先將12 mm 的圓型玻片置於細胞培養 24 孔盤(Cellstar®)中，照射 UV 燈 30 分 鐘，而後將以RPMI-1640 重新懸浮的嗜中性白血以每個孔洞 2 ×105 細胞數加入，
再將體積補到300 μl 後，靜置於 37℃、含 5%二氧化碳培養箱中 1 小時，使嗜中性 白血球可貼附於玻片上，配置600 nM Phorbol myristate acetate (PMA)(sigma)後，
取300 μl 加入細胞液中，使得 PMA 最終濃度為 300 nM，於 37℃、含 5%二氧化
碳培養箱中作用3 小時後，以 2% paraformadehy 固定(Brinkmann, et al. 2004)，以 1 倍PBS 洗 1 次，加入 1:100 稀釋之人類血清，於 4℃反應 16-18 小時後，再 1 倍 PBS 洗 3 次後，加入 1:1000 goat anti-human IgG FITC (sigma)於 37℃染色 1 小時，
以1 倍 PBS 洗 3 次，加入 hoechst 33258 染色 5 分鐘後，1 倍 PBS 洗 1 次後，以 mounting oil 封片，最後使用共軛焦顯微鏡進行觀察。
二十一、 嗜中性白血球染色
將12 mm 的圓型玻片置於細胞培養 24 孔盤(Cellstar®)中，以照射 UV 燈 30 分 鐘，而後將RPMI-1640 重新懸浮的嗜中性白血以以每個孔洞 2 ×105 細胞數加入，
靜置於37℃、含 5%二氧化碳培養箱中 1 小時，使嗜中性白血球可貼附於玻片上，
再以2% paraformadehy 固定，1 倍 PBS 洗 1 次。加入 1% triton X-100 反應 5 分鐘(若 染細胞表面則不需此處理)，1 倍 PBS 洗 1 次，以 1:100 稀釋之人類血清，於 4℃
反應16-18 小時後，再 1 倍 PBS 洗 3 次後，加入 1:1000 goat anti-human IgG FITC (sigma)於 37℃染色 1 小時，以 1 倍 PBS 洗 3 次，加入 hoechst 33258 染色 5 分鐘後，
1 倍 PBS 洗 1 次後，以 mounting oil 封片，最後使用共軛焦顯微鏡進行觀察。
二十二、 測定病人體內抗NETs 抗體的含量
將50 μl 0.001% poly-lysine 加入細胞培養 96 孔盤(Biofil®) 中，於 37℃放至 30 分鐘後倒掉，接者將懸浮於含 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及 200 nM PMA 之 RPMI-1640 的嗜中性白血球，以每個孔洞 105細胞數加入，並至於37℃、
含5%二氧化碳培養箱中 3 小時後，以 2% paraformadehy 固定後，利用 1 倍 PBS 洗1 次，加入 1% BSA blocking 1 小時後，用 PBST 洗 1 次，加入 1:100 稀釋之病 人及正常人血清於4℃反應至隔日，PBST 洗 3 次後加入 1:2500 倍稀釋之 anti-human IgG-AP (Jackson ImmunoResearch) 37℃作用 2 小時後，以 PBST 洗 3 次，利用 phosphatase substrate (sigma)呈色後，讀取 OD405。
二十三、 本論文使用抗體一覽表
Antibody Conjugate Note Rabbit anti-rat myeloperoxidase - Novus( R-1073-100)
Goat anti-rat elastase - Santa cruz (sc-9521) Goat anti-rabbit Texas-red Jackson ImmunoResearch Donkey anti-goat IgG Texas-red Jackson ImmunoResearch Goat anti-rat IgG HRP Immunology Consultant Lab Goat anti-human IgG FITC Sigma
anti-human IgG AP Jackson ImmunoResearch
參、 結果
第一部分、NETs 在感染性心內膜炎瓣膜的贅疣中所扮演的角色
1. NETs 存在於感染性心內膜炎瓣膜的贅疣中
先前實驗室的研究以在贅疣的結構中發現了Histone H2B 的存在，為了進一步證實 NETs 確實存在於感染性心內膜炎瓣膜的贅疣中，選用 Myeloperoxidase (MPO)作為 NETs 標誌，此標誌為嗜中性白血球中的顆粒性物質，為較專一性的標誌。針對感 染性心內膜炎大鼠模式分離出的贅疣以rabbit anti-MPO 單株抗體進行免疫螢光染 色後，使用共軛焦顯微鏡觀察。紅色螢光為贅疣上MPO 表現位置(圖四、A)，綠 色螢光為表現綠色螢光蛋白的轉糖鏈球菌(圖四、B)，藍色螢光為聚集在贅疣細胞 的DNA(圖四、C)，MPO 及 DNA 共同表現的位置為 NETs 結構(圖四、D)，贅疣 厚度56.4 μm，DNA 大多出現於表現 MPO 的細胞上，顯示 DNA 是由嗜中性球所 放出來，因此NETs 確實存在於贅疣中。
2. 去除感染心內膜炎大鼠體內嗜中性白血球對贅疣的影響
為了探討NETs 在感染性心內膜炎大鼠瓣膜上贅疣中所扮演的角色，在插管手 術前以及感染轉糖鏈球菌前一天，利用rabbit anti-rat PMN antiserum 消耗大鼠體內 的嗜中性白球，於感染前後抽血送 CBC，以觀察大鼠體內嗜中性白血球的數量變 化，並將感染後3 小時、6 小時及 24 小時的血塗菌，比較有無去除嗜中性白血球 大鼠血液中轉糖鏈球菌的菌量；並在犧牲大鼠後取出脾臟、肝臟及受損之心臟瓣 膜上之贅疣，秤重並定量菌數；另外，利用Elastase 抗體對贅疣做免疫螢光染色，
觀察NETs 形成的情況(圖五)。由全血分析的結果顯示，相較於給予 PBS 的控制組，
給予anti-rat PMN antiserum 的大鼠，體內的嗜中性白血球的數量明顯的減少，而 且在感染轉糖鏈球菌後 24 小時，還是維持在很少的數量，說明 anti-rat PMN antiserum 可以有效的消耗大鼠體內的嗜中性白血球(圖五、A)。然而血液中菌數定
量結果卻發現，無論是給予anti-rat PMN antiserum 還是 PBS，大鼠打菌後 3 小時、
6 小時及 24 小時血液中的菌量變化沒有顯著差異(圖五、B)；贅疣的秤重及贅疣上 菌數定量結果顯示，有無anti-rat PMN antiserum 處理的大鼠贅疣大小及贅疣上的 菌量，兩者皆沒有顯著差異(圖五、C, D)；另外，定量在脾臟及肝臟的細菌數，卻 發現相較於PBS 的控制組大鼠，anti-rat PMN antiserum 組的大鼠脾臟及肝臟內的 菌數都有大約10 倍以上的差異(圖五、E, F)。以共軛焦顯微鏡觀察 Elastase 的免疫 螢光染色結果，綠色螢光為轉糖鏈球菌，紅色螢光為Elastase，藍色螢光為 DNA，
Elastase 及 DNA 共同表現的位置為 NETs 結構，發現以 anti-rat PMN antiserum 處 理的大鼠，其贅疣上NETs 的形成有減少的情形，但是其厚度約 44 μm 和 PBS 的 控制組的40 μm 沒有顯著的差異(圖五、G)。由給予大鼠 anti-rat PMN antiserum 之 結果可以推論，注射至腹腔之anti-serum 確實可以減少周邊血的嗜中性白血球的數 量，雖然不影響周邊血的菌量，但脾臟及肝臟的菌量卻有顯著的增加，顯示周邊 血的細菌可經由血液被帶到組織中，另一方面，贅疣的大小及菌量並沒有因為 NETs 形成的減少而有所影響，NETs 在贅疣的成熟與形成的過程中不是最重要的 影響因子。
第二部分、口腔鏈球菌引起之擴散性全身性感染的患者血清中抗體生成的情況
1. 口腔共生菌引起之擴散性全身性感染患者血清中抗 NETs 自體抗體量
於感染性心內膜炎大鼠的臟瓣膜上的贅疣中，以免疫螢光染色的方式確認 NETs 的確存在於贅疣中，但是在感染性心內膜炎或是其他由口腔鏈球菌引起之全 身性感染的患者體內，NETs 是否為引起自體抗體產生的自體抗原仍不清楚。為了 證明NETs 和這些患者產生自體抗體的關係，於平底 96 孔盤以 PMA 刺激嗜中性 白血球產生NETs 後，分析 10 位感染性心內膜炎、10 位其他由口腔鏈球菌引起之 全身性感染的患者及10 位正常人各血清中抗 NETs 自體抗體量，結果顯示，感染
性心內膜炎患者及其他由口腔鏈球菌引起之全身性感染的患者體內抗 NETs 自體 抗體量高於正常人，並且有顯著差異(圖六、A)。此結果表示 NETs 在口腔鏈球菌 引起之擴散性全身性感染的患者體內可做為自體抗體的抗原，引發自體抗體的生 成。
2. 測定口腔鏈球菌引起之擴散性全身性感染患者血清中抗轉糖鏈球菌染色體抗 體
利用酵素連結免疫吸附分析法測定10 位感染性心內膜炎、10 位其他由口腔鏈 球菌引起之全身性感染的患者及10 位正常人血清中抗轉糖鏈球菌染色體抗體，結 果發現，感染性心內膜炎的患者血清中抗轉糖鏈球菌染色體抗體高於正常人其他 全身性感染的患者，然而，正常人及其他全身性感染的患者血清中的抗轉糖鏈球 菌染色體抗體量沒有顯著差異(圖六、B)。
3. 口腔鏈球菌引起之擴散性全身性感染患者血清中各種抗體生成之間的相關性 分析
分析 20 位口腔鏈球菌引起之擴散性全身性感染患者(包含感染性心內膜炎患 者)血清中各種抗體生成之間的相關性，由抗 NETs 抗體及抗雙股去氧核醣核酸抗 體的相關性分析，可得相關性係數為 0.5887 (p=0.0064)，顯示具有中度正相關(圖 七、A)。分析抗轉糖鏈球菌染色體抗體及抗 NETs 抗體的相關性，可得相關係係數 為.0.1783 (p=0.4519)，顯示無相關性(圖七、B)。抗轉糖鏈球菌染色體抗體及抗雙 股去氧核醣核酸抗體的相關性分析，可得相關性係數為0.1895 (p=0.4363)，顯示無 相關性(圖七、C)。由相關性分析結果可知患者體內抗 NETs 抗體和抗雙股去氧核 醣核酸抗體的生成有關，抗轉糖鏈球菌染色體抗體和抗NETs 抗體的生成以及抗轉 糖鏈球菌染色體抗體和抗雙股去氧核醣核酸抗體產生無相關性。
4. 口腔鏈球菌引起之擴散性全身性感染患者血清會與 NETs 作用
以免疫螢光染色方式，確認酵素連結免疫吸附分析法測定抗 NETs 抗體的結 果，首先以2 位正常人、2 位感染性心內膜炎患者及 2 位其他擴散性全身性感染患 者對嗜中性白血球、打洞嗜中性白血球及NETs 做免疫螢光染色，在以共軛焦顯微 鏡觀察。結果顯示，這些人的血清不會和嗜中性白血球及打洞的嗜中性白血球反 應，但是只對NETs 染色出現陽性反應(圖八)。進一步以正常人、感染性心內膜炎 患者，其他擴散性全身性感染患者各6 位對 NETs 做免疫螢光染色，由染色結果可 發現，正常人的血清對NETs 有微弱的反應，而兩種病人的血清對 NETs 有明顯的 反應且有些陽性反應的部分不和DNA 有共同表現的現象(圖九)。
第三部分、轉糖鏈球菌感染的大鼠體內抗體生成情形及自體抗體的影響
1. 菌血症大鼠體內抗體生成情形
利用酵素連結免疫吸附分析法測定轉糖鏈球菌感染的菌血症大鼠，並且追蹤 其體內自體抗體生成的情形，抗雙股去氧核醣核酸抗體結果顯示，相較於未感染 的正常大鼠，菌血症大鼠血清中可以偵測到抗雙股去氧核醣核酸抗體的產生，且 在感染後一週抗體的量達到高值(圖十、A)，進一步分析對其中 5 隻大鼠在感染一 周內血清中抗雙股去氧核醣核酸抗體，及抗轉糖鏈球菌表面蛋白抗體產生情形，
可以發現在感染後第 5 天大鼠血清中抗雙股去氧核醣核酸抗體就會達到高值(圖 十、B)，而抗轉糖鏈球菌表面蛋白抗體會隨者感染次數增加而上升(圖十、C)。另 一方面，偵測菌血症大鼠體內抗牛心脂抗體生成情形，發現相較於正常大鼠，菌 血症老鼠中 5 隻內有 4 隻，隨者感染的時間增加，體內抗牛心脂抗體的量有增加 的情形。結果顯示，轉糖鏈球菌的感染會造成自體抗體的產生。
2. 菌血症大鼠的腎功能分析
許多研究顯示，自體免疫疾病的患者以及動物模式體內的自體抗體會沉積在
許多研究顯示，自體免疫疾病的患者以及動物模式體內的自體抗體會沉積在