（Surface Plasmon Wave, SPW）可藉由外加電子或光子來激發薄金屬層及含
有待測物介電層界面間之縱向表面自由電子共振運動，此共振運動會沿著 介電質與金屬層間之界面進行傳播。表面電漿波之電磁場在界面處由於共 振而增強的強度，沿著垂直於界面方向進入介質中並呈現指數形式衰減
(exponentially decay)。當入射光波平行於界面之波向量分量等於表面電漿波
之波向量時，表面電漿波才會被激發出來。此激發條件與介質之介電常數、
*RIUsensitivity (refractive-index unit靈敏度)定義如下：
sensivity
Phase resolution RIU Phase shift
reflection index change
=
(3)強度量測[18] (Attenuated Total Reflection , ATR)，是 Otto於 1968年發明的耦合結構，他 所提出的是一種稜鏡-空氣-金屬薄膜結構，入射光經由稜鏡耦合，而稜鏡與 金屬薄膜之空氣間隙保持約一個光波長的距離，當入射光調整至適當角度 時，進入空氣的衰逝波(Evanescent Wave)會在空氣間隙與金屬薄膜表面之介 面上產生表面電漿現象。此架構的缺點是稜鏡與金屬薄膜的間隙距離無法
傳統表面電漿共振系統主要調整入射角於共振角附近時，以一具有偏
通常橢圓偏光術是在外反射(external reflection)的情況下操作，即光源 是從疏介質入射到密介質。但是光源從疏介質入射到密介質而產生內全反
技術通稱為全反射橢圓偏光術(Total Internal Reflection Ellipsometry)[21]，而 此技術也與一般橢圓偏光術相同是遵守Fresnel Equation，但最大的優點是 可以偵測液相的介面反應，且入射光不經過液體所以不易受液體擾動與不 透明的影響，如果配合表面電漿共振技術則靈敏度可大幅提高。我們模擬 稜鏡-金膜-水的三層結構來說明全反射與外反射橢圓偏光術的橢圓偏光參 數變化，此時金膜的厚度設定為表面電漿共振感測中的最佳厚度50nm，折
射率為0.18+3.32i。經由比較可以發現當內反射時Ψ在入射角為65°至85°
區間時有劇烈變化，如圖4-1所示，當入射角約為 73°時Ψ達到最低點即所 謂共振角的位置，但在外反射情況下Ψ的變化有限，並不如內反射情況明 顯。圖4-2所示為Δ隨入射角的變化，與Ψ相同在共振角附近時有明顯的變 化，且較Ψ的變化更為劇烈。圖4-3與圖4-4 所示為進一步分析P波與S波 的光強度與相位變化的結果，由圖中我們可以發現在不同的入射角下，P 波之反射光強度與相位變化均比S波變化劇烈。由此可知觀測共振角下，P 波之相位因表面電漿共振特性改變是量測介面微量折射率改變的最佳感測 區域。
圖4-1 內反射與外反射下Ψ 隨入射角變化的關係圖
圖4-2 內反射與外反射下Δ 隨入射角變化的關係圖
圖4-3 P 波與 S 波的反射光強隨入射角變化的關係圖
圖4-4 P 波與 S 波的相位改變隨入射角變化的關係圖
4.3表面電漿共振增強式橢圓偏光系統實驗架構 關。本架構是使用National instruments的DAQ 卡(PCI-6115)擷取訊號，其 最大擷取速度為10 MS/s，且內建的記憶體為64 MS，但是一半的內建記憶 體專用於類比輸入，另一半則用於類比輸出，所以只有32 MS的記憶體容
方法能記錄的最長時間為6.4秒。利用傅立葉轉換以求得橢圓偏光參數時，
我們需要2個光彈調變器的調變週期(擷取頻率是5 MS/s且光彈調變器的調
變頻率約50 kHz，所以2個約擷取 200個資料點)才能計算出一組準確的橢
圓偏光參數值，依此計算每組橢圓偏光參數的時間解析度為40μs。
圖4-5 表面電漿共振增強式橢圓偏光系統實驗架構
4.4 系統時間解析度測試
我們用快速電場的轉換來調製TNLC ( Twist Nemtic Liquid Crystal )分 子的扭曲狀況，使的出射光之偏極狀態也發生改變，利用光彈調變器與DAQ Card 的快速量測特性，可求出橢圓偏光參數Ψ 和 Δ ，進而觀察出射光偏極 狀態的變化。 我們利用訊號產生器(functional generator)輸出一 1 KHz，5V 方 波至液晶待測標本，其目的是為防止液晶因恆定電場而產生解離。 TNLC為 器(temporal light modulator)。 如4.3節所述，當出射光的橢圓偏極態改變 時量測到的橢圓偏光參數也會發生改變，則由示波器上觀察波形的變化也 會隨之改變，我們使用DAQ 卡(National instruments PCI-6115，10M samples) 來擷取訊號，經過數位轉換後將波形資訊記錄下來後做訊號處理，我們將 取樣長度定為PEM周期的2倍，也就是兩週來做一次傅立葉轉換，可得到 IDC、I1f、I2f與其他各倍頻訊號大小，再由式(2.19)可算出待測物的橢圓偏光 參數Ψ與Δ。
圖4-6 所示即為由計算後所得到的液晶調製入射光偏極態隨時間變化 的結果，當液晶分子未加電壓時為一相位延遲片，此時穿透過的線偏極光 變為橢圓偏極光，所以此時Ψ =22.5 Δ =160 ，當外加電場於液晶分子上時，
液晶分子開始傾向平行於外加電場的方向，而漸漸變成為光學各向同性
(isotropic)材料，此時Ψ =45 Δ =0 ，當電場消失後，液晶分子又回復成原
來扭曲狀態。由此可以測得液晶的反應時間，由圖形估計液晶待測物之上 昇時間約為7.5ms，而下降時間由於液晶分子間的內聚力所致，和外加電壓 無關且速度較慢約為19ms。
圖4-6 動態量測液晶樣品的Ψ 與 Δ 變化圖
4.5 系統靈敏度測試
分鐘系統穩定度測試後用蠕動幫浦注入不同重量百分濃度的甘油-純水混 合物，每種不同重量百分濃度的混合物約在反應槽內停留三分鐘，之後注 入更高濃度之混合物，最後再注入純水回復至最初狀態。
即時量測到之橢圓偏光參數Ψ與Δ顯示在圖4-7，我們可發現在共振角 附近時，Ψ的變化並不如Δ變化來的明顯，其結果與理論模擬趨勢相近，而 最後注入純水後，橢圓偏光參數皆會回到原點附近，顯示本系統的穩定度 良好，不會因為時間的變化直造成相位的飄移。
圖4-7 不同重量百分濃度的甘油-純水混合物隨Ψ 與 Δ 的變化圖
進一步調整入射角使之遠離共振角2°(入射角為71°時)，再重複本實驗 並將橢圓偏光參數的變化量與不同重量百分濃度的甘油-純水混合物之關 係做比較，如圖4-8所示。我們可以發現在共振角時(73°)，Δ的變化量遠大 於非共振角時(71°)，而Ψ的變化量則大致相同，但在非共振角時的變化量 較為線性，與結果理論模擬值相同。我們可由在共振角時Δ的變化量來計算 本系統之靈敏度，當注入0.1%的甘油時相對的折射率變化為0.00012，所得
到的Δ變化為12.18°，而光彈調變式橢圓偏光儀所能量測到最小的Δ變化量
為0.02°，由此可推得本系統的靈敏度約為2 10× −7RIU(refractive-index unit)， 與利用外差干涉量測方法或是元件旋轉式橢圓儀量測的靈敏度幾近相同 [24]。
圖4-8 入射角為 71°與 73°時，不同重量百分濃度的甘油-純水混合物隨Ψ 與 Δ 的變化圖
4.6介面化學反應與生物分子固定化實驗
chip(amersham pharmacia biotech)，它具有經由hydrogel matrix修飾過的金 膜表面，提供適合的環境使蛋白質或其他ligand 利用共價鍵快速且簡單的 接上感應器表面，而本實驗所要固定的分子為中性免疫球蛋白IgG (pI = 6~8)，所以採用胺類偶合法共價鍵結上感應片，其過程可分為活化-偶合共 兩個步驟，如圖4-9所示
圖4-9 胺類偶合法原理示意圖
利 用 胺 類 偶 合 法 共 價 鍵 結 上 感 應 片 的 過 程 分 為 活 化(activation)、 偶 合 (coupling)共兩個步驟[25]。
1.活化晶片表面：將0.2 mol dm-3 EDC及0.05 mol dm-3 NHS一比一混合溶 液注入反應盒，使自我吸附層(Self Assembled Monolayer, SAM)上的 carboxyl group被活化成N-hydroxysuccinimide (NHS) ester。過程約七分 鐘。
2.蛋白質的耦合：將80μg/ml的免疫球蛋白溶於低於本身等電位點的低 離子性緩衝液(low-ionic-strength buffer) 10mM sodium acetate，使蛋白質 變成帶正電的狀態，當帶正電的蛋白質通過第一步驟中被活化帶負電
的carboxyl group，蛋白質就會以靜電力相吸的作用靠近自我吸附層，
而蛋白質上的親核基(nucleophilic group)就會與被活化的NHS ester反 應，產生親核取代作用(nucleophilic displacement)，使蛋白質能產生共
價鍵結(covalent bond)。此固定時間為七分鐘。
實驗過程如同系統靈敏度測試，我們先將反應槽內注入500μl的 PBS(Phosphate Buffered Saline)溶液，後將入射角調整至共振角位置
(72.8°)，之後開始用運用鎖相放大技術即時監測橢圓偏光參數Ψ與Δ值。由
液注入反應槽中，觀察親合力相吸引而結合之動態過程。
由上述實驗可知，利用橢圓偏光儀結合表面電漿共振技術可以增強反 應之橢圓偏光參數變化量而提高偵測生物分子間較互作用之靈敏度，運用 鎖相放大分析技術，可同時量測多個倍頻訊號的大小並相互對比，此方法 可以濾除非同倍頻訊號的雜訊，提高訊號雜訊比以增加量測之靈敏度;另利 用數位波形紀錄與事後利用傅立葉轉換，則量測橢圓偏光參數所需之時間 約為40μs，可對於快速反應作短時間的紀錄與分析。
圖4-10 (a)數位式波形擷取分析之Ψ 與 Δ 值隨時間變化的關係圖 (b)即時監測Ψ 與 Δ 值隨時間變化的關係圖
圖4-11 流速為 0.1 ml/s 時，Ψ 與 Δ 的及時監測變化圖 (a) 數位式波形擷取分析之Δ 值隨時間變化的關係圖 (b) 數位式波形擷取分析之Ψ 值隨時間變化的關係圖
本量測方法之特色為具有快速量測的能力，量測橢圓偏光參數所需之 時間約為40μs，是現有利用表面電漿共振技術量測方法無法達到的。表面 電漿共振技術近年來在研究蛋白質分子間相互作用扮演重要的角色，我們 想以此為基礎來探討蛋白質之間相互作用或蛋白質折疊的結構變化，以上 兩種較快速的蛋白質反應作用時間常數約在毫秒(millisecond)與至次微秒
(sub- microsecond)之間[26]，本實驗建立的量測架構和方法可以滿足此時間
常數反應區間得的量測需求，本實驗未來亦將尋找其它適合的蛋白質分子