試驗材料與設備

一、藻種

本研究的微藻藻株採用台灣已經有基本培養技術和應用的小球藻(Chlorella

vulgaris)，屬於綠球藻的一種，外觀為球型或略為橢圓形之單細胞藻類，擁有高

油酯特性。從行政院農業委員會水產試業所生物技術組餌料生物實驗室購買，並 且以 Basal(Sorokin and Krauss,1958)培養基進行培養，小球藻實驗於無菌操作台操 作，先把藻體放置於殺過菌的離心管內，並且使用離心機離心(500rpm，5℃，10mins) 去除上層液，再將離心管放置於 4℃冰箱中冷藏已做長期保種。

圖 3-1 光學顯微鏡下的小球藻 1(放大倍率 1000)

圖 3-2 光學顯微鏡下的小球藻 2(放大倍率 1000)

二、培養基成份

此基質來源是參考 Basal(Sorokin and Krauss,1958)，依照培養基組成表配置成 1L 標準培養基，使用 1N NaOH 和 HCL 調整 pH 值，以達到實驗所需之 pH 值，

配置之後在 121℃的高溫高壓滅菌釜滅菌 30 分鐘，未使用完培養基封口後放置於 4℃冰箱中保存。而培養基組成化學物質如表 3-1

表 3-1 小球藻培養基組成

三、實驗設備

本研究使用的儀器如表 3-2，鋼瓶中 CO₂的純度>99%，鋼瓶(空氣)為氮氣和氧 氣混合氣體，流量計控制空氣流量的為 30~300ppm，控制流量 CO₂的為 5~100ppm，

分光光度計使用 684nm。

成份 濃度(g/L)

KNO

₃

1.25

KH

₂

PO

₄

1.25

MgSO

₄

•7H

2

O 1.00

CaCl

₂

0.083

MnCl

₂

•4H

2

O 0.011

CuSO

₄

•5H

₂

O 0.015

EDTA-2Na 0.5

Na

₂

M

_O

O

₄

•2H

₂

O 0.01

H

₃

BO

₃

0.114

FeSO

₄

•7H

₂

O 0.049

ZnSO

₄

•7H

2

O 0.088

C

_O

(NO

₃

)

₂

•6H

₂

O 0.005

表 3-2 實驗設備

實驗設備 用途 型號 廠商

鋼瓶(空氣) 空氣來源 東洋氣體

鋼瓶(CO₂) CO₂來源 東洋氣體

恆溫培養箱 培養小球藻 上泰儀器

恆溫水槽 控制溫度 今日儀器

pH 測定儀 測量 pH 值 TS-2 今日儀器

無菌操作臺 實驗進行處 今日儀器

分光光度計 測量藻密度 DR5000 今日儀器

流量計 控制空氣流量 東洋氣體

流量計 控制 CO₂流量 東洋氣體

高壓高溫滅菌釜 去除培養基的細菌 EA652 今日儀器

離心機 去除上層液 5200 今日儀器

四

、

三角瓶震盪培養

本實驗將原始小球藻濃度 435mg/L、體積 50ml，以 250ml 三角錐型瓶置於恆 溫培養箱內 25℃、光照強度 1500Lux、全光照、震盪頻率 160rpm 培養，以新的 培養液(成分參考表 3-1)稀釋(1:4)分別培養置新的培養瓶中，當藻密度高時，透過 離心的方式以濃縮藻體，再加入新的培養液，維持藻種環境中豐富的營養源，並 且大量繁殖。

五、反應器設置

微藻光生物反應器為本研究重要設備之一，對於微藻的生產量與固碳效率有 很大的影響，本研究是使用生物反應槽來進行實驗，外膜透光率良好，為雙夾層 壓克力圓柱體，內層圓柱體用於小球藻培養體積 3.5L(直徑 6.5cm、高 110cm)，

反應裝置上方用橡木塞蓋封口，防止塵埃落入反應器內影響實驗進行，內外夾層 體積為 2.5L，由恆溫水槽的水在外部循環達到恆溫效果，底部可連結管線，讓氣 體從下方進入使藻體不會沉澱於底部，氣體的流量由氣體流量計控制 CO₂及空氣 氣體流量維持在一定比例，反應氣兩邊設置 T5 燈管光照強度 1500Lux，詳細如 圖 3-3 與圖 3-4。

恆溫水出口

T5 T5

燈管 燈管

流量計 氣體入口

恆溫水入口

恆溫水槽

圖 3-3 本研究微藻培養設備 CO₂ 鋼 瓶

空 氣 鋼 瓶

氣體混合

圖 3-4 連續曝氣培養反應槽

第二節 試驗流程

小球藻有最適生長條件，根據文獻的顯示微藻一般適合 20~30℃、pH7 左右，

而適合的碳源大多為 CO₂，少數則是 NaHCO₃和 Na₂CO₃。本試驗討不同碳源對 小球藻生長的影響，其中包含培養微藻常用的三種碳源: CO₂、NaHCO₃、Na₂CO₃ 探討小球藻最適合的碳源及其濃度，培養於不同的 pH 值、溫度、光照週期等條 件，找出小球藻最適生長環境條件與忍受度。

本試驗模擬煙道氣處理，主要是忍受低 pH 與高濃度及不穩定的 CO₂流量，

實際上煙道氣中除了有高濃度的 CO₂以外，還有高溫、酸性和 SO₂汙染氣體的存 在，探討以不同濃度在不同 pH 下小球藻能忍受的 SO₂極限。

一、三角瓶批次試驗(不同碳源比較、早晚曝氣試驗) 二、反應槽連續曝氣式培養

一、三角瓶批次試驗

批次式培養微藻因為擁有簡易與彈性的優點，可以快速培養微藻和一次進行 多組試驗。本試驗使用三角瓶(250ml)封口於恆溫震盪培養箱培養，震盪頻率皆為 rpm160。研究流程圖如圖 3-3，試驗有:

(一)小球藻檢量線製作。

(二)不同 mol 濃度的 NaHCO₃對小球藻生長的影響。

(三)不同 mol 濃度的 Na₂CO₃對小球藻生長的影響。

(四)不同濃度 CO₂對小球藻生長的影響。

(五)不同碳源對小球藻生長的探討。

(六)不同 pH 值對小球藻生長的影響 (七)不同溫度對小球藻生長的探討 (八)不同照光時間對小球藻生長的探討 (九)小球藻對 SO₂的忍受力

圖 3-5 批次培養研究流程圖 文獻收集

確認研究目的

小球藻前培養

製作藻密度減量線

以不同碳源培養小球藻

NaHCO₃濃度:10、30、40、50、60、80、100、150mmol/L Na₂CO₃濃度:10、30、40、50、60、80、100、150mmol/L

CO₂濃度:10、15、25、35、45%

找出最適合碳源與各環境因子最適生長條件和忍受極限 不同環境因子培養小球藻

溫度:15、20、25、30、35、40℃

pH :3、4、5、6、7、8、9、10

(光照比:24 小時照光:0 小時不照光、16 小時照光:8 小時不照光、12 小時照光:12 小時不照光)

探討小球藻對 SO₂的忍受力

(一)小球藻檢量線製作。

本研究所使用的實驗藻種為小球藻，透過生長曲線測試的關係圖，當成以後 實驗與研究的參考圖。將之前培養的小球藻溶液加入 1L 的光反應器中來進行藻 密度的測量。本研究方法可以簡單且有效率得知微藻之藻密度大小，先使用分光 光度計測試藻密度的吸收波長，在取一定體積的微藻溶液先以濾紙進行過濾，再 由烘乾機進行烘乾後秤重，進而知道微藻液內有藻體有多少重量，利用藻重和藻 液吸光度製作檢量線，實驗步驟如下:

1.先將濾紙用去離子水過濾後，放置於鋁盤中，在定溫 120℃的烘乾箱持續烘 乾 12 小時，將濾紙取出後放入乾燥箱靜置 2 個小時，再使用電子天秤測量 濾紙重，測量 3 次取其平均值，當成濾紙乾重。

2.將一瓶藻液用去離子水稀釋 6 個倍數，再分別以分光光度計測量個別的吸光 度(使用 684nm)，再將相同稀釋倍數的藻液用離心機去除上層液，再重複步驟 一烘乾濾紙進行過濾。

3.藻液過濾完後使用去離子水清洗濾紙上面的雜質，以增加藻體重量的準確性 ，之後將濾紙重複步驟一，就可以得到藻體過濾後的重量。

4.將藻體過濾後的重量減去濾紙的乾重，和相同稀釋倍數所得到的吸光 值，做出一條線，此線為吸光度及藻體乾重之檢量線。

5.透過檢量線算出本藻體乾重方程式：y=ax+b，輸入公式計算 R²(判定係數)，

若 R²達到 0.995 以上為有效檢量線。

(二)不同 mol 濃度的 NaHCO₃對小球藻生長的影響

本實驗使用 NaHCO₃為小球藻的碳源，在其餘環境條件都一樣的情況下，以 不同濃度的 NaHCO₃來培養小球藻，了解到用不同濃度的 NaHCO₃做為碳源下小 球藻的生長狀況，並找出哪個濃度的 NaHCO₃最適合小球藻生長。實驗步驟如下:

1.將相同濃度的藻液平均分配成 8 瓶，分別加入相同體積的培養液(跟藻液體積 比 1:4)。

2.加入不同量的 NaHCO₃使培養液裡的 NaHCO₃濃度分別達到 10、30、40、

50、60、80、100、150mmol，再以 1N NaOH 和 HCl 將每瓶的 pH 值 控制為 7。

3.放於恆溫培養箱以溫度 25℃、光照強度 1500Lux、24 小時照光、震盪頻率 rpm160 培養。

4.每天早上調整 pH 值，並於晚上測量吸光值並換算藻液濃度記錄，直到 小球藻靜止生長一段時間。

5.比較小球藻於不同濃度的 NaHCO₃生長下，最多生長量(X1-X0)、最快生 長速率(X1-X0/T1-T0)和每克的 NaHCO₃可以產生多少小球藻(X1-X0/加 入 NaHCO₃克數)分別是哪個濃度，找出最適合培養小球藻的 NaHCO₃ 莫耳濃度。

(三)不同 mol 濃度的 Na₂CO₃對小球藻生長的影響

本實驗使用 Na₂CO₃為小球藻的碳源，在其餘環境條件都一樣的情況下，以 不同濃度的 Na₂CO₃來培養小球藻，了解到用不同濃度的 Na₂CO₃做為碳源下小球 藻的生長狀況，並找出哪個濃度的 NaHCO₃最適合小球藻生長。實驗步驟如下:

1.將相同濃度的藻液平均分配成 8 瓶，分別加入相同體積的培養液(跟藻 液體積比 1:4)。

2.加入不同量的 Na₂CO₃使培養液裡的 Na₂CO₃濃度分別達到 10、30、40、

50、 60、80、100、150mmol，再以 1N NaOH 和 HCl 將每瓶的 pH 值 控制為 7。

3.放於恆溫培養箱以溫度 25℃、光照強度 1500Lux、24 小時照光、震盪頻率 rpm160 培養。

4.每天早上調整 pH 值，並於晚上測量吸光值並換算藻液濃度記錄，直到 小球藻靜止生長一段時間。

5.比較小球藻於不同濃度的 Na₂CO₃生長下，最多生長量(X1-X0)、最快生 長速率(X1-X0/T1-T0)和每克的 Na₂CO₃可以產生多少小球藻(X1-X0/加 入 Na₂CO₃ 克數)分別是哪個濃度，找出最適合培養小球藻的 Na₂CO₃

莫耳濃度。

(四)不同濃度 CO₂對小球藻生長的影響

本實驗使用 CO₂為小球藻的碳源，在其餘環境條件都一樣的情況下，以 不同濃度的 CO₂來培養小球藻，了解到用不同濃度的 CO₂做為碳源下小球藻的生 長狀況，並找出哪個濃度的 CO₂ 最適合小球藻生長以及小球藻可以忍受的 CO₂ 濃度極限為何。實驗步驟如下:

1.將相同濃度的藻液平均分配成 8 瓶，分別加入相同體積的培養液(跟藻 液體積比 1:4) ，再以 1N NaOH 和 HCl 將每瓶的 pH 值控制為 7。

2.每天早晚通入不同濃度的 CO₂氣體(10、15、20、25、30、35、40、45%)，通 氣量為 50mL/min，每次 10min。

3.放於恆溫培養箱以溫度 25℃、光照強度 1500Lux、24 小時照光、震盪頻率 rpm160 培養。

4.每天早上調整 pH 值，並於晚上測量吸光值並換算藻液濃度記錄，直到 小球藻靜止生長一段時間。

5.比較小球藻於不同濃度的 CO₂生長下，最多生長量(X1-X0)、最快生長速 率(X1-X0/T1-T0)分別是哪個濃度，找出最適合培養小球藻的 CO₂莫耳濃 度和小球藻可以忍受到多少濃度的 CO₂。

(五)不同碳源對小球藻生長的探討

本實驗比較常用於培養微藻的三種碳源(CO₂、NaHCO₃、Na₂CO₃)分別培 養小球藻，在所有環境條件都一樣的情況下，何者最適合與最不適合用於培養小 球藻，實驗步驟如下:

1.配置三瓶小球藻濃度起始濃度為 200mg/L，體積為 200mL 且 pH 值 7 放 於 250mL 的三角錐型瓶中。

2.從上述二、三、四實驗知道三種碳源最適合的濃度。

3.將 NaHCO₃、Na₂CO₃最適合的 mmol 濃度分別加入兩瓶三角錐型瓶，另一瓶 三角瓶於早晚曝氣最適 CO₂濃度(50mL/min，持續 10 分鐘)，並於恆溫培養 箱(溫度 25℃、光照強度 1500Lux、24 小時照光)培養。

4.每天早上調整 pH 值，並於每天測量一次吸光值並紀錄藻液濃度，直

4.每天早上調整 pH 值，並於每天測量一次吸光值並紀錄藻液濃度，直

在文檔中 小球藻於煙道氣最適生長條件之探討 (頁 37-0)