2-6 分子生物技術應用於 SRB 菌分析之簡介

2-6.1 螢 光 原 位 雜 交 法 (Fluorescence In-Situ Hybridization ， 簡 稱 FISH)

環境中的微生物鮮少能被成功分離出單獨培養，其原因為大部分微生 物生存的環境與族群間的交互關係難以釐清及掌握，導致大部分的微生物 無法在人為條件下被分離出 (Amann et al., 1995)。現代分子生物學中之原 位雜交技術從一創立就顯示出巨大的應用潛力，其應用微生物之核糖體 rRNA (ribosomal RNA) 作為親緣演化的標的基因，在正式細菌分類學上已 成為主流 (Amann et al., 1995; Werner et al., 1997; Head et al., 1998)。

主要因為 rRNA 具有下列特點：

1. 其使單獨的細胞能同時被觀察、定性、計數與標示位置。

2. 可以偵測可培養的微生物，亦可觀察不易培養之微生物，因為其以 rRNA 為寡糖核酸探針雜合的技術對於特定微生物的定性或長期監測 相當具有效用。

3. 所有生物體內均具有 rRNA，且具有同源性及安定性。

4. 其核酸序列具有保留區及變異區：變異區較為集中，其他大都為保留 區，利用其變異區上的不同，即可判別微生物演化的差異與親緣關係。

5. rRNA 可分為 5S、16S、23S 等區域，其中以 16S rRNA 具 1,500 bp 長度，較適合分析龐大複雜的細菌種類。

6. 可在短時間 (數小時) 內完成分析工作。

7. 敏感度高，可分析環境中數量較少之微生物族群，混合菌之培養亦適 用。

FISH 分析法即利用微生物 16S rRNA 特性，不同微生物具有不同序 列，藉著 rRNA 序列資料庫比對，可設計不同屬、種、亞種的寡核酸探針，

經雜交試驗後，探討環境中或活性污泥槽等生物處理系統中微生物族群的 分佈 (Amann et al., 1995)，其分析步驟包括探針設計 (probe design)、固 定樣品 (fixing)、雜交 (hybridization)、清洗 (washing)、及螢光顯微鏡觀 察。

利用螢光原位雜交方法鑑定環境中生物族群分布之研究相當豐富，在 SRB 菌之相關研究方面，Stackebrandt 於 1995 年利用 16S rRNA 技術 分析出 SRB 菌族群間之親源關係。

Ravenschlag (2000) 利用 FISH 技術調查北歐深海低溫底泥中之 SRB 菌族群結構，使用的探針包括兩種鑑定族群的探針 (SRB385 及 SRB385Db) 及三種鑑定菌種之探針 (DNMA657、660、DSV698)，顯示 SRB 菌 主 要 族 群 分 佈 依 序 為 Desulfosarcina-Desulfococcus 菌 、 Desulforhopalus sp. 菌、Desulfotalea spp. 及 Desulfofusus sp. 菌含量，

Desulfovibrio spp. 菌的量最少。其中 Desulfosarcina spp. -Desulfococcus spp. (DSS658 probe) 菌佔 49-73% 為最多。

Ito et al. 於 2002 年利用 FISH 結合微電極技術，調查微氧及無氧狀 況之下水道生物膜 SRB 菌族群變化與環境因子之影響，使用的探針包括 兩種不同族群的探針 (SRB385 及 SRB385Db) 及三種不同菌種探針 (DNMA657、660、DSV698)，結果顯示該生物膜中 93.5% ± 34% 為細 菌，SRB 菌僅佔 4.8% ，SRB 菌中又以

δ

僅佔 9.4% ，其餘約 38% 之菌種族群則非此兩種菌種族群，有待進一步 確認。顯示利用 FISH 方法鑑定微生物族群之技術已趨於成熟，並廣泛應 用，惟參與作用之微生物族群可能複雜且無絕對優勢菌存在時，如何判定 應使用之專一探針，使能有效的鑑別族群分佈，為此技術應用之關鍵所在。

2-6.2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，簡稱 PCR) 傳統分離 DNA 的方法，主要是靠基因重組或 cDNA 基因庫的建構與 篩選的一個過程，此方法往往需進行相當多的步驟。於 1985 年間所發展 出的一個方法，此法可使研究者快速分離到一個特定的 DNA，而不必進行 建構與篩選基因庫的工作。此方法被稱為聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction，簡稱 PCR)，乃是根據生物體內欲複製的 DNA 序列片段 而設計，在實驗室中對特定 DNA 序列進行快速擴增的一項新技術 (蘇，

1996)。

PCR 使科學家可以選擇性的增殖某段特定的 DNA 序列，任何的 DNA 序列都可以從生物體所含的所有 DNA 中被分離出來。然而，通常我 們必須知道欲增殖的 DNA 端部序列，如此才可以合成出用於增殖反應的 引子 (primer)。

所使用的兩條短的引子可以結合至欲增殖的 DNA 兩端。這些引子可 以黏合 (anneal) 至目標序列上，每個引子各黏合至雙股 DNA 分子的每一 股上。該引子決定了被增殖的區域範圍，同時 DNA 聚合酶可以利用試管 中以添加的四種去氧核糖核苷酸 (dGTP、dATP、dCTP、dTTP) 來複製介 於兩個引子之間的DNA。在一個循環加熱中，提升溫度至約 95^oC 之高溫 條件使 DNA 模版變性 (denature) 成單股 DNA，接著降低溫度至約

55^oC 使引子可以黏合至模版上，再提升溫度至 72^oC 使 DNA 聚合酶可 以從引子處開始延長 DNA片段。經過週期性變性，引子黏合與 DNA 合成 的過程不斷的重複可以使 DNA 以對數般的速率增殖。而從聚合酶連鎖反 應所得到的產物可以用瓊脂糖凝膠電泳法及變性梯度凝膠電泳法分析。

2-6.3 變 性 梯 度 凝 膠 電 泳 法 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，簡稱 DGGE)

電泳分析 (electrophoresis) 是一種可以用來純化與鑑定化合物的分 析技術，通常欲分析的樣品是置於兩電極 (electrode) 間以緩衝溶液濕潤的 薄 片 狀 支 撐 物 上 ， 支 撐 材 質 可 以 是 紙 、 醋 酸 纖 維 素 、 澱 粉 、 瓊 脂 糖 (agarose)、聚醯胺或其他材質。當施加一電壓於兩電極間時，產生的電流 驅動帶淨正電荷的化合物往負極 (陰極，athode) 移動，帶淨負電荷的化合 物往正極 (陽極，anode) 移動，不帶電荷或淨電荷為零的化合物則留在加 入樣品的原點 (origin)。帶電荷化合物的電泳遷移速率受到分子本身之淨電 荷、大小、形狀以及環境中的支撐材料、電流等因素的影響。

而變性梯度凝膠電泳法 (DGGE) 亦是電泳分析技術的一種，藉由 PCR 放大目標基因的量，並使雙股 DNA 一端帶有 GC clamp，結合 DGGE 的分離可進行族群分析的研究。其理論乃是利用熱或化學作用使雙 股 DNA 產生變性 (denaturant) 而使 DNA 分子的兩股分開。由於 DNA 之鹼基對是藉由氫鍵所連接，GC 間由三條氫鍵連接而成，而 AT 間僅有 兩條氫鍵相連接，故 GC 鹼基對比 AT 鹼基對結合得要牢固，因此 GC 含 量高的區域具有較高的開鏈溫度。開鏈溫度低的區域，通常位於端部稱作 低溫開鏈區，如果雙股螺旋一端開鏈，那麼未開鏈部分則束在一起，而此 為開鏈區便稱作高溫開鏈區 (如圖 2-3)，如果溫度或變性劑濃度繼續升

高，兩條鏈就會完全分開；變性梯度凝膠電泳法依據首要的一點是：DNA 雙 股末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降。第二個根據是，

如果某一區域首先解鏈，而與其僅有一個鹼基之差的另一條鏈就會有不同 的解鏈溫度，因此，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二 者分開。故當欲分析之 DNA 鹼基對以 GC 所佔比例較高時，則要使 DNA 開鏈所需的溫度則需較高；反之若 AT 所佔比例較高，則 denaturant 所 需的溫度則較低。

圖 2-3 雙股 DNA 開鏈示意圖

一個 DNA 分子會因核苷酸序列的不同可能具有數個不同的 Tm 值 (melting temperature)，如果加入尿素等可使 DNA 之氫鍵打斷（即變性）

的物質，則由於 AT 與 GC 二種互補 DNA 的結合力不同，將會造成不同 的變性效果；且由於兩種菌種其序列 AT 鍵與 GC 鍵的位置不同、數量不

同，其變性程度也不同，即雙股 DNA 遭到開鏈的程度及形狀也不相同，

因此電泳時兩條序列穿過網狀結構的難易度變因而不同，而這種難易度是 依 DNA 序列遭變性的程度不同來區分，而非限制酵素那種靠 DNA 序列 大小來區分。如果在電泳過程中加上變性程度的梯度，則更能使這種差異 性加大，進而降低不同樣本但有相同變性程度的機率。在 DGGE 電泳法 中不同位置所呈現的亮帶表示不同的 16S rDNA 序列，這是一段經 PCR 反應後的完整序列，而非像限制酵素所得的遭切碎的序列，因此，不同位 置的亮帶便為一單一菌種，然而，由於解析度的關係，此亮帶需切下再重 複做 PCR、DGGE 的試驗方能加以純化。如此，將經純化的 DGGE 亮 帶進行定序便能得知其族群的組成。