連珠石斛乙酸乙酯粗抽物 23 公克，以 Sephadex LH-20 管柱層析 法分離；用甲醇、二氯甲烷/甲醇、氯仿/甲醇，由高極性濃媒往低級 性濃媒依次做梯度沖提，每 250 毫升收一瓶，共收 51 瓶 (Table 6)，
再依 TLC 合併為 6 部分(DNE-I~DNE-VI)。(Scheme 15)
取 DNE-I：37.1 毫克，DNE-II：24.7 毫克，DNE-III：21.2 毫克，
DNE-IV：12.8 毫克，DNE-V：21.4 毫克和 DNE-VI：14.2 毫克，作 抗發炎及抗過敏活性試驗。
DNE (23g)
Sephadex LH-20 column, eluted with gradient solvent: methanol/
dichloromethane-methanol
/chloroform-methanol (see Table 6)
DNE-I DNE-II DNE-III DNE-IV DNE-V DNE-VI (7.1825g) (6.000g) (1.3896g) (0.4886g) (2.3135g) (0.6610g)
Scheme 15. Isolation of the ethyl acetate extract of D. nakaharai
Table 6. Isolation of the ethyl acetate extract of D. nakaharai
每瓶收 250 ml；M: methanol；C2: dichloromethane；C: chloroform。
1. DNE-II 之分離
DNE-II 6.0 公克，以矽膠管柱層析法分離；70-230 mesh 矽膠 80 公克，用氯仿和甲醇溶媒做梯度沖提，每 50 或 100 毫升收一瓶，共 收 28 瓶(Table 7)，再依 TLC 合併為 7 部分(NEII-A~NEFII-G)。(Scheme 16)
Table 7. Isolation of the DNE-II of D. nakaharai
每瓶收 50 或 100 ml；C: chloroform；M: methanol。
DNE-II 6.0g
70-230 mesh Si gel 80 g, eluted with gradient solvent: chloroform/methanol,
Scheme 16. Isolation of the DNE-II of D. nakaharai
(A). NEII-D 之分離與純化
230-400 mesh Si gel 30g, eluted with chloroform-methanol (9:1) and chloroform-methanol (4:1)
Fr. 01~09 (10-11) 12~20
28 (1.5mg)
Scheme 17. Isolation and purification of NEII-D of D. nakaharai
(B). NEII-E 之分離
NEII-E 1.70 公克，以矽膠管柱層析法分離；用 70-230 mesh 矽膠 30 公克，充填管柱，管柱長與內徑為 21 公分× 2.5 公分，氯仿-甲醇 溶媒(6:1, 4:1, 2:1, 1:1)，沖提，共收 51 瓶(Table 8)，再依 TLC 合併為 6 部分(E-I~E-VI)。(Scheme 18)
Table 8. Isolation of the NEII-E of D. nakaharai
瓶 沖提溶媒(ml) 依 TLC 合併 瓶 沖提溶媒(ml) 依 TLC 合併
NEII-E 1.7g
70-230 mesh Si gel 30 g, eluted with chloroform-methanol (6:1, 4:1, 2:1, 1:1), combined and concentrated with comparison by TLC
E-I E-II E-III E-IV E-V E-VI
(54.6mg) (550.0mg) (250.0mg) (260.0mg) (39.0mg) (195.8mg)
Scheme 18. Isolation of the NEII-E of D. nakaharai
1) E-I 之分離與純化
E-I (54.6 毫克)用矽膠管柱層析法分離與純化 (Scheme 19)。以 70-230 mesh 矽膠 5 公克和 230-400 mesh 矽膠 12 公克充填管柱，管柱 長寬為 20 公分× 1.5 公分，以氯仿-丙酮(4:1)溶媒沖提，每 2-5 毫升收 1 瓶，共收 27 個部分。在第 2 和 3 部分得到化合物 28，而第 13 至 20 部分合併(8.1 毫克)，得到化合物 33，經由光譜確認 28 為 2,5- dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene，33 為 protocatechuic acid 。
E-I (54.6 mg)
70-230 mesh Si gel 5 g + 230-400 mesh Si gel 12 g, eluted with chloroform-acetone (4:1)
Fr. 01 (02-03) 04~12 (13-20) 21~27
28 33 (8.1 mg)
Scheme 19. Isolation and purification of E-I of D. nakaharai
2) E-II 之分離與純化
E-II (0.55 公克)用矽膠管柱層析法分離與純化(Scheme 20)。以 70-230 mesh 矽膠 25 公克充填管柱，管柱長與內徑為 13 公分× 2.5 公 分，以氯仿-甲醇(4:1)溶媒沖提，共收 13 個部分。
在第 3 和 4 部分合併(0.10 公克)，再經 Sephadex LH-20 管柱，以 氯仿-甲醇(4:1)溶媒沖提分離，共收 20 個分管，其中 5 至 7 分管，得 到化合物 33。
在第 5 至 12 部分合併(0.12 公克)，再經 Sephadex LH-20 管柱，
以氯仿-甲醇(2:1)溶媒沖提分離，共收18 個分管，其中 9 和 10分管(38.7 毫克)，得到化合物 33。
經由光譜確認 33 為 protocatechuic acid。
E-II (0.55 g)
70-230 mesh Si gel 25 g, eluted with chloroform-methanol (4:1)
Fr. 01~02 (03-04) (05-12) 13 (0.10g) (0.12g)
Sephadex LH-20 C-M 2:1
Fr. 01~08 (09-10) 11~18 Sephadex LH-20
C-M 4:1 33 (38.7 mg) Fr. 01~04 (05-07) 08~20
33
Scheme 20. Isolation and purification of E-II of D. nakaharai
3) E-III 之分離與純化
E-III (0.25 公克)用矽膠管柱層析法分離與純化(Scheme 21)。以 230-400 mesh 矽膠 20 公克充填管柱，管柱長與內徑為 10 公分× 2.5 公分，以氯仿-甲醇(4:1)溶媒沖提，每 5 毫升收一瓶，共收 41 個部分。
在第 4 和 6 部分合併(53.5 毫克)，再經 230-400 mesh 矽膠 13 公 克充填管柱，管柱長與內徑為 12 公分× 1.5 公分，以正己烷-丙酮(1:2) 溶媒沖提，共收 23 個分管。其中 4 至 10 分管合併(23.1 毫克)，為化 合物 34。
在第 21 至 34 部分合併(38.3 毫克)，主要為化合物 33。
經由光譜確認 33 為 protocatechuic acid，34 為 uracil。
4) E-IV 之分離與純化
E-IV (0.26 公克)用矽膠管柱層析法分離與純化 (Scheme 22)。以 230-400 mesh 矽膠 25 公克充填管柱，管柱長與內徑為 13 公分× 2.5 公分，以氯仿-丙酮(1:2)溶媒沖提，每 20-30 毫升收一瓶，共收 11 個 部分。
E-III (0.25 g)
230-400 mesh Si gel 20 g,
eluted with chloroform-methanol (4:1)
Fr. 01~03 (04-06) 07~20 (21-34) 35~41 (53.5 mg) (38.3 mg)
33
230-400 mesh Si gel 13 g,
eluted with n-hexane-acetone (1:2)
Fr. 01~03 (04-10) (11-21) 22~23
34 (23.1 mg)
在第 5 部分(13.8 毫克)，得到化合物 35，經由光譜確認 35 為 nakaharoside A。
E-IV (0.26 g)
230-400 mesh Si gel 25 g,
eluted with chloroform-acetone (1:2)
Fr. 01~04 05 (06-07) 08~11 (13.8 mg) (16.1 mg)
35
Scheme 22. Isolation and purification of E-IV of D. nakaharai
5) E-VI 之分離與純化
E-VI (195.8 毫克)用矽膠管柱層析法分離與純化 (Scheme 23)。以 70-230 mesh 矽膠 5 公克和 230-400 mesh 矽膠 20 公克充填管柱，氯仿 -甲醇(4:1)溶媒沖提，共收 26 個部分。其中第 16 至 20 部分合併(15.6 毫克)，以化合物 36 為主要成分，第 21 至 25 部分合併(12.9 毫克)，
為化合物 36。經由光譜確認 36 為 vitexin。
E-VI (195.8 mg)
70-230 mesh Si gel 5 g + 230-400 mesh Si gel 20 g, eluted with
chloroform-methanol (4:1)
Fr. 01~02 (03-06) 07~15 (16-20) (21-25) 26 (3.8 mg) (15.6 mg) (12.9 mg) 36 36 (major)
Scheme 23. Isolation and purification of E-VI of D. nakaharai
(C). NEII-F 之分離與純化
NEII-F (0.3 公克)用矽膠管柱層析法分離與純化 (Scheme 24)。以 70-230 mesh 矽膠 30 公克充填管柱，管柱長與內徑為 12 公分× 2.5 公 分，氯仿-甲醇(9:1)和氯仿-甲醇(4:1)溶媒沖提，共收 20 個部分。其中 第 10 至 11 部分，分得化合物 37 (7.7 毫克)。經由光譜確認 37 為 nakaharoside B。
NEII-F 0.37 g
230-400 mesh Si gel 30 g, eluted with chloroform-methanol (9:1) and chloroform-methanol (4:1)
Fr. 01~09 (10-11) 12~20
37 (7.7 mg)
Scheme 24. Isolation and purification of NEII-F of D. nakaharai
(D). NEII-G 之分離與純化
NEII-G (1.51 公克)用矽膠管柱層析法分離與純化(Scheme 25)。以 70-230 mesh 矽膠 50 公克充填管柱，管柱長與內徑為 10.5 公分× 4 公 分，氯仿-甲醇(9:1)和氯仿-甲醇(4:1)溶媒沖提，共收 20 個部分。其中 第 11 至 12 部分，得到化合物 35 (8.3 毫克)，第 13 至 15 部分為化合 物 35 和 36，第 16 至 20 部分為 36 (15.0 毫克)。經由光譜確認 35 為 nakaharoside A，36 為 vitexin。
NEII-G 1.51 g
230-400 mesh Si gel 50 g, eluted with chloroform-methanol (9:1) and chloroform-methanol (4:1)
Fr. 01~10 (11-12) (13-15) (16-20) 21~25
35 35 36 (8.3 mg) 36 (15.0 g)
2. DNE-VI 之分離
DNE-VI 0.66 公克，經 2 次矽膠管柱層析法分離，得到 2 個化合 物 7 和 8，經光譜確認為 alkyl 4´-hydroxy-cis-cinnamates 和 alkyl 4´-hydroxy-trans-cinnamates。(分離條件資料遺失)