荷爾蒙生成酵素與粒線體功能

將StAR(Table 9)與 3β-HSD(Table 10)的含量分別與粒線體膜電位 (TMRE)及 mitochondrial mass(NAO，MitoTraker Red)做統計分析，

以分析結果得知，其steroidogenic enzyme 與 mitochondrial function 皆有顯著的差異性(p<0.001)。

七、卵細胞受精率與患者懷孕率之分析 1. 受精率 (fertilization rate)

各個群組所取得之卵細胞經人工生殖方式給予不同之受精方 式，其中男性因素群組使用單一精蟲卵質注入法(Intracytoplasmic Sperm Injection；ICSI)，其他群組則是使用自行受精方式，故以其 他女性不孕因素為受精率與患者懷孕率之對照組，分析每個患者 卵細胞之受精率(Table 11，Fig. 23)，各群組受精率皆低於其他女 性因素。子宮內膜異位群組為對照組 93% (73.08%±3.03% vs 78.39%±2.63%，p=0.093)，具有巧克力囊腫的子宮內膜異位之群 組 最 差 ， 比 其 他 女 性 不 孕 因 素 低 22% (56.56%±8.76% vs 78.39%±2.63%，p=0.015)，而男性因素僅 67%之受精率，比其他 女性不孕因素低(66.50%±4.48% vs 78.39%±2.63%，p=0.009)；多 囊 性 卵 巢 症 候 群 則 為 對 照 組 之 90% (70.96%±2.38% vs 78.39%±2.63%，p=0.019)。若不將病因分組，單就以卵細胞受精 率與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析(r=0.038，p<0.001) (Table 12)，以結果分析，若 E2 含量越高則卵細胞受精率越多(Fig. 23)。

2. 懷孕率 (pregnancy rate)

各組之懷孕率，經分析後發現，各組之懷孕率皆低於其他女

性 不 孕 因 素 群 組 ， 子 宮 內 膜 異 位 為 對 照 組 75% (24.64% vs 32.47%，p=0.297)，而男性因素僅 22%之受精率，比其他女性不 孕因素低33% (21.88% vs 32.47%，p=0.269)，多囊性卵巢症候群 則為其之59% (19.15% vs 32.47%，p=0.107)。各組與對照組之間 無顯著差異(Table 11)。另一方面，以懷孕率與患者本身荷爾蒙含 量進行統計分析，E2 含量與懷孕機率無相關性(p=0.601) (Table 12)。

第五章 討論

人工生殖治療之不孕症患者，主要有二種施行方式，包括人工授 精(Intra-uterine insemination；IUI)及試管嬰兒(In-vitro fertilization；

IVF)。試管嬰兒的發展至今，懷孕成功率並無大幅度的進步，影 響的原因有許多。因此，在人工生殖的領域中，無論是臨床或學 術 界 對 於 生 殖 方 面 做 許 多 研 究 ， 以 求 得 更 好 的 技 術 與 改 善 成 功 率。

本研究之患者群組以收集女性不孕症患者之診斷病因，分別區分 為四大群，包括子宮內膜異位症、多囊性卵巢症候群、其他女性不孕 因素及男性不孕因素，因不孕症之治療，本身患者本來就有些與不孕 相關之問題，實驗中無法取得由正常婦女進行人工生殖技術療程去刺 激排卵，並取得正常的顆粒細胞做研究，因此選擇以男性不孕因素為 其他因素群組之對照組，但是在卵細胞之受精率因男性不孕因素的精 子品質的因素僅能提供參考，無法與其他因素群組做比較，故卵細胞 受精率與患者懷孕率則選擇其他女性因素做為對照組。

由於顆粒細胞本身的特性易聚結成團，並且於經陰道超音波引導 下取卵手術過程會有血球的摻混(Levay et al., 1997)。因此當以流式細胞 儀進行分析的過程中，因為顆粒細胞大小約18~25 微米(Nottola et al., 2006)，雖然比血液中之白血球較大，但是易混淆而造成讀取上的錯誤，

有些實驗研究使用了表面有 CD45 為標記的磁珠去吸附掉白血球，進 而純化出顆粒細胞(Neubourg et al., 1996)，但是此方式屬於去除法，並 無法完全的去除白血球之干擾，在本次實驗研究中，選擇使用標記顆 粒細胞表面特有的FSH 之接受器(receptor)(Quinn et al., 2006)，利用此 接受器的抗體做標記，以區分出顆粒細胞，再進一步研究顆粒細胞粒 線體功能及其細胞凋亡之比例。

首先針對血液中的荷爾蒙做分析，研究結果顯示注射HCG 前十分 鐘所採取到之血液中的E2 於四種群組中，各組皆低於對照組，僅在多 囊性卵巢症候群患者與對照組沒有顯著性差異。在子宮內膜異位症群 組之患者的 E2 含量低於對照組之患者的含量，約對照組之 61%

(1354.07±109.99 vs 2212.72±219.26，p=0.001)，尤其於患有巧克力囊腫 的 婦 女 其 血 清 中 E2 含 量 約 為 對 照 組 之 46% (1015.88±127.72 vs 2212.72±219.26，p<0.001)。其他女性不孕因素之 E2 含量也相同情況，

對照組之63% (1404.48±106.02 vs 2212.72±219.26，p=0.001)，推測此狀 況因刺激卵成熟過程中，不同疾病的女性體內因素，造成體內荷爾蒙 較一般正常女性之荷爾蒙低(Tummon et al., 1988)。血清中 LH 含量於疾 病群組之統計分析中，僅有多囊性卵巢症候群組較對照組低，約為對 照組的44% (2.10±0.30 vs 4.77±1.54，p=0.049)，有統計上顯著的差異 (p<0.05)，一般多囊性卵巢症候群之患者其 androgen 較高，亦造成 LH 較高(Matalliotakis et al., 2006)，但是本研究中卻發現相反之狀況，推測 是因為接受人工生殖療程中，經由刺激排卵藥物的控制，特別對多囊 性卵巢症候群患者的 androgen 及 LH 特別做控制，抑制其濃度上升，

使得血液中的濃度偏低(Stanek et al., 2007)。

血清中P4 含量於疾病群組之統計分析中，於具有巧克力囊腫的子 宮內膜異位其結果明顯的降低，約為對照組的 33% (3.03±1.00 vs 9.15±1.06)，有統計上顯著差異性(P<0.05)。一般子宮內膜異位之患者 其在排卵前與LH surge 前後，血液中 E2 及 LH 的含量較一般正常人低 (Tummon et al., 1988)。子宮內膜異位患者其 P4 及 interleukin-6 (IL-6) 皆較高(Garrido et al., 2000)。這與本次研究中非巧克力囊腫之子宮內膜 異位的數據相符，但是本研究中卻發現具巧克力囊腫的子宮內膜異位 群組為相異之狀況，推測是因為巧克力囊腫所造成與一般子宮內膜異

位之患者相反狀況，造成LH 較對照組高，高約對照組之 2%(4.85±1.14 vs 4.77±1.54)，亦使得 P4 在血液中的含量偏低，為對照組之 33%

(3.03±1.00 vs 9.15±1.06)。於濾泡液內之荷爾蒙雖然無統計顯著性差 異，亦發現有相同的趨勢，血液中的 LH 含量與血液中或濾泡液內的 P4 是負的相關性。

本研究中，子宮內膜異位的患者之濾泡數與取得卵細胞數皆比其 他群組低，具統計顯著性差異(p<0.05)；經 E2 校正過，單一濾泡或單 一卵細胞的E2 含量亦較低，以表現出卵細胞數較少，且刺激顆粒細胞 產生之荷爾蒙含量較低。具巧克力囊腫的子宮內膜異位群組其濾泡數 偏低，為對照組之62% (7.69±0.99 vs 12.35±0.90，p=0.001)，取得卵細 胞數在群組中最低，為對照組之 44% (4.38±0.96 vs 10.00±1.23，

p<0.001)，其卵細胞成熟數(Metaphase II)亦是最少，為對照組之 61%

(3.50±0.82 vs 5.74±0.89，p=0.036)。研究數據表現出具巧克力囊腫的子 宮內膜異位群組其濾泡數、卵細胞數及卵細胞成熟數(Metaphase II)在 群組中皆是最少的狀態，且在統計上皆有顯著的差異(p<0.05)。

在本研究中觀察顆粒細胞的粒線體功能，利用 TMRE 測定粒線體 膜電位，而粒線體數量的表現是以NAO 及 MitoTraker Red 來標記粒線 體，並計算mitochondrial mass。在本研究數據顯示，以子宮內膜異位 群 組 為 例 ， 當 粒 線 體 膜 電 位 降 低(341.96±36.18 vs 482.90±57.46 ， p<0.031)，而 mitochondrial mass 少(445.22±61.09 vs 654.30±81.68，

p<0.024) ， 相 對 血 液 中 E2 含 量 亦 降 低 (1354.07±109.99 vs 2212.72±219.66，p<0.001)。因此，群組的顆粒細胞膜電位降低，相對 在 mitochondrial mass 較少，使血清中 E2 含量變少，並在群組上是具 有統計顯著性差異。顆粒細胞內粒線體功能不好，降低顆粒細胞產生 的荷爾蒙，進而影響卵細胞數量與其品質(Yamashita et al., 2007)。

在顆粒細胞的細胞凋亡分析，其數據及圖形上的變化與粒線體膜 電位及mitochondrial mass 是有相對性的，以子宮內膜異位群組為例，

當 粒 線 體 膜 電 位 降 低 ， 為 對 照 組 之 71% (341.96±36.18 vs 482.90±57.46，p<0.031)，而 mitochondrial mass 少，為對照組之 68%

(445.22±61.09 vs 654.30±81.68，p<0.024)，相對顆粒細胞的 Annexin V 比 例 增 加 ， 高 於 對 照 組 15% (65.29%±2.23% vs 56.94%±4.90% ， p=0.045)。本研究數據的結果，與其他文獻有相同情況。在文獻報告中 指出，當粒線體的膜電位下降，進一步會造成細胞凋亡(Krysko et al., 2001)。當顆粒細胞之粒線體膜電位下降、mitochondrial mass 減少及細 胞凋亡增加，血液中荷爾蒙含量會變少。因此於顆粒細胞內的粒線體 所控制的細胞凋亡是重要的一個路徑(Amsterdam et al., 2003; Choi et al., 2004)，粒線體功能不佳因而使得血液中荷爾蒙濃度偏低。

顆粒細胞內之StAR 與 3β-HSD 做為分析主要酵素，因所有的類固 醇合成的第一步驟為膽固醇從粒線體外膜移送到內膜，交由 P450scc 作用產生P4，但是粒線體之 intermembrane space 為水性狀態，無法使 脂溶性的膽固醇通過，必須要有運送蛋白協助膽固醇移送的工作 (Kallen et al., 1998; Miller, 2007)。現在已知 StAR 能快速的使粒線體產 生類固醇荷爾蒙(Christenson and Strauss, 2000, 2001)。而 3β-HSD 之任 務 為 將 去 氫 皮 質 酮 轉 換 成 雄 烯 二 酮 及 將 孕 烯 醇 酮 轉 換 成 黃 體 素 (Thomas et al., 1989)。因此，為了解顆粒細胞的 steroidogenesis，故選 擇StAR 及 3β-HSD 做為研究目標。在各組群組並無統計上相關的差異 性(Table 8，Fig. 20)，若以不區分疾病分組，單就以顆粒細胞之 StAR 與3β-HSD 與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，以結果分析發現，若 StAR 越多則 E2 濃度越多(p<0.05) (Fig. 21)，具統計上之相關性。另外，

在圖表的表現上觀察，發現 StAR 與 3β-HSD 是相反之狀況，當 StAR

越高則3β-HSD 越低，但是於統計上無顯著差異。

各群組之卵細胞有不同的受精方式，其中男性因素群組使用單一精蟲 卵質注入法，其他群組則是使用自行受精方式，故以其他女性不孕因 素 為 受 精 率 與 患 者 懷 孕 率 之 對 照 組 ， 男 性 因 素 僅 67% 之 受 精 率 (66.50%±4.48% vs 78.39%±2.63%，p=0.009)，而具有巧克力囊腫的子宮 內膜異位之群組最不佳(56.56%±8.76% vs 78.39%±2.63%，p=0.015)，此 結果表現出巧克力囊腫對卵細胞之影響很大。各群組之懷孕率，無統 計上相關的差異性。

於本研究中，因每一位患者對荷爾蒙刺激的反應皆不一致，故刺 激出來濾泡內的顆粒細胞數量也不一致，而導致所收集到的有可能不 足實驗分析，造成樣本收集上的困難。每一個療程所取得的血液檢體 以及抽取出的顆粒細胞，僅能提供一次項目之分析，無法重複多次項 目分析。在本研究推測顆粒細胞在不孕症患者中扮演的角色重要性，

探究多囊性卵巢症候群、子宮內膜異位或其他女性不孕因素是否造成 的顆粒細胞其細胞功能的不足進而使得卵細胞不成熟甚至不生長，因 而造成不孕之因素。研究中發現，具有巧克力囊腫之子宮內膜異位症 之群組與對照組比較結果較其他各組有顯著差異。

分析多囊性卵巢症候群、子宮內膜異位或其他女性不孕因素及男 性因素之患者，從產生之血液、濾泡液的荷爾蒙含量，卵細胞狀態，

顆粒細胞的功能至顆粒細胞內粒線體功能等，發現多囊性卵巢症候群 的控制良好，與一般婦女疾病無太大差異。而子宮內膜異位症之群組

顆粒細胞的功能至顆粒細胞內粒線體功能等，發現多囊性卵巢症候群 的控制良好，與一般婦女疾病無太大差異。而子宮內膜異位症之群組