表面微結構的影響

奈米技術的蓬勃發展，為生醫材料的研究找到了另一個全新的方 向。其表面奈米尺度的局部化性或物性產生的微小差異，往往影響到 接觸在其上的細胞行為，而這微小差異也決定了生醫材料的功能。探 討材料表面的奈米微結構如何對細胞貼附、生長的影響，並瞭解其機

或組織工程材料。

以表面微結構的類型來區分，大致上可分為三類：表面粗糙度、

微結構方向性以及微奈米陣列∕孔洞等。這些不同的材料表面結構的 條件對於細胞的成長都會有不同的影響，對於生物相容性[40]，像是 成骨細胞的組織應用在複合材料上面的相容性，這對細胞成長也相對 有影響，生物相容性的良窳除了與材料表面的物理及化學性質有關，

也和細胞對於材料表面的反應有關，像是細胞貼附（Adhesion）與細 胞伸展（Spreading）[82]，下列整理出相關影響的因素。

1. 表面的粗糙度 (Roughness) 對細胞生長行為的影響[41~47、51]

不規則的粗糙表面通常會增進細胞與材料表面的貼附，如圖 2.21、2.22所示[41、44、47、52]。相關的文獻常以鈦或高分子（Polymer）

材料為主來做探討研究，因其多使用在移植、組織、植牙等生醫工程。

P. M. Brett等學者[42]探討不同鈦基材表面形貌對成骨細胞（Bone Cell）附著生長的影響，利用電漿噴塗法在平滑與粗糙的鈦金屬表面

（Ti Plasma-Sprayed Surface, TPS）。將成骨細胞培養四小時至數天後 發現，在TPS與SMO表面的細胞呈現較高的萎縮現象，而SLA表面的 細胞呈現的是較完美的圓形態。L. Ponsonnet等學者[47]以鎳-鈦合金

（Nickel–Titanium Alloy, NiTi）來進行研究，將鎳-鈦合金基材獲得不 同等級的表面得到NiTi80、NiTi400和NiTi2400（80~2400為表面粗糙

度等級）在不同粗糙等級表面上培養纖維組織母細胞（Fibroblasts）。

培養兩小時至四天後發現在NiTi2400基材表面所培養的纖維組織母 細胞，其細胞增植擴散率最大，而NiTi80、NiTi400基材表面所培養 的細胞增值率較低。在培養兩小時後細胞在NiTi80基材表面對照 NiTi2400基材表面沒有明顯的方向等向性；而培養四天後其培養的細 胞培養在NiTi400與NiTi2400基材表面上以NiTi400基材表面上方向性 表現最好。2004年B. Zhu等學者[52]使用未處理的PS表面材料與使用 Nd:YAG的偏振雷射在PS材料表面製作微結構溝槽（Ridge/Groove Type Structures, 深度約在30-40nm），在兩種不同的表面微結構上培 養C6神經膠質瘤細胞（C6 Glioma Cells），發現細胞會在有規則的奈 米表面微結構上呈現有方向性的生長。近幾年來，許多學者利用上述 提到的許多相關方法，像表面電漿處理、磨砂粒度酸性蝕刻表面、雷 射 蝕 刻 等 製 作 不 同 形 式 的 基 材 表 面 ， 爾 後 培 養 像 是 成 骨 細 胞

（Osteoblast）[43]、上皮組織細胞（Epithelial Tissue Cell）[45]來對細 胞的貼附性與方向性作相關的探討，也間接證實表面的粗糙度對細胞 相關的運動行為、貼附性等皆有顯著影響。

圖 2.21 不同表面粗糙度的基板[41、44、47]。

圖 2.22 各種細胞貼附於不同表面粗糙度的基板[41、44、47、52]。

2. 微結構的方向性對細胞生長行為的影響（Orientation）[37~40、

49~60]

基材表面微結構對細胞生長行為的影響，最早的研究是在 1912 年由 H. RG 等學者[38]提出，利用人造或者天然纖維的基材在其圖紋 表面上培養細胞或是進行體外培植。1971 年由 Rovensky et al.等學者 [40]利用微溝型（Ridged and Grooved）基材研究細胞行為反應，在溝 槽形態的結構上細胞明顯沿著溝槽的方向生長。至今仍有相當多學者 利用相似的基材形式來對細胞行為反應做相關研究。1976 年 Ebendal 等學者研究指出認為具方向性纖維細胞外間質（Extracellular Matrix）

對動物細胞的移動、方向性及生長形式在具有微結構材料的表面上，

細胞的生長方式與方向性呈現一個較有規則的排列。1991 年 P. Clark 等學者[49]利用氬氣離子雷射（Argon Ion Laser）及氧電漿反應性離 子蝕刻（Reactive Ion Etched in an Oxygen Plasma）在石英材料上完成 微溝型（Ridged and Grooved）的表面微結構，溝槽結構深度尺寸為 100nm、210nm、400nm，寬度為 266nm，不同的深寬尺寸下，塗覆 一層多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）培植幼倉鼠細胞（Baby Hamster Kidney, BHK）及一般所稱的上皮細胞（犬腎細胞，Madin- Darby Canine Kidney Cell, MDCK），觀察其細胞的成長方向性及生長率，結 果發現細胞成長在溝槽寬度為 30 m，深度在 400nm 的條件下，細胞

呈現良好的方向性與貼附性。2003 年 P. Li 等學者[50]以蓋玻片薄膜

（Thermanox Film），利用膠原包覆法（Collagen-Coated）及雷射圖 紋法（Laser-Patterned）完成蓋玻片表面微結構，分成親水（Hydrophilic）

TXL、疏水（Hydrophobic）TXB 兩種類型，其溝槽結構尺寸線寬範 圍約在 1.2 m~9.7 m，U 型結構尺寸（Ridged and Grooved）及深度的 範圍在 0.4 m~1.3 m，在不同親疏水結構的材料表面培養纖維組織母 細胞（L929），研究證明不同的深寬比的細胞型態與成長方向，發現 細胞易生長在窄長的溝槽中。2005 年 E. K. F. Yim 等學者[51]利用 SiO2

作為壓印母模（Grating-Mold），設定在溫度 180℃壓力為 6MPa 的條 件下壓印高分子材料（Polymethyl Methacrylate, PMMA）及複製高分 子結構的表面（Polydimethylsiloxane, PDMS），表面微結構尺寸為線 寬約 350nm、節距 700nm、深度 350nm，在表面微結構上培養平滑肌 細胞（Smooth Muscle Cells, SMC），相對於平坦的表面結構，此研究 驗證出 90﹪的細胞會沿著狹長溝槽方向生長。相關的文獻也印證出微 溝槽對細胞生長的方向性有非常顯著的影響，C. D. W Wilkinson, A. S.

G Curtis 等學者[53]研究早已驗證出以大鼠結狀神經節（Rat Nodose Ganglion Neurites）細胞生長在網絡狀溝軌的微結構（溝軌寬約 5 m）

上能延伸擴展並順著線狀般的網絡溝軌方向生長，且其神經膠質細胞

（Glial Cell）生長形態是完整的。近幾年相關的微溝槽方向結構對細

胞影響的研究更屢見不鮮，許多學者研究微奈米結構尺寸對組織細胞 影響，在不同尺寸的微結構表面下培養小鼠細胞（Neonatal Rats）[53、

54]、小倉鼠腎臟細胞（Baby Hamster Kidney, BHK）[55]、纖維組織 母細胞（Fibroblasts）[56]、成骨細胞（Obtained, Calf Periost）內，肌 動蛋白（Actinin）、鈕帶蛋白（Vinculin）及黏合素（Integrin,整合蛋 白）[57]、人角膜上皮細胞（Human Corneal Epithelial Cells）[58]、牛 動脈內皮細胞（Bovine Aortic Endothelial Cells, BAE）[59]，主要探討 在不同的微結構材料及尺寸高寬比下，細胞對於在溝槽的生長、遷 移、分化、貼附、細胞個體及群落或者培養後細胞的增植率、衰減率 等行為來進行相關的研究[60]，如圖 2.23、圖 2.24 所示[38、49、50、

53、59]。

圖 2.23 各種細胞在不同材料表面微結構、尺寸深寬比下的生長行為

圖 2.24 各種細胞在不同材料表面微結構、尺寸深寬比下的生長行為 [53、58、59]。

3. 微奈米陣列/針狀、柱狀對細胞生長行為的影響（Nano-Micro Scale Array）

Martanto et al.與 Matriano et al.等學者[63]利用蝕刻矽晶片與雷射 切割製作出 150 m（如圖 2.25 所示[63]），與 1000 m（如圖 2.26 所 示[63]），排列大量的生物探針陣列結構。Mikszta et al.等學者[62]證 明了 DNA 疫苗對微探針（Microneedles）會產生免疫反應。使微探針

（Blunt-Tipped Microneedles）使用在貼附於皮膚促進傳遞作用（DNA 疫苗）的可能性。D. Motlagh 等學者[54]將矽晶圓利用紫外光硬化奈 米轉印技術 (UV-Cured Nanoimprint Lithography)製成為奈米溝槽後 塗佈一層負光阻（Negative Photoresist）再利用紫外光硬化奈米轉印 技術然後沈積一層聚對二甲苯（Parylene）產生一個矽樹脂的膠體最 後完成一個矽基材的雙樣式結構（Micropegged and Grooved），在結 合體上培植肌肉細胞（Myocytes from Neonatal Rats）。結果發現與平 坦表面、柱狀微結構表面及結合體，三種不同材料表面微結構對照 後，發現細胞黏附率以結合體的結果最多排列方向最明顯，如圖 2.26 所示。 W. T. Su 等學者[64]製作一個矽基柱狀微奈米結構的基材，是 利用光罩蝕刻法（Photolithographic）和非等向性蝕刻技術，完成方形 柱狀的陣列微奈米結構，在不同尺寸的矽陣列微奈米結構（Si-1-3-1、

Si-1-3-5、Si-1-3-10，數字分別代表了柱的直徑、間距及柱高，單位：

m）下，發現纖維組織母細胞在柱狀較高的微奈米結構下生長情況 良好且有較大面積的生長，如圖 2.27 所示[64]。

對於蜂巢狀薄膜的製備相關的研究有許多學者提出，2005年A. T suruma等學者[65]將高分子及兩性高分子(Amphiphilic Triblock Copo ly-mers, ABCs)摻雜在一起且分解於三氯甲烷的比重為10：1，將高分 子混合到玻璃結構上而蜂巢狀圖形薄膜的規則孔徑是將高分子溶液

利用Blowing Humid Air的方式於材料表面方式來製作，最後完成自 組裝的高分子蜂巢狀薄膜；再另製PCL（高分子）平坦薄膜，將高分 子溶液滴至覆蓋的玻璃表面上。覆蓋的玻璃與高分子層，使用旋轉塗 佈機，旋轉速率在1000rpm 30秒。爾後完成薄膜配置後，將PCL平坦 薄膜與PCL圖形薄膜(直徑在3 m、 5 m、 8 m和 10 m) 去培養神 經（單位）細胞。蜂巢狀圖形薄膜的邊緣擴大是由於圖形薄膜增加孔 徑尺寸。各個薄膜的多孔性大約在50％左右。在不同孔徑尺寸的薄膜

（直徑在5 m、 8 m和 10 m）結構上培養神經幹細胞（Neural Cel ls, 細胞取自幼鼠大腦的皮質層）。培養五天後發現神經細胞的神經 元在PCL平坦薄膜與圖形薄膜上之數量。研究驗證神經細胞的數量減 少是因為圖形薄膜的孔徑尺寸及邊緣尺寸變大的原因，如圖2.28所 示。2005年H. Sunami等學者[66]製備蜂巢薄膜，是將其鋪在一個濕 潤的表面去延展一個聚合物的溶液，包含了PCL高分子和兩親聚合物

（Amphiphilic，意指為一帶疏水基和親水基的共聚物，可以當作乳化 劑，控制藥物釋放載體，單層或多層的LB膜，而許多的天然分子蛋 白、DNA等皆是兩親聚合物。LB膜為一將氣、液界面上的單分子層 膜轉移到固體表面所組裝的層膜），製作完成後蜂巢結構（孔徑為5 m和內壁厚為8 m）爾後再製備另一平坦薄膜。在兩種不同維結構表 面上培養內皮細胞（Porcine Aortic Endothelial Cells）72小時後。發

現纖維黏接蛋白，如圖2.29所示（綠點），在蜂巢狀薄膜表現出一個 特殊吸附作用。而黏附斑纖維黏接蛋白（黏附斑是細胞和細胞外基質 黏附的一種複合結構，在細胞運動中發揮其黏附作用）幾乎不黏附在 平坦薄膜，較多的纖維黏接蛋白黏附在蜂巢狀薄膜。清蛋白，如圖2.

29所示（紅點），黏附在蜂巢狀薄膜沒有被淘汰，然而纖維黏接蛋白 主要是黏附在蜂巢狀孔隙中。值得注意的明顯差異在纖維黏接蛋白結 構黏附於蜂巢狀薄膜和平坦薄膜間，雖然兩者的化學構成相同，證明 出一明顯的要點係在纖維黏接蛋白結構對蜂巢狀薄膜黏附有較明顯 的細胞貼附行為。亦有許多相關的研究利用相似的蜂巢狀薄膜製程培 養NIH3T3纖維母細胞（Fibroblast Cells），在不同的高分子蜂巢狀薄 膜下對細胞的黏附生長行為也有相對性的影響[67]。

圖 2.25 針狀陣列結構，尺寸為 150 m[63]。

圖 2.27 纖維組織母細胞的生長行為[63、64]。

圖 2.28 神經細胞數量在不同圖形薄膜孔徑及邊緣尺寸之情形[65]。

圖 2.29 內皮細胞數在蜂巢狀薄膜和平坦薄膜的比較 [66]。

4. 微奈米陣列/孔洞（Nano-Micro Cavities）

許多研究於微奈米級尺寸結構的材料表面，細胞的運動方向會由 材料表面結構的形狀所引導進行生長。觀察細胞去探討其在特殊微結 構上生長的現象，這些具有典型生長行為的細胞包含：維管組織的培 養、成骨細胞生長於孔洞表面、纖維母細胞培養於孔洞的薄膜上或者

將微米尺寸的結構去運用在隔離血球細胞的生長範圍的尺寸大小以 及細胞培養的基材上，而這些不同奈微米尺度的表面結構上，細胞在 特殊結構上明顯的呈現出良好的貼附、增殖和擴散等細胞行為[67]。

材料表面的微米結構對於控制細胞的行為是非常重要的，許多研 究結果得到在高分子材料表面上具有微米尺寸的孔洞與平坦的材料 表面做比較時，將細胞培養在有微米尺寸的結構上可以控制細胞的分 布情形、數量的變異性，且細胞呈現有規則的方向性生長[87~97]。

許 多 相 關 的 研 究 下 ， J. Hyun 等 學 者 [71] 利 用 Low-Pressure-Soft-Microembossing ( SEmb) 製程在PDMS高分子材 料表面上完成方形與微溝的圖案結構，在其上培養纖維連接蛋白與纖 維母細胞，觀察細胞其生長行為，結果發現除了細胞本身的生長行 為，微結構也因細胞的生長特性間接影響了細胞生長的方向與貼附 性 。 Y. Wan 等 學 者 [68] 使 用 PS 高 分 子 材 料 及 4- 環 氧 丁 烷

（Tetrahydrofuran）與乙二醇（Ethylene Glycol）溶液進行evaporation

作用，有些許的 4-環氧丁烷因作用後造成 PS 材料產生圓孔，完成後 再以此 PS 材料模造（Molding）一個 PLLA 的高分子材料薄膜。在此 兩種不同基材上培養成肌細胞（OCT-1 Osteoblasts），結果發現呈島 狀的 PLLA 材料薄膜上細胞貼附率，比孔洞的 PS 材料高，而細胞在 孔洞 PS 材料上會傾向孔徑大且淺的地方生長；孔徑小且深的地方則