利 用 硫 酸 十 二 酯 鈉 聚 丙 烯 醯 胺 凝 膠 電 泳 法 （sodium dedecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）依各種蛋白質 具有不同分子量之特性來進行分離。本次實驗所針對探討的蛋白質為
SDS-PAGE 準備：
製備gel 的各種溶液：
【溶液配製一】
30g acrylamide，0.8g bis acrylamide 加水至 100 ml（a 溶液）
Tris buffer a：12.1g Tris 加水至 100 ml，pH 6.8 Tris buffer b：12.1g Tris 加水至 100 ml，pH 8.8 10% SDS：10g SDS 加水至 100 ml
10% ammonium persulfate：0.1g ammonium persulfate 加水至 1 ml TEMED
10％ Resoling gel：
a 溶液 3.3 ml Tris buffer b 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml ddH2O 4.0 ml 10% ammonium persulfate 0.1 ml TEMED 0.004 ml Total 10 ml
5％ Stacking gel：
a 溶液 0.67 ml
10%SDS 0.04 ml ddH2O 2.7 ml 10% ammonium persulfate 0.04 ml TEMED 0.004 ml Total 4 ml
製備gel
配製好的resoling gel 溶液，倒入已準備好之玻璃片槽內，再加 入水或酒精於gel 上使其平整。待 gel 凝結後，除去水或酒精層，加 入混合好之stacking gel 溶液並同時將一個梳狀模板（comb）插入，
待其凝結後即完成SDS-PAGE gel 的製備。
萃取蛋白質
動物犧牲後，將端腦取出並且加入蛋白質萃取液（Tissue Protein Extraction Reagent, PIERCE）混合後，利用研磨棒將組織均質化
（homogenize）。在 4℃下以 10,000 g 之速度離心 30 分鐘。取上清液 作為全量細胞溶解液，貯存於-20℃備用。
電泳（Electrophoresis）
依照 Laemmali 法進行 SDS-PAGE，將蛋白質分離。將凝好的膠 體置於電泳槽中（Bio-Rad），並於槽中注入 running buffer（參考，溶
液配製二）。將定量之蛋白質樣本注入凝膠內所預留之空格（well）
中，以70 伏特作為電泳之起始電壓，當色帶進入分離區（resoling gel）
時，再以150 伏特之電壓進行跑至藍色染劑到達凝膠底部( 約 1.2 小 時 )。待電泳結束後，取出膠體，進行轉印( transfer )的步驟。
【溶液配製二】
Running buffer, pH8.3：
Tris 15.1 g Glycine 94 g
（先加900 ml的ddH2O溶解之）
10% SDS 50 ml 加ddH2O至最後體積為 1000 ml
Sample buffer（5X）：
1 M Tris（pH6.8） 1.25 ml Glycerol 2.0 ml 20 %SDS 2.0 ml β-mercaptoethanol 0.2 ml Bromophenol blue 2 mg 加ddH2O使體積至 10 ml
蛋白質電泳轉印法（Blotting）
將 PVDF membrane 用浸泡 5 分鐘後，作為前處理。在半乾轉漬 槽（semi-dry transfer unit）內預舖一張經 transfer buffer（參考，溶液 配製三）浸潤的 3M 濾紙，把跑完電泳的 SDS-PAGE 凝膠取出，平 鋪在濾紙上，再將已預處理完全的PVDF membrane 鋪上，並趕走氣 泡。最後在上方加鋪一張經Transfer buffer 浸潤的 3M 濾紙。完成裝 置後，在4℃下以 70 伏特電壓，200 毫安培電流進行轉漬 1 小時，完 成後取出PVDF membrane。
【溶液配製三】
Transfer buffer：
Tris 3.03 g Glycine 14.41 g Methanol 200 ml 加ddH2O使體積至 1L
封阻步驟 （blocking）
轉印完成的PVDF membrane 置於 5%脫脂牛奶／PBST 中，在室 溫下以30 rpm 搖晃 1~2 小時，以阻斷非特異性結合。
免疫染色法
將PVDF membrane 以 washing buffer（參考，溶液配製四）清洗 5 分鐘四次，再加入以 1x PBST 稀釋的
first antibodies（Anti- MAPK &
Anti-Phospho- MAPK，如附表一），4℃下反應過夜。反應完後以 washing buffer 清洗 5 分鐘四次，加入以 1x PBST 稀釋的 HRP
conjugated secondary antibodies (如附表一)，室溫下反應一個小時。反
應完後以washing buffer 清洗 5 分鐘四次。
最後，將PVDF membrane上殘留的buffer稍微以擦手紙吸乾後，
以ECLTM套組呈色（PerkinElmer Life Sciences, USA, NEL104/NEL 105），將Luminol和反應促進劑混合液，倒入PVDF membrane上使之 均勻分布。Luminol 和second antibody上的HRP於溫室下反應 1 分 鐘，產生的螢光物質，再以冷光影像分析儀（FUJIFILM, LAS-3000）
進行螢光偵測，即可得清晰結果。最後利用冷光影像分析儀所撘配的 分析軟體MultiGauge進行分析蛋白質條紋的optical density值，以量化 蛋白質的表現量。
【溶液配製四】
Washing buffer（PBST）：
10X Phosphate Buffered Saline（10X PBS）（1000 ml）
Na2HPO4 11.49 g NaCl 85 g
10X PBS-Tween 20（10X PBST）（1000 ml）
10X PBS 995 ml Tween 20 5 ml
Blocking buffer：
Non-fat milk powder 5 g 加washing buffer 至 100 ml
<附表一>
a. First antibody diluents
抗體名稱：Anti-
p44/42 MAP Kinase
稀釋濃度：1/5000 購買公司、貨品編號：Cell signaling Technology, Inc. #9101抗體名稱：