蛋白質定量

定 量 原 理 是 利 用Bradford Method 經 由 Coomassie Brilliant Blue G-250 reagent 和蛋白質結合的特性。G-250與蛋白質結合後，顏色會 從紅色變為藍色，以光源595nm波長進行偵測，蛋白質濃度越高，其 吸光值會越高。Bio-Rad protein assay dye先以去離子水依1：4之比例

稀釋五倍後，用Whatman No.1濾紙過濾後，於每一試管加入1 ml過濾 液。以0.2 mg/ml、0.4 mg/ml及0.8 mg/ml之BSA作為標準液，測量各 點吸光值後來製定吸光值與蛋白質濃度的標準曲線。在裝有過濾液之 試管加入1-3 μl的待測蛋白液，以595 nm波長測定吸光值，比對標準 液曲線計算待測物之蛋白質濃度。

十一、西方墨點法

1. SDS-PAGE gel preparation

Gel 分為兩層，上層為stacking gel，配置方法為3.2 ml ddH2O中，

分 別 加 入515 μl 的 40% acrylamide/bis 、 412.5 μl 的 1.5M Tris-HCl

（pH6.7）、41.25 μl的10% sodium dodecyl sulfate（SDS）、41.25μl 的 10% ammonium persulfate （ APS ） 及 8.25μl N,N,N′, N′-tetramethylenediamine（TEMED）後，待膠體凝固。下層膠為10%

separation gel，配方為在4.577ml dd H2O中，分別加入937.5μl的3 M Tris-HCl（pH8.9）、1.875 ml的40% acrylamide/bis、75 μl的10% sodium dodecyl sulfate（SDS）、37.5μl的10% ammonium persulfate（APS）及 7.5 μl N,N,N′, N′-tetramethylenediamine（TEMED）後，待膠體凝固。

2.電泳（electrophoresis）

將電泳膠片置於電泳槽中並填滿電泳緩衝液（running buffer），取 定量50μg的待測物蛋白質萃取液與0.35 M protein loading dye混合

後，於95℃下加熱5分鐘作用結束後立刻置於冰上冷卻，將處理好的 蛋白質萃取液注入每一個well中，以10 % SDS-PAGE gel調整電壓至 90 voltage進行電泳分析。約三小時後即可停止電泳並進行蛋白質的 轉印。

3.轉印（Transfer）

剪裁適當大小之PVDF membrane，以100% methanol潤濕後，以去 離子水洗淨浸泡備用。電泳結束後將SDS-PAGE gel由玻片上取下放 在3M paper上，再將PVDF membrane覆蓋於SDS-PAGE gel上，以油性 筆在PVDF membrane上將marker的位置標示清楚，再覆蓋一層3M paper，於 4 ℃低溫環境以400 mA之電流轉印100分鐘即完成。

4.免疫轉漬（immunoblot）

轉印完成後，將PVDF membrane以含5%脫脂奶粉的tris buffered saline with Tween-20（TBST）blocking buffer作用1小時後，倒掉 blocking buffer，以1x TBST清洗三次，各十分鐘。清洗完畢後加入 primary antibody（anti-OPN antibody、anti-GAPDH antibody、anti-actin antibody）抗體作用兩小時後，再以1x TBST清洗三次，各十分鐘，

接著加入secondary antibody（anti-mouse IgG conjugated horse radish peroxidase（HRP））特異性抗體作用40分鐘後，以1x TBST清洗四次，

各十分鐘，最後以enhanced chemiluminescence（ECL）做呈色。利用

ECL呈色的方式，在PVDF membrane上覆蓋ECL buffer作用一分鐘至 五分鐘顯影。

十二、分析細胞內相關基因的表現 （1）RNA的抽取與純化

所有使用的器具均以RNaesZAP處理，以除去RNaes，再使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit，首先將Buffer RLT與β-mercaptoethanol以 100:1混合，加入350或600 μl 混合液於已處理好之細胞培養皿中，混 合均勻後，加入同體積的70%酒精，再次均勻混合，吸取到RNeasy mini column中，離心8000×g 15秒後倒掉濾液。加入700μl Buffer RW1到 mini column中，離心8000×g 15秒後倒掉濾液。加入500 μl Buffer RPE 到mini column，離心8000×g 2分鐘後倒掉濾液，更換新的離心管，

再離心8500×g 1分鐘，確保未殘留試劑於column。最後換新的離心 管，在column中加入30-50 μl RNase-free water，靜置一分鐘後，離心 10000 rpm 1分鐘，所得濾液即為RNA萃取液。

（2） 轉錄聚合酵素鏈鎖反應（Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）

以1μg RNA在50 μl反應混合液，反應混合液包括四種dNTP各200 μM、1× Reaction Buffer（25 mM Tris-HCl, 0.1 mM MgCl2, 0.75 M KCl,

transcriptase，反應的溫度設定為37℃作用60分鐘。

（3）聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）

本實驗以1 μg cDNA在50 μl反應混合液，最終反應混合液包括四種 dNTP mixture 200 μM、引子各0.8 μM、1.0 U Super-them DNA polymerase與1倍PCR reaction buffer（0.01% gelatin, 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, and 10 mM Tris-HCl, pH 9.0）。反應的溫 度及時間設定為95℃變性（denaturation）5分鐘，95℃變性40秒、56℃

引子接合（annealing）40秒、72℃引子延伸（primer extension），以 Mini cycleTMPCR machine（MJ Research Watertown City, MA）進行 25或35個循環反應，而後以72 ℃引子延伸5分鐘。所用cDNA引子列 於 Table 1。

（4）電泳（electrophoresis）

取6 μl PCR產物，以1.2％ agarose gel、100伏特電壓下，在Mupid-2J 迷你水平電泳槽（Cosmo Bio, Tokyo, Japan），使用0.5倍TBE緩衝液

（0.1M Tris, 0.1M boric acid, 2 mM EDTA-Na2, pH8.0）進行瓊膠電 泳。再以ethidium bromide（50 μg/ml）進行5~10分鐘的染色，於紫外 光線透視燈（Viber Lourmat photo-print 008-SD, Cedex, France）下檢 視DNA的長度。