8]。而在最近 G. Manning 等人的論文中[9]，則是把蛋白激酶 依照催化域結構的差別、序列相似度，和生物上的功能分成七大類，並建立了蛋白激酶 家族圖譜 ：
I. AGC 激酶家族：底下主要代表的是 PKA、PKG 和 PKC 三種激酶。AGC 激酶是比 較寢向鹼性胺基酸的蛋白質，磷酸化主要做用於精氨酸(arginine, R)和賴氨酸(lysine, K)附近的絲氨酸(S)跟上蘇氨酸(T)上。
II. CAMK 激酶家族：底下包含了 CaMK、MARK 等許多激酶，CAMK 激酶是比較寢
向鹼性胺基酸的蛋白質，在演化上與AGC 激酶家族相近。
III. CMGC 激酶家族：底下主要代表的是 CDK、MAPK、GSK3 和 CLK 等依賴於細胞 週期素的激酶，磷酸化主要做用於脯胺酸(proline, P)附近的絲氨酸(S)跟上蘇氨酸(T) 上。
IV. TK 激酶家族：底下包含了 EGFR、INSR 和 SRC 等許多作用於酪氨酸(Y) 的激酶。
V. TKL 激酶家族：底下包含了 MLK、LISK、IRAK、Raf、RIPK 和 STRK 等激酶。
VI. CK1 激酶家族：底下包含了 CK1、TTBK 和 VRK 等許多激酶。
VII. STE 激酶家族：底下包含了 MAP2K、MAP3K、MAP 4K 等以 MAPK 組成級聯反 應(cascade)的激酶。
2.1 蛋白激酶的功能
蛋白激酶作用在許多重要的信息傳遞途徑上，催化作用的緊密調控對於真核細胞的 發展和維護至關重要，當它們活化時，不同蛋白激酶的催化區域採用顯著相似的結構，
相較之下，未活化的蛋白激酶的結晶結在面對與特定調控區域或蛋白質的相互作用允許 採用孑然不同的構型蛋白激酶的區域暴露出可易見的可塑性 [6]。
重要的蛋白質磷酸化在真核細胞信號中反應出實際蛋白激酶的區域 2%全部在的 真核基因中發現。特定絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或酪氨酸(Y)的磷酸化的空間與時間是控制 細胞成長和發展的關鍵，激酶活化在錯誤的地方或是在錯誤的時間會有災害的後果，常 常導致細胞轉型 (transformation) 或是癌症。其中以 TK 激酶家族與細胞信號通路有關，
對基本細胞功能比如分裂、分化和抗凋亡信號進行調節。這些激酶雖可促進細胞分裂，
但在非調控的啟動狀態下會導致各種腫瘤的形成。事實上已知的癌症基因中超過70％就
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是與酪氨酸激酶有關[6, 10]。
當幾百個真核細胞蛋白激酶，全部含有相同的催化支架(catalytic scaffold)，一些非 常不一樣的調控機制已經演化成可以允許不同個體的家族輸入特殊訊號打開下游 (downstream) 的功能 [6]。
蛋白激酶是分子開關可以採用至少兩個極端的構型，分別是啟動狀態與停止狀態。
啟動狀態呈現最大活性，而停止狀態呈現最小活性。所有蛋白激酶的催化有同樣的反 應，就是將 ATP 上的磷酸基轉移到絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或酪氨酸(Y)的殘基上的氫氧 根群。這些活性他們全部只催化在結構非常相似的構型上。蛋白激酶在停止狀態時不需 要受到必須達到活化狀態的化學限制，而且不同類別的蛋白激酶演化成採用不同的方式 阻礙催化活性的構型來達成關閉狀態。
2.2 蛋白激酶的結構
為了要說明活性區如何和與特定受質結合並促進這個已結合的受質發生化學變 化 ， 我 們 來 看 環 狀 單 磷 酸 腺 苷 依 賴 型 蛋 白 質 激 酶(cyclic adenosine monophosphate dependent protein kinase)，現在通常被稱為 PKA，是真核細胞蛋白激酶領域中第一個用 X 射線結晶圖觀察到三級結構的例子，是第二訊息相關的酵素，主要做用在絲氨酸(S)，蘇 氨酸(T)上，並且在細胞內處理(cellular processes)，包括轉錄(transcription)，新陳代謝及 細胞的成長和凋亡扮演重要的角色。
圖 2.1: PKA 三級結構
(來源是Protein Data Bank http://www.rcsb.org 編號 2CPK)
圖2.1 來源是Protein Data Bank (http://www.rcsb.org) 編號 2CPK，是由Knighton 等 人 結 晶 出 來 的 PKA 三 級 結 構 [11] ， 此 圖 是 由 PyMol 工 具 產 生 ( http://www.pymol.org )。如圖 2.1，它的結構分成兩個小區域，小 N-端，或稱 N 葉(N lobe)，是一個五股的 β折板和一個明顯的 α 螺旋，稱為 helix αC。 C 葉(C lobe)是一
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個大且顯著地螺旋狀。ATP (adenosine triphosphate)是包在兩葉深入的裂縫中，位置位於 高保留的環 (loop) 連接者β1 和β2 兩股的下方。這個磷酸接合環，或 P 環，包含有保 留 的 富 含 glycine 基 序 (motif) (GxGxψG) 這 裡 的 ψ 通 常 是 酪 氨 酸 (Y) 或 是 苯 丙 氨 酸 (phenylalanine,F)。甘氨酸(glycine,G)殘基允許環靠 ATP 的磷酸非常接近且用骨架的交 互作用協調他們，表留的芳香族的側鏈覆蓋磷酸轉移位置。 在缺乏 ATP的情況下甘氨 酸(G)殘基使得 P 環變的非常易彎曲，事實上他促進小分子抑制物的接合。在環中，一 些抑制物由保留的芳香族殘基的相互作用引起大結構的扭曲。
多肽型受質接合在核苷酸前端的延伸的構型，與 ATP 的γ-磷酸基接近。中心區域 環是 “activation loop”，長通常約 20-30 個殘基，提供了一個平台給多肽型受質。 PKA 是最常見的蛋白激酶，當蛋白激酶活化時它的環是被磷酸化的。活化環的磷酸化使它穩 定在開放和延伸的構型中允許受質接合。
PKA 的活化區是位在催化次單元上一個長達 240 殘基的「激酶核心 (kinase core)」，激酶核心在所有蛋白激酶都具有高度保留性，主要功能是和受質(ATP 及目標 peptide 序列)結合，並且將 ATP 上的磷酸基轉移到絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或酪氨酸(Y) 的殘基上。激酶核心是由一個大的結構域及一個小結構域所組成，介於中間的是一個深 的裂縫，而兩個結構域上都有構成活性區的殘基。
蛋白激酶通常保持停止狀態，而且催化區域的活化通常是包埋在多層的控制中，範 圍從異位效應 (allosteric effectors) 的相互結合到亞細胞內位置轉移。當激酶在不活化與 活化兩個狀態之間切換時，活化環有能力進行較大的構型改變。例如，胰島素受器激酶 (isuline receptor kinase, IRK) 是一個被三個 Y 殘基磷酸化與它的活化環活化。在沒有磷 酸化狀態，活化環塌陷進入活化位置，凍結核苷酸和多肽型受質兩個接合。在磷酸化上 面，活化環延著催化中心移動並且採用一個允許接合與催化的構型。在許多激酶，包括 IRK，在活化環的 N 端因為曲軸上的移動造成這些構型的改變，造成在 Asp-Phe-Gly 序 列保留適當的方向有活化位置。
2.3 特定蛋白激酶磷酸化的位置
蛋白激酶是激酶酵素，所以他與其它酵素一樣在活性區俱有專一性辨識與結合基質 的能力。我們將不同激酶特定磷酸化位置絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或酪氨酸(Y)的地方取出 左右兩邊範圍各7 個殘基，總長 15 建出序列圖案(sequence logos)，放在附錄中。這些序 列圖案是由 WebLogo 工具 (http://weblogo.berkeley.edu [12] )產生出來。序列圖案是一 種基由Shannon 訊息概念圖示化的技術，是用來呈現已經序列排列好常用的慣例，每一 個字母的高度是與相對胺基酸出現頻率成比例，表示在那個位置的保留程度，如果某個 位置全部都只出現那一個胺基酸，則Shannon 訊息最高就是log220=4.32 bits，相反的 如果那個位置每個胺基酸出現的頻率都一樣，則就是 0 bits，這個觀念由 Schneider 在 1990 做了介紹[13]。我們將 13 個常見的激酶的位置保留性列在下表，紅色字體(S/T)
表示在那個位置磷酸化，X 表示這個位置可以是任一個胺基酸。舉例來說我們可以觀查
到 PKA 在位置 -2 和 -3 的地方是有很高頻率會出現精氨酸(arginine, R) 和賴氨酸 (lysine, K)，而 PKB 在位置 -3 地方是有很高頻率會出現精氨酸(R)，在位置 -5 的地方 有很高頻率會出現精氨酸(R) 和賴氨酸(K)，這些對於蛋白激酶特定磷酸化位置的預測是 一個很重要的特徵。
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表2.1:蛋白激酶磷酸化的位置保留性
激酶 位置保留性
PKA (R/K)-(R/K)-X-(S/T) PKB R-X-R-X-X-(S/T) PKC R-R-X-(S/T)-X-(R/K) PKG R-(R/K)-X-(S/T) CaM-KII R-X-X-(S/T) CK1 S-X-X-(S/T)-X-E-S CK2 (S/T)-(D/E)-(D/E)-(D/E) CDK (S/T)-P-X-(R/K)
MAPK P-X-(S/T)-P ATM S-Q
EGFR E-E-X-X-Y-V INSR D-Y-M-X-M SRC E-(E/D)-X-X-Y
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