一、 實驗試藥 andrographolide (3-(2-(decahydro-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2-methylene-1-napthalenyl)ethyli dene)dihydro-4-hydroxy-2(3H)-furanone)
二、 實驗動物 雄性大鼠 (Wistar品系，來自樂斯科生物科技 公司)
三、 實驗細胞 大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(源自Wistar品 系的雄性大鼠)
四、實驗藥品
1. 下列藥品為Amersham公司之產品:
protein molecular weight marker (RPN 756) protein molecular weight marker (RPN 800) triton X-100
2. 下列藥品為Amersham Life Science公司之產品:
sodium dodecylsulfate (SDS)
tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris-base)、
3. 下列藥品為Bio-Rad公司之產品:
ammonium persulsate (APS)
protein assay dye reagent concentrate 4. 下列藥品為Gibco BRL公司之產品:
amphotericin B (Fungizone)
dubecco’smodified eaglemedium (DMEM) porcine elastase
fetal bovine serum (FBS)
hanks balanced salt solution (HBSS) penicillin/ streptomycin/ L-glutamine sodium pyruvate
tryphane blue stain trypsin-EDTA
5. 下列藥品為Invitrogen公司之產品:
Lipofectamine TM2000
6. 下列藥品為Mallinckrodt Baker公司之產品:
acetic acid (glacial) calcium chloride ethanol
HEPES methanol
sodium hydrogen carbonate
7. 下列藥品為MDBio Inc.公司之產品:
40% acrylamide/Bis solution DNA markers
TBE solution 5X
8. 下列藥品為Peprotech Inc.公司之產品:
recombinant rat interferon-
9. 下列藥品為Pharmacia biotech公司之產品:
glycerol
N, N, N, N,-tetramethyllethylethylenediamine (TEMED) polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20)
10.下列藥品為Sigma 公司之產品:
aprotinin
albumin, human
bovine serum albumin (BSA) mercaptoethanol
coomassie brilliant blue collagenase Ⅰ
collagenase Ⅱ
dimethyl sulfoxide (DMSO) dithiothreitol (DTT)
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA．2Na) leupetin
tetrazolium dye 3 (4, 5 dimethylthiazol 2 yl) 2, 5 -diphenyltetrazolium bromide (MTT)
peptastatin
p-phenlenediamine
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) sodium orthovanadate
sodium pyrophosphate
11.下列藥品為Wako公司之產品:
chloroform
paraformaldehyde
12.下列藥品為其他公司之產品:
2-propanol (Showa)
EtBr: ethidium bromide (BDH) gelatin (Kanto, Japan)
sodium fluoride (Fluka)
五、 套組試劑 (Kit)
enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection reagent
NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (PIERCE, USA)
Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit (Cayman CHEMICAL, USA)
SUPERSCRIPT One-step RT-PCR with PLATIUM Taq (Invitrogen, USA)
Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)
六、 抗體 (Antibody)
-tubulin mouse monoclonal antibody (Neomarkers, USA)
iNOS rabbit monoclonal antibody (Santa cruz, USA)
IBrabbit monoclonal antibody (Cell Signaling, USA)
MMP-9 mouse monoclonal antibody (Neomarkers, USA)
NF-B p65 mouse monoclonal antibody (Santa cruz, USA)
phospho-NF-B p65 (Ser 536) rabbit polyclonal antibody (Cell signaling, USA)
phospho-IB-(Ser32/36) mouse monoclonal antibody (Cell Signaling, USA)
Lamin B1 (H-90) rabbit polyclonal antibody (Santa cruz, USA)
anti-mouse Ig, HRP linked whole antibody (Amersham, USA)
anti-rabbit Ig, HRP linked whole antibody (Amersham, USA)
七、 引子(Primer)
購自生工(MDBio Inc.)公司 iNOS sense:
5’-ACCTACTTCCTGGACATCAC-3’
iNOS antisense:
5’-ACCCAAACACCAAGGTCA TG-3’
GAPDH sense:
5’-GCCGCCTGGTCACCAGGGCTG-3’
GAPDH antisense:
5’-ATGGACTGTGGTCATGAGCCC-3’
Consensus NF-B promoter:
5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3’
八、 耗材
Biodyne® B Precut Nylon Membranes (PIERCE, USA)
blotting paper (Amersham, USA)
cassette (Okamoto, Japan)
developer and replenisher (Kodak, USA)
fixer and replenisher (Kodak, USA)
polyvinylidene fluoride microporous membrane (PVDF;
Hybond-P, Amersham, USA)
scientific imaging film (Kodak, USA)
10 cm dish、6 cm dish、6 well plates and 24 well plates、等 細胞培養耗材(Costar, USA or Orange, Europe)
15 ml 離心管、50 ml 離心管、eppendorf、96 well-ELISA plates、cuvette 及 0.2 ml 薄壁微量 PCR 管等實驗耗材 (Corning , USA)
18 G 針頭、5 ml 針筒、1 ml 針筒附針頭(TERUMO, Japan)
0.22 m filter Millipore Express PLUS (PES) (Millipore, USA)
mini-osmotic pump model 2002(alzet○R, USA)
fogarty arterial embilectomy catheter 2F (Edward Lifesciences, USA)
nylon suture (UNIK, Taiwan)
九、 實驗方法
1. 大鼠血管平滑肌細胞初代培養
將 male Wistar rat (250-300 g)，以 choloral hydrate (4 mg/kg) 麻醉並斷頸後，從頸部放血，迅速剪開胸腔，取出胸主動脈 (thoracic aorta)放入 HBSS 溶液中(每毫升含有 penicillin 50g，
streptozotocin 50 g，neomycin 100 g，amphotericin B 0.25 g，
不含 CaCl2和 MgCl2)，並以 HBSS 清洗血管四次後以小剪清除 血管表面結締組織，放入裝有 2-3 ml collagenase type I (2 mg/ml) 的插管離心管中。灌入 O2 於 37 ° C digest 30 分鐘後去除 adventia tissue，將血管剪成四段置於加入 10% FBS 的 DMEM 培養液中 overnight。隔天將血管剪碎，放入加入 collagenase type II (2 mg/ml)和 porcine elastase (1 mg/ml) 各 1 ml 的溶液中，灌 入 O2於 37 ° C digest 一小時，之後加入 10% FBS 的 DMEM 終止反應再以 18G 針頭以及 5 ml 針筒吸取細胞液通過篩網去 除碎屑離心十分鐘後，吸掉上清液，移置 35 mm 培養皿。以 DMEM 為培養液，外加 10 % FBS、4 mM glutamine、100 IU/ml penicillin、100 g/ml streptomycin 和 0.25 g/ml amphotericin B 置於 37 ° C 恆溫箱(incubator)通以氣體(95 % air- 5 % CO2) ，隔 天換新鮮培養液，待長滿後移至 10 cm 培養皿，之後每兩天換 一次培養液，約四天後長至 90 % confluent，即可再繼代培養或 用來作實驗。
2. 大鼠血管平滑肌細胞繼代培養
大鼠血管平滑肌細胞培養於 10 cm 培養皿中待細胞長滿 後，移去培養液，用 PBS 清洗細胞後移去 PBS，加入 1.5 ml 胰蛋白酶( 0.05 % trypsin - 0.53 mM EDTA‧4Na )於 37° C 下 作用 3 分鐘，吸除酵素液，加入 10 ml DMEM 沖下細胞，以轉 速 850 rpm (140 x g)，25 ° C 離心七分鐘，吸除上清液後加入適 量 10 % FBS/ DMEM，以 1: 3 稀釋比例繼代培養，由第四代到 第八代之血管平滑肌細胞供作實驗用途。
3. 血管平滑肌細胞存活率之測定
利 用 MTT 試 劑 來 測 定 血 管 平 滑 肌 細 胞 的 存 活 率 (viability)。將正常培養的血管平滑肌細胞取下，將定量的細胞 (1×105cells/ml)種於 24 wells 的培養盤中，以含有 10 % FBS 的 DMEM 培養液加以培養，接著置入培養箱中，讓細胞生長 24 小時後，將培養液換成不含 FBS 的 DMEM 培養液，分別給以 不同濃度的 andrographolide 20 分鐘後，再加入 LPS (50 g/ml) 和 IFN-(100 unit/ml) ，置入培養箱 24 小時後，加入 0.5 mg/ml MTT，於 37° C 作用 2 小時，再加入 100% dimethyl sulfoxide
(DMSO) 300l 到每個 well 中，稍微混合後，於室溫下避光輕 搖 20 分鐘，待 well 內殘餘細胞溶解完全後，再從每 well 取出 200l置入 96 wells ELISA plate，接著用酵素免疫分析儀(MRX microplate reader, USA)以 550 nm 之波長偵測每一個 well 之吸 光值。此實驗目的在測試 andrographolide 是否能影響大鼠平滑 肌細胞的存活率，利用細胞中粒線體酵素將 MTT 試劑還原成 formazan 紫色結晶，再用 DMSO 將結晶溶解，即藉由細胞之代 謝活性來作為細胞是否存活之依據，而測得之吸光值即等於相 對的細胞數目，故細胞數越多其吸光值越高。而存活百分率之 運算如下:
4. 一氧化氮含量測定
吸取實驗處理後的細胞上清液 80l置於 96 well plate 中，
分別加入 10 lcofactor 以及 10 lreductase 於每 well 中，於室 溫下避光作用一小時後使培養液中 nitrate 還原成為 nitrite。之 後加入 50 l Griess reagent A (含 sulfanilamide) 以及 50 l Griess reagent B (含 N-(1-Naphthyl)ethylenediamine) 於室溫下 作用 10 分鐘後，產生 Azo product 後利用 microplate reader 以
未加藥處理之吸光值
× 100%
加藥處理之吸光值
550 nm 波長測量其吸光值。
5. 細胞內蛋白質分離與定量(Intracelluar protein isolation and quantity)
將實驗處理後之細胞，以外加 protease inhibitor (10 g/ml aprotein 、 1 mM PMSF 和 10 g/ml leupeptin) 及 2 mM dithiothreitol (DTT) 之 lysis buffer (50 mM HEPES、5 mM EDTA·2 Na 、50 mM NaCl 與 1% Triton X-100)將細胞溶破，
4℃下靜置 30 分鐘，每 10 分鐘 vortex 15 秒，隨後以 4℃轉速 12000 g 離心 20 分鐘，取上清液，定量蛋白質。若進行有關 IB-、MAPKs 等磷酸化蛋白質之測定時，其 lysis buffer 則必 須再多加入 phosphatase inhibitor (10 mM sodium fluoride、1 mM sodium orthoranadate 和 5 mM sodium pyrophosphate)。蛋白質定 量時，先取 2 mg/ml 之 albumin bovine (BSA)以二次水分別稀釋 成濃度為 5g/ml、10 g/ml、15 g/ml、20 g/ml、25 g/ml，
做為 standard。並取蛋白質樣品 5l與二次水 395 l充分混合。
靜 置 十 分 鐘 後 ， 連 同 標 準 品 全 數 加 入 100 l dye reagent concentrate (Bio-Rad)充分混合，再靜置十分鐘後，取 200 l至 96 well-ELISA plates ， 用 酵 素 免 疫 分 析 儀 (MRX microplate
reader, USA)以 550 nm 之波長偵測每一個 well 之吸光值。所得 之吸光值以線性迴歸方式換算成濃度，測定後，樣品分裝保存 於-80℃以備用。
6. 西方點墨法 (Western blotting)
將實驗處理後取得之以定量之細胞內蛋白質成分以5：1的 體積比例加入6 × sample loading dye (350 mM Tris-base、30 % glycerol、350 mM SDS、175M bromophenol blue、600 mM DTT 調為pH 6.8)充分混勻，並在95 °C加熱約5分鐘，使蛋白質 denature後，快速置於冰上至少5分鐘，以避免回溫過程中酵素 影響蛋白質表現，最後在4 °C下以轉速2000 g離心5分鐘後備 用 。 再 以 不 同 百 分 比 的 SDS gel 於 running buffer (25 mM Tris-base, 192 mM glycerol, 0.1 % SDS, pH 8.3)下，以120 V/80 mA 進 行 電 泳 分 離 。 隨 後 將 膠 片 置 於 transfer buffer (1 M Tris-base, 20 % methanol, 150 mM glycine, pH 8.3)下，以40 V/300 mA 進行電泳轉漬3小時，使膠片上之蛋白質轉移至 polyvinylidene fluoride microporous membrane (PVDF;
Hybond-P)表面，隨後將轉漬膜浸潤在4 °C的blocking buffer (5
% non-fat milk, 10 mM Tris-base, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween 20,
pH 7.5)中，搖晃40分鐘後，以TBST (10 mM Tris-base, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween 20, pH 7.5 ) 清洗轉漬膜四次，每次7分鐘，
之後加入一級抗體(primary antibody)，於室溫下搖晃作用2小 時。再用TBST清洗轉漬膜四次，每次7分鐘，之後再加入標記 有 horseradish peroxidase (HRP) 的 二 級 抗 體 (secondary antibody)，於室溫下反應1小時，再以TBST清洗轉漬膜四次，
每次7分鐘。最後使用冷光反應劑enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection reagent 使底片感光，以偵測蛋 白質的表現情形。最後將成像後的底片掃描輸入電腦，以影像 分析軟體(Bio-1D version 99)作分析處理。
7. 電泳酵素分析法 (SDS-PAGE Zymography)
在冰上收集實驗處理後之細胞培養液進行實驗。將實驗處 理後取得之細胞培養液以1：2的體積比例加入sample loading dye (500 mM Tris-HCl、25 % glycerol、10 % SDS和0.32 % bromophenol blue 調 成 pH 6.8) 充 分 混 勻 ， 再 以 10 % polyacrylamide gel (含1 % gelatin)於running buffer (25 mM Tris-base、192 mM glycerol和0.1 % SDS調成pH 8.3)下，以125 V/40 mA進行電泳分離。分離後之膠片再以2.5 % Triton X-100
於室 溫下洗滌 兩次後 ，把膠片 置於 reacting buffer (50 mM Tris-base、200 mM NaCl、5 mM CaCl2和0.02 % Brij 35調成pH 7.5)中，在37℃的恆溫箱內反應72小時，之後再以fixing solution (7 % acetic acid和40 % methanol)固定蛋白質於膠片上30分鐘。
接著以Brilliant Blue G-Colloidal染色使膠片呈色均勻，並以 destain solution (10 % acetic acid與25 % methanol)做去色處理，
使結果達到最佳化。最後將膠片置於影像分析系統 (Vilber Lourmat, France)，以CCD拍攝並將圖檔存入磁片中，再將磁片 所存之影像於電腦中以影像分析軟體(Bio-1D version 99)做分 析處理。以resting group亮度當作1，其餘band之亮度以其相對 倍數表現之。
8. RNA 萃取與定量(RNA extract and quantity )
將實驗處理過後的細胞吸除上清液，接著加入 1 ml TRIzol reagent (total RNA isolation reagent, Invitrogen)，用 scraper 將細 胞刮下後快速移至 1.5 ml eppendorf 中，室溫下靜置 5 分鐘待細 胞溶解後，以 4℃轉速 12000 g 離心 10 分鐘。離心後，取出 900
l 上清液到新的 eppendorf，靜置 5 分鐘後，每管加入 200 l
chloroform，劇烈搖盪 15 秒後置於室溫下 3 分鐘。接下來在 4℃
下轉速 10500 g 離心 15 分鐘。離心後，小心吸取上清液至新的 eppendof 中，並加入 0.5 ml 的 isopropyl alcohol 於室溫下靜置 10 分鐘，使 RNA 析出，再以 4℃轉速 10500g 離心 10 分鐘。
離心後，將上清液去除，留住管底的凝膠樣沉澱物(gel-like pellet)。再加入 1 ml 75 %之酒精(以 0.01 % DEPC-H2O 及 99.5 % 無水酒精配製)清洗凝膠樣沉澱物。將每管輕微振盪後，再以 4℃轉速 7100 g 離心 5 分鐘。離心後立刻風乾凝膠樣沉澱物 30 分鐘，再以 70 lDEPC-H2O 溶解 RNA。取少量至 microcuvette 中，用 GeneQuant Pro 分析儀以 260/280 nm 之波長來偵測樣品 之純度及濃度。測定後將 RNA 溶液分裝置於-80℃中保存備 用。保存時間不超過三天。
9. 反 轉 錄 - 聚 合 酵 素 連 鎖 反 應 (Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)
利用 Super Script One-Step RT-PCR with PLATINUN Taq (Invitrogen)之套組，依照說明書指示進行 RT-PCR 實驗。
將說明書所列之 reagents 依序加入至 0.2 ml 已滅過菌之
pre-chilled 薄壁微量 PCR 反應管，過程均在冰上操作，輕微 vortex 混合均勻，然後在冰上輕敲，使 vortex 時沾於管壁上的 sample 沉降，最後置入 PCR 反應器(GeneAmpR PCR System 2400)中依照下列的反應條件來進行 RT-PCR：
(1) cDNA 的反轉錄合成
iNOS : 50℃，30 分鐘 94℃，2 分鐘
GAPDH : 50℃，30 分鐘 94℃，2 分鐘 (2) PCR amplification (放大)
iNOS: 94℃，15 秒 → 55℃，30 秒 → 72℃，1 分鐘 總反應 30 cycles
GAPDH : 94℃，15 秒 → 62℃，30 秒 → 72℃，1 分鐘 總反應 30 cycles
(3) Final extension
iNOS、GAPDH 皆以相同的條件。
72℃，5 分鐘 → 讓最後一個 cycle 的 cDNA 完成 降到 4℃ → 避免 cDNA 降解
最後將 cDNA 存放於-80℃直到用於實驗，保存時間不超
過一個禮拜。
10. 膠體電泳(Agarose gel electrophoresis)
實驗處理後取得放大之 cDNA 產物以 4 : 1 的體積比例加入 5 倍 sample loading dye (25 % glycerol 和 0.25 % bromophenol blue)充分混合均勻，將每一管 sample loading 在 1.5 % Agarose gel (含 0.5 g/ml ethidium bromide，具螢光染色 cDNA 之能力)，
於 0.5 % TBE buffer 下，以 150 V/33 mA 條件進行電泳分離。
GAPDH 與 iNOS 之 mRNA 經由反轉錄後之 cDNA 分別為 598 bp 與 552 bp。最後將膠片置於影像分析系統(Vilber Lourmat，
France)，以 CCD 拍攝並將圖檔存入磁片中，再將磁片所存之 影像於電腦中以影像分析軟體(Bio-1D version 99)進行影像分 析處理。iNOS 之 cDNA 相對含量需先以 GAPDH 做適當校正，
實驗結果的表示以相對此數值表示。
11. 細 胞 核 內 及 核 外 蛋 白 質 分 離 與 定 量 (Nuclear extracts preparation，NE-PERTM)
將定量的大鼠血管平滑肌細胞種植於 10 cm dish 中直到