過去的研究顯示在進行 RZ-mRNA 下游 BZLF1 ORF 的轉譯之前，核醣體必 須先結合並且掃描 IR 序列(Chang and Liu, 2001)，說明轉譯起始因子應該會參與 這個過程。由於轉譯起始因子 eIF4A 跟 eIF4G 對於 40S 核醣體能否結合上 mRNA 並起始轉譯是非常重要的(Jackson et al., 2010; Lomakin et al., 2000)，而 eIF4B 也 能與 40S 核醣體中的 18S rRNA 結合，進而促使 43S PIC 結合至 mRNA 上(Methot et al., 1996a; Methot et al., 1996b; Walker et al., 2013)。因此本研究利用 in vitro 的 結合測試來探討這幾種轉譯起始因子與 IR 序列中的 region I 的結合關係。
本研究將質體 pCMV 或 pCMV-Rta 轉染至 293T 細胞中，接著收集 whole cell lysates (WCLs)，再各別與 5'-biotin 標記的 MS2 或是 region I RNA 序列進行結合，
以 in vitro RNA-protein pull-down 的方式分離蛋白質，再以抗 Rta、抗 RPS6、抗 eIF4G、抗 eIF4A 以及抗 eIF4B 抗體進行西方墨點法，分析 40S 核醣體及轉譯起 始因子與 region I 的結合關係。結果顯示 Rta、RPS6、eIF4G、eIF4A 和 eIF4B 皆 不易與 MS2 序列結合(圖 3-5, lanes 4、5)；而 Rta、RPS6、eIF4G 及 eIF4A 皆能 與 region I 序列結合(圖 3-5, lanes 6、7)，eIF4B 則無法觀察到顯著的結合現象。
此外，在此實驗條件下，Rta 的表現不會顯著影響 RPS6 和轉譯起始因子對 region I RNA probe 的結合能力(圖 3-5, lanes 6、7)。
討論
EBV 會表現兩個極早期蛋白質 Rta 和 Zta，此兩種蛋白質對於病毒能否順利 進入溶裂期扮演重要的角色。其中 Rta 可以藉由調控 BRLF1-BZLF1 雙基因 mRNA (RZ-mRNA)下游開放閱讀框 BZLF1 的轉譯來幫助 Zta 的表現(Chang et al., 1998)，然而，Rta 參與轉譯調控的確切機制目前尚不清楚。過去研究發現 RZ-mRNA 中間序列(IR)上特定的區域-region I 對於下游 BZLF1 基因的轉譯極為重 要，並且推測 Rta 能幫助核醣體辨認 IR 序列中的 region I，並繼續掃描 RZ-mRNA，
直到辨識到 BZLF1 的轉譯起始碼並開始轉譯(Chang and Liu, 2001)。此外，由核 苷酸序列比對的結果我們發現 18S rRNA 中 helix 36 的區域跟 region I 的序列具 有互補性，而此種序列互補關係對 BZLF1 ORF 的轉譯是重要的(Chang and Liu, 2001)，因此推測 helix 36 可能是 Rta 與 18S rRNA 結合的區域。本篇研究即是針 對 Rta 與 18S rRNA 的 helix 36 以及 region I 序列的結合關係進行探討。首先我 以 in vitro RNA-protein pull-down 的方式發現 Rta 能與 18S rRNA helix 36 的序列 結合，且此結合可能取決於 helix 36 形成的雙股 RNA 結構(圖 3-1)。接著，蔗糖 密度梯度分層的結果顯示 Rta 與各個核醣體次單元存在同樣的 fractions 中(圖 3-2、3-3)；此外，進一步的 in vitro 結合測試發現 Rta 跟 RPS6 皆能與 region I 的 RNA 片段結合(圖 3-4)。最後，我發現 eIF4A、eIF4G 等轉譯起始因子也會與 region I 序列結合，然而 Rta 的表現並不會顯著地影響 RPS6、eIF4A、eIF4G 對 region I 序列的結合(圖 3-5)。綜上所述，本研究為 Rta 如何參與 BZLF1 基因的轉譯調 控提供進一步的了解。
1. Rta 與 18S rRNA 之結合
過去研究發現 Rta 可能會幫助 40S 核醣體的轉移並結合於 IR 序列的 region I，使核醣體能夠繼續轉譯 BZLF1 ORF (Chang et al., 1998; Chang and Liu, 2001)，
且 region I 序列與 18S rRNA 的 helix 36 其中一股的序列有互補性(附錄 6B)，而 此種序列互補關係對 BZLF1 ORF 的轉譯極為重要(Chang and Liu, 2001)。而部分 的研究也指出真核生物的轉譯機制中 rRNA 與 mRNA 結合的現象雖然不像原核 能是一個 RNA-binding protein，能夠結合 18S rRNA，主要的結合位是 helix 36，
且其對於 helix 36 的結合可能較偏好雙股的 RNA 結構，而非單獨的其中一股。
然而，本實驗在做 RNA-protein 結合前雖然有先將 1324 與 1483 兩條 RNA 序列 進行 annealing，但是並沒有證明這兩條 RNA probes 確實有形成雙股 RNA 結構 (圖 3-2B, lane 6)，未來可以利用電泳分析、測試吸光值或是 RNase A digestion 的 方式證明其為 dsRNA。此外，未來在進行此種 in vitro RNA-protein pull-down 的 實驗時，需要再加上一個 RNA 的控制組，以確定每一管反應中加入的 RNA probe 的量是相同的，可以在進行西方墨點法之前，先將每管樣品取出三分之一，以定 量即時聚合酶連鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 qPCR) 的方式測量樣品中的 RNA probes 的量，調整每管樣品使 RNA 的量相同，達到定 量的效果。
由於 Rta 可能會幫助 40S 核醣體結合至 mRNA 上，因此本研究也利用 The European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)網站的 Clustal Omega、EMBOSS
Needle、EMBOSS Water 等序列比對程式(Li et al., 2015; Sievers et al., 2011)分析 白質結構方面去比較 Rta 與轉譯起始因子或其他 RNA-binding protein 的相似性，
雖然目前 Rta 的蛋白質結構還沒有被解出來，但是已知 Rta 的 N 端是 DNA-binding doman，而研究指出許多轉錄因子的 DNA-binding doman 同時也具有結合 RNA 的能力(Cassiday and Maher, 2002)，因此，Rta 與 RNA 結合的功能區以及結合的 條件是未來可以探討的方向。此外，真核生物的轉譯起始因子 eIF4B 也具有結合 18S rRNA 並幫助 40S 核醣體與 mRNA 結合的功能(Methot et al., 1996a; Walker et al., 2013)，其主要是利用 N 端的 RNA recognition motif (RRM) domain 和 DRYG repeats 結合 40S 核醣體和 18S rRNA (Methot et al., 1996a; Naranda et al., 1994)；
且研究指出 18S rRNA 中的 helix 34 對於 eIF4B 的結合很重要(Walker et al., 2013)。
結合，因此我利用含有 Rta 的 293TetER 細胞質萃取液進行 10-45%之蔗糖密度梯 糖體的 fractions 中也可以觀察到 Rta 的量有部分地增加(圖 3-2B, lanes 18-23)，說 明 Rta 可能不只是與 40S 核醣體結合來影響轉譯的起始，還可能與 60S 核醣體結 期的研究發現 Rta 能提升 cap-dependent 以及 cap-independent 轉譯的效率(未發 表)，但是由測量 OD254值所繪製的曲線圖分析，發現 Rta 沒有顯著地影響核醣體
次單元在各 fraction 中的含量(3-3A、B)，只有西方墨點法的結果顯示含有 Rta 的
Tissieres and Watson, 1958)，因此我們可以利用不含鎂離子並且加入 EDTA 的溶 液處理細胞裂解液以分離 40S 跟 60S 核醣體；另外，也有研究利用加入 puromycin
RPS6 對於 region I 序列有較專一性的結合能力，然而要確定 region I 是否為 IR 序列上唯一的核醣體結合位，還需要再對 IR 序列做不同區域的刪除並進行結合 分析，或是利用不同的片段與 region I 競爭結合位等方式來驗證。此外，會了確 定 40S 核醣體與 region I 真的有結合，而不是只有 RPS6 單獨的蛋白質跟 region I 結合，未來可以使用較多種 40S 核醣體的組成蛋白質進行辨識，如 RPS3、RPS10、
RPS11 等都是 40S 的標誌蛋白質；或是在 RNA-protein 結合之後，利用質譜儀 (mass spectrometry)分析 region I RNA 序列上結合的各種蛋白質。本研究還有做 額外加入 293T 細胞質裂解液於細菌表現的 His-Rta 中的組別，結果發現 His-Rta 與 region I 的結合量顯著增加(圖 3-4A)，說明細胞表現的蛋白質可能與 His-Rta 接觸，加強其與 region I 結合的能力，至於是何種蛋白質的作用，目前尚不清楚，
這是未來可以研究的方向。另外，未來也可以使用 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)的方式進行 RNA 與蛋白質的結合分析，此種方式不但可以觀察 domain 跟這兩段 RNA 結合，或是有兩個不同的 RNA-binding domain，可以同時 結合兩段 RNA 序列。由於 Rta 可能會幫助 helix 36 序列 1484-1528 的區域與 region I 序列形成雙股 RNA，之後可以利用 in vitro transcription 合成 helix 36 的 序列，並標記 DIG。隨後將此 RNA 片段與之前的 biotin-labeled region I RNA 序 列結合，並加入純化出來的 His-Rta 做為實驗組，觀察 Rta 是否能幫助兩段 RNA 結合形成雙股結構，再各別以 streptavidin-magnetic beads 或抗 DIG beads 將 region I 或 helix 36 抓下來，以 acrylamide native gel 做膠體電泳，再以抗 biotin 或是抗 DIG 抗體進行分析，若兩種抗體染出來的 bands 在同一個位置，則說明 18S rRNA
與 region I 確實有形成 dsRNA，而 Rta 的加入則可能促進兩者結合的效率。如果 此假設成立，那麼 Rta 則可能擁有解旋酶(helicase)的功能，可以先將 helix 36 的 兩股分開，再讓其中一股與 region I 結合，這是未來可以探討的方向。
另外，為了釐清 region I 序列是否具有 IRES 的功能，未來也可以加 region I 插入 pGEM-7zf 載體中，並在 region I 的 3’端接上螢光基因，隨後進行 in vitro transcription，並將含有 region I 序列以及螢光基因的 RNA 轉染至細胞內，觀察 螢光基因是否能被轉譯，以確認 region I 的 IRES 功能。
4. 轉譯起始因子與 region I 序列的結合
由於 Rta 跟 40S 核醣體都有可能與 IR 序列的 region I 結合，且過去研究發 現在進行 RZ-mRNA 的 BZLF1 ORF 轉譯之前，核醣體必須先掃描 IR 序列(Chang and Liu, 2001)，因此，轉譯起始因子可能會參與此過程。其中，eIF4A 為 RNA 解 旋酶，可以將 mRNA 的二級結構打開(Jackson et al., 2010; Parsyan et al., 2011)；
eIF4G 具有支架的功能，能幫助 40S 核醣體坐落在 mRNA 上(Walsh and Mohr, 2011)；而 eIF4B 除了能加強 eIF4A 的解旋酶功能外，也能與 40S 核醣體中的 18S rRNA 結合，進而促使 43S PIC 結合至 mRNA (Methot et al., 1996a; Methot et al., 1996b; Walker et al., 2013)。eIF4A、eIF4G 以及 eIF4B 都跟核醣體能否順利結合 至 mRNA 相關(Hellen and Sarnow, 2001; Jackson et al., 2010; Lomakin et al., 2000;
Walker et al., 2013)，因此本研究先對這三種轉譯起始因子與 region I 序列的結合 進行探討。我先將質體 pCMV 或 pCMV-Rta 轉染至 293T 細胞中，隨後收集細胞
發表)，結果發現 Rta 的表現能夠幫助 eIF4A、eIF4G 結合至全長的 IR 序列上，
說明 Rta 可能需要 IR 序列上其它的片段以及 IR 序列特殊的二級結構，才能有效 地幫助核醣體和轉譯起始因子的結合。
雖然過去的研究顯示 IR 序列的 region I 對於 BZLF1 ORF 的轉譯非常重要 (Chang and Liu, 2001)，而本研究也發現 Rta、RPS6、eIF4A 以及 eIF4G 都能跟 region I 的 RNA 序列結合，但是目前的結果並不能確定 region I 是 IR 序列中唯 一能跟這些蛋白質結合的區域，因此，之後可以利用 footprinting 的方式確定這 些蛋白質在 IR 序列上的結合位置；此外，也有研究指出核醣體、轉譯起始因子 和 ITAF 在結合 IRES 時，不一定都會與 mRNA 接觸，三者之間也未必都會接觸 (Filbin and Kieft, 2009)，說明本實驗中的轉譯起始因子不一定是直接與 region I 序 列結合，而 Rta、40S 核醣體以及轉譯起始因子之間的結合關係之後也需要進一 步的釐清。目前的結果沒有辦法觀察到 eIF4B 與 region I 序列有顯著的結合，可 能說明此種轉譯起始的過程並不需要 eIF4B 的參與，或是 Rta 本身即可扮演 eIF4B 的角色。
最後，本研究也使用 RNAfold WebServer 的程式對 IR 以及 region I 的序列形 成的二級結構進行初步的預測(圖 4-1)，可以發現 region I 位於 IR 序列的第一個 stem-loop 結構(stem-loop I)中，如果將 region I 的部分刪除，可能會破壞 IR 序列 的 stem-loop I，並改變整個 RNA 的二級結構。而 region I 序列單獨存在時也可 能形成二級結構，因此以全長的 IR 序列或是單獨的 region I 序列進行 in vitro 結 合測試，所觀察到轉譯起始因子及核醣體與 RNA 的結合可能會有差異。
圖表
圖 1-1：真核生物的核醣體組成。真核細胞的核醣體為 80S 核醣體，約為 4500
圖 1-1：真核生物的核醣體組成。真核細胞的核醣體為 80S 核醣體，約為 4500