試驗方法

(一) 外施荷爾蒙處理

將苦瓜‘月華’種子去除種殼後，以 50℃溫湯處理約 1 小時，播種於以根基旺及 泥炭苔一比一混合之介質，栽培於國立臺灣大學轉殖溫室及精密溫室。葉面噴施 100 mg･L^-1之 GA3 或 500 mg･L^-1益收於六至八葉期苦瓜苗株，每三天噴施一次，

共施用 3 次，於第 9 天採取植株地上部，以液態氮急速冷凍，凍存於-80℃備用。

(二) 低溫及荷爾蒙浸種處理

將苦瓜種子浸種於 100 mg･L^-1 GA3、離層酸、萘乙酸、激動素或 25 mg･L^-1 益 收於 4℃處理 15 天，取出以二次蒸餾水潤洗，再以擦手紙拭乾，去除種殼後，播 種於以根基旺及泥炭苔一比一混合介質，栽培於臺灣大學轉殖溫室及精密溫室，待 其長至至六至八片葉時，採取植株地上部，以液態氮急速冷凍，凍存於-80℃備用。

(三) 苦瓜總 RNA 萃取

預先將 15 ml RNA 萃取緩衝液 [3% hexadecyl trimethyl-ammonium bromide (CTAB)、3% polyvinylpyrrolidone-40 (PVP-40)、25 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium (Na2EDTA) pH 8.0、2M sodium chloride (NaCl)、0.1M Tris-HCl pH8.0、0.05%

spermidine)] 與 600 μL 2-mercaptoethanol 混勻，取苦瓜地上部組織約 2 g 以液態氮 研磨至細粉狀，加入 RNA 萃取緩衝液中混勻，於 65℃水浴 10 分鐘，加入 15 ml CI (chloroform/isoamyl alcohol = 24:1) 震盪混勻，以 Beckman J2-MC 離心機、轉子

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JS13.1，於 4℃以 8,800 rpm 離心 10 分鐘，上清液再重複上步驟以 CI 萃取一次。

取上清，加入 1/3 體積之 8 M 氯化鋰 (lithium chloride, LiCl)，於 4℃過夜沉澱。以 Beckman J2-MC 離心機、轉子 JS13.1，於 4℃以 8,800 rpm 離心 30 分鐘，倒除上 清，以 500 μL 之 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) 回溶 pellet，取至 1.5 ml 微量 離心管，加入 500 μL CI 震盪混勻，於 4℃以 13200 rpm 離心 10 分鐘，取上清，加 入兩倍體積之絕對酒精，貯存於-20℃沉澱備用。取用時，以 13,200 rpm 於 4℃離 心 30 分鐘，倒除上清，以 200 μL 之 70%酒精洗鹽，再以 13,200 rpm 於 4℃離心 10 分鐘，pellet 以 200 μL 絕對酒精潤洗，以 13,200 rpm 於 4℃離心 10 分鐘，去除 上清，風乾後回溶於 1% diethyl pyrocarbonate (DEPC) 處理過之無菌水 (1% DEPC-treated water) 約 100-200 μL，取 2 μL 以微量分光光度計 (nanodrop) ACTGene ASP-3700 定量，並將 RNA 樣品稀釋至 1,000 ng･μL^-1，凍存於-80℃備用。

(四) DNase I 處理

取 60 μL RNA 樣品加入 27.5 μL 1% DEPC- treated water、10 μL 10 X buffer 及 2.5 μL DNase I (Qiagen RNase-Free DNase Set. Cat. no. 79254)，於 37℃反應 30 分 鐘；再加入 400 μL 1% DEPC- treated water，使總體積增加體積至 500 μL，再以 500 μL 之 CI 萃取，終止 DNase I 反應，取上清，加入 1/10 體積 5 M NaCl 及兩倍體積 絕對酒精，於-20℃沉澱備用。取用時以 13,200 rpm 於 4℃離心 30 分鐘，倒除上 清，以 200 μL 之 70%酒精潤洗，以 13,200 rpm 於 4℃離心 10 分鐘，再以絕對酒精 潤洗，以 13,200 rpm 於 4℃離心 10 分鐘，去除上清，風乾後以 40-50 μL 1% DEPC- treated water 回溶，取 2 μL 以微量分光光度計 ACTGene ASP-3700 定量，並將 RNA 樣品稀釋至 1,000 ng･μL^-1，凍存於-80℃備用。

(五) RNA 電泳品質檢測

取 4 μg RNA 樣品加至 2.5 μL 0.2 M pH 7.0 磷酸緩衝液 (phosphate buffer)、7.1 μL 7 M deionized glyoxyal、25 μL dimethyl sulfoxide (DMSO)，並以 1% DEPC-treated water 定量至 50 μL，於 50℃水浴 1 小時，再加入 10 μL RNA loading dye 混勻，並 取 35 μL 於 10 mM pH 7.0 磷酸緩衝液中電泳。取出膠體浸於 50 mM 氫氧化鈉 (sodium hydroxide, NaOH) 以 50 rpm 搖晃 30 分鐘、200 mM 醋酸鈉 (sodium acetate,

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NaOAc) 10 分鐘，在取出膠體浸於 TBE buffer 並以每 10 mL 加入 1μL 溴化乙錠 (Ethidium bromide, EtBr)，以 50 rpm 搖晃外染 10 分鐘，照膠判斷品質。

(六) 轉錄體分析流程

苦瓜總 RNA 由普渡大學 (Purdue University) 以 Illumina 平台進行 RNA 定序 後，獲得原始序列 (raw reads)，將定序品質不佳之序列移除 (filter) 後，混合兩組 序列並藉由 Trinity (Grabherr et al., 2010) 重新組裝 (de novo assembly) 成 contigs (圖 1)。組裝後的所有 contigs 均由 ContigViews (Liu et al., 2014) 平台以 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 與 The Arabidopsis thaliana Information Resource (TAIR ) 解 碼 序 列 (coding sequence, CDS) 資 料 庫 (TAIR 10) 及 European Molecular Biology Laboratory (EMBL) CDS 資料庫進行比對，預測開放解讀框架 (open reading frame, ORF) 並註解 (annotate) 之 (圖 1)。其中 contigs 能比對到 TAIR 或 EMBO CDS 資料庫所發表之序列，但無法完整界定其開放解讀框架，被歸類為 其他 (others)，其他以及未註解之 contigs 共同歸為目前未定義 (undefined) 之 contigs (圖 1)。各基因之表現量以 fragments per kilobase of transcript per million mapped reads (FPKM) 估計，並以 DESeq2 package 鑑別激勃素處理與未處理苦瓜 苗株之差異表現基因，以表現倍率大於二及 p-value ≤ 0.05 視為差異表現基因。

(七) 即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應

使用 BioLab cDNA kit 進行反轉錄反應，取 1 μg 總 RNA 加入 2 μL d(T)23VN，

並以 Nuclease-free water 定量至 8 μL，置於 65℃反應 5 分鐘，解開 RNA 之二級結 構，反應後立即置於冰上，加入 10 μL ProtoScript II Reaction Mix (2 X) 及 2 μL ProtoScrip II Enzyme Mix (10 X)，42℃反應 1 小時，接著於 80℃ 5 分鐘終止酵素 反應，將合成之 cDNA 稀釋 10 倍，凍存於-20℃備用。以 LabStar SYBR qPCR Kit 進行即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應偵測基因表現量，取 2 μL cDNA 加入 12.5 μL 2 X LabStar SYBR qPCR master mix、10 μM 引子對各 1.25 μL 及 8 μL RNase free water。以 Thermocycler^○R Real-time PCR machine 進行 qPCR，循環參數為：95℃ 3 分鐘；接著以 95℃ 5 秒、60℃ 20 秒、72℃ 8 秒，循環 40 次，最後再以 60℃至 95℃每 6 秒升溫 1℃，建立 melting curve 確認單一產物之合成。本論文所使用之

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引子列表於表 1 至表 3。苦瓜 Actin 基因以引子對 McACT-5 (5’-ACA TGC CAT TCT TCG ACT TGA CCT TGC TG-3’) 及 McACT-3 (5’-GCC CAT CAG GCA ACT CAT AGC TCT TTT CAA C-3’) 擴增 (amplified) 做為內部控制 (internal control)，並以 qPCRsoft 3.0 計算相對表現量。

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表 1. 用於即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應之苦瓜 ACC 合成酶基因專一性引子 Table 1. Primers used for real-time quantitative reverse transcription-PCR analysis of ACC synthase genes.

Gene

Product size (bp)

Tm

(℃) Sequence (5’3’)

McACS1 230 61.2

CCT TTT CAC CCC ACT CTC AAC CCT C

62.7

CGG TCG CCT CTC ACT TTT CCC ATG A

McACS8.1 163 61.0

CGT TTC TCC TCC CAA CTC CAT ACT ATC CAG

63.3

GCG TAG GTT TCG GGT TTG GGC TTC T

McACS8.2 168 61.6

TCG TTC CCA CCC CAT ACT ATC CAG G

60.9

CCC CTT TCA CTC TCA GTT TCA GCT CC

McACS9.1 203 61.6

CGG ACG AGA AGT TCA GGG GGA GTT A

60.6

CAC AAT CTT CCT CCA CAG CTC CAT CTC

McACS9.3 133 62.0

TAA GTG CCT GAA CAG CAA TGC GGG

61.8

GTT CAG TGC AGT GGC ATG AGG ATC C

McACS10 187 61.3

CCT TCG GAT GGA TTG GCG GAT TTG A

61.4

GGT AAT ATG GAG TAG GGA CGA GAA ACG CC

McACS11 160 62.8

TCT TTT CTG CTG GGT GGA CAT GAG GC

62.6

GGC AAA GCA CAT TCT GAA CCA ACC CG

McACS12 136 61.4

CCA ACT CCG ACT CCT CCT CCT CCA ATC

64.2

CGA GAA GAG AGC CGA ACC CGT CCA A

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表 2. 用於即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應之苦瓜 ACC 氧化酶基因專一性引子 Table 2. Primers used for real-time quantitative reverse transcription-PCR analysis of ACC oxidase genes.

Gene

Product size (bp)

Tm

(℃) Sequence (5’3’)

McACO1 191 63.7

GCT GAT GTG CGA GAA TCT GGG CCT G

62.8

CCG GAA CTT GGT CGT CTT GGA GGA G

McACO4.1 187 62.0

GCG GAA GAG TTG TTG GAG TTG CTG TG

62.6

AGA GAA GGA TGA TGC CAC CAG CGT C

McACO4.2 203 63.9

AAC TGG CGG AGC TGG TAC TGG ACT T

62.4

GTG GTC TTG GAA GAG GAG GAT GAG CC

McACO4.3 158 62.5

CAG TGG CCT ACA GCT CCT CAA AGA TGG

63.2

GGC CGG TTC CGT TCG CTT GAG TTA T

McACO5 240 61.9

AAC AAG AGC GGT GAG AAG CTG GAG A

63.3

GAA GAG CAA GAT GAC ACC GCC AGC A

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表 3. 用於即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應之苦瓜花性相關基因專一性引子 Table 3. Primers used for real-time quantitative reverse transcription-PCR analysis of flower sexuality related genes.

Gene

Product size (bp)

Tm

(℃) Sequence (5’3’)

McGID1B 208 62.5

GTC TCA GTT AAC TAC CGC CGA TCG CC

61.9

ATA CCT CGA CGT CTT CTT CAG CTG CC

McXERICO.1 249 62.1

CGT CTG AAG GTG TAC TGG GTG TGA TCC

62.1

GCC ATT TGC AGC TGT GAA CTT TGT CGT

McXERICO.2 139 62.0

CTA GTC TCC CAG CTC CAT CCG AAG G

61.1

TGG CGA TGA GAG ACG GAT TCC TAC A

McMYB33 233 60.0

AGC CGT TCC CAC CTT CTC TTA TCT C

61.0

GGC GAC CCA TAT GAC TGA GCA ACT T

McMYB24.1 137 61.8

GTG GAC GGT GGA GGA GGA CAT AAC T

61.4

GGA GAT AAT TCA GCC ACC GCA GAC G

McERAF16 131 60.9

TTC ATG GGT AGT ACA AGT CCG AGG AGT G

60.7

CTC TTC CAC AAT TCC CTC AAC CAC CA

McERAF17 234 62.6

CCT ACC AGT TCT CCA GCC ACG ACA TG

61.6

TCT CCT CAT CTC CTC CAT CTC ACT CTT CC

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肆、 結果

在文檔中 苦瓜花性之轉錄體分析 (頁 20-27)