鷄胚胎經 8 天慢性注射骨碎補水萃物及鋁後發現，鋁組之外觀出現 明顯器官外露及嚴重出血現象，鋁組之外型較骨碎補組、控制組身長 短，如圖 4.1。
C B A
圖4.1、慢性注射 8 日後三組之巨觀觀察。
Figure 4.1 Observation of morphology of each experimental chick embryo. Effects on the development of chick embryos by 8–day treatment of (A) 25 µl of 60 mM aluminum citrate, (B) 25 µl of 0.7% NaCl or (C) 25 µl of the crude water extract of Gusuibu. The length of chick embryos in groups a, b, and c were 7.66±0.61 cm, 14.08±0.81 cm, and 13.90±0.76 cm, respectively.
測量骨碎補組、控制組及鋁組之鷄胚胎平均身長分別為 13.90± 0.76 cm、14.08± 0.81 cm 及 7.66± 0.61 cm，鋁組身長較骨碎補組及控制組明 顯短（7.66± 0.61 cm vs. 13.90± 0.76 cm、14.08± 0.81 cm，p<0.05），骨 碎補組與控制組之鷄胚胎身長並無顯著差異（13.90± 0.76 cm vs.14.08±
0.81 cm，p>0.05），如表 4.1。
表4.1、慢性注射三種試劑 8 日後之身長測量 Table 4.1 The average body length of chick embryos.
Al groupa NaCl groupa Gusuibu groupa 7.66±0.61b 14.08±0.81c 13.90±0.76c
aChick embryos chronically treated with 60 mM aluminum citrate, 0.7% NaCl or the crude water extract of Gusuibu for 8 days.
bp<0.05, Al vs. 0.7% NaCl, p<0.05, Al vs. Gusuibu.
cnot significant.
Results expressed as mean±SD.
第12 天及第 16 天取出鷄胚胎之脛骨後，發現經 4 天及 8 天慢性注射鋁 之鷄胚胎長骨中段有明顯彎曲現象，其餘二組均無此現象，如圖4.2。
a b c A
a b c B
圖4.2、 慢性注射後四天(A)及八天(B)之長骨
Figure 4.2 Photography of the long bone of 12-day (A) and 16-day (B) embryos
chronically treated on day 8 of incubation with a 60 mM aluminum citrate, b 0.7% NaCl, and c the crude water extract of Gusuibu.
經四天慢性注射 0.7% NaCl 之鷄胚胎長骨切片後，觀察到許已 形成的骨小樑組織及軟骨細胞，如圖4.3。
A
B
圖4.3 慢性注射 0.7% NaCl四天後之長骨切片顯微觀察圖。
Figure 4.3 Histological observations of long bone of chick embryo treated with 0.7%
NaCl for 4 days. A, low power view of HE staining of 5-µm section of the mid-diaphysis of the tibia of chick embryo treated with 0.7% NaCl for 4 days,（HE, ×10）. B, higher power view of the selected section in Figure 4.3-A （HE ×20）.
經四天慢性注射檸檬酸鋁之鷄胚胎長骨切片，發現許多軟骨細胞增 生，並觀察到類骨質形成但未骨化成為骨小樑的組織，此外，發現骨外 徑變形，如圖 4.4。
A
B
圖4.4 慢性注射檸檬酸鋁四天後之長骨切片顯微觀察圖。
Figure 4.4 Histological observations of long bone of chick embryo treated with aluminum citrate for 4 days. A, low power view of HE staining of 5-µm section of the mid-diaphysis of the tibia of chick embryo treated with aluminum citrate for 4 days.
(haematoxilin and eosine, ×10). B, higher power view of the selected section in Figure 4.4-A （HE×40）.
織，同時觀察到許多造骨細胞聚集於骨邊緣，此組較少觀察到軟骨細 胞，如圖 4.5。
A
B
圖4.5 慢性注射骨碎補水萃物四天後之長骨切片顯微觀察圖。
Figure 4.5 Histological observations of long bone of chick embryo treated with the crude water extract of Gusuibu for 4 days. A, low power view of HE staining of 5-µm section of the mid-diaphysis of the tibia in chick embryo treated with the crude water extract of Gusuibu for 4 days,（HE, ×10）. B, higher power view of the selected section in Figure 4.5-A (HE×40).
慢性注射0.7% NaCl 八天後之鷄胚胎長骨切片，發現此時期軟骨細胞 已全數骨化形成緻密的骨小樑組織，於此可推斷鷄胚胎孵育之第 16 天 軟骨細胞均骨化形成骨小樑，如圖4.6。
A
B
圖4.6 慢性注射 0.7% NaCl八天後之長骨切片顯微觀察圖。
Figure 4.6 Histological observations of long bone of chick embryo treated with 0.7%
NaCl for 8 days. A, low power view of HE staining of 5-µm section of the mid-diaphysis of the tibia of chick embryo treated with 0.7% NaCl for 8 days,（HE×10）,. B, higher power view of the selected section in Figure 4.6-A （HE×40）.
經八天慢性注射檸檬酸鋁之鷄胚胎長骨切片，發現許多軟骨細胞繼續增 生且完全無任何骨小樑形成骨化作用的現象，如圖 4.7。
A
B
圖4.7 慢性注射檸檬酸鋁八天後之長骨切片顯微觀察圖。
Figure 4.7 Histological observations of long bone of chick embryo treated with 60 mM Al-citrate for 8 days. A, low power view of HE staining of 5-µm section of the mid-diaphysis of the tibia of chick embryo treated with 60 mM Al-citrate for 8 days,（HE,
×10）. B, higher power view of the selected section in Figure 4.7-A （HE×40）.
骨碎補水萃物慢性注射八天後之鷄胚胎長骨切片，觀察到許多緻密的骨 小樑組織，如圖 4.8。
A
B
圖4.8 慢性注射骨碎補水萃物八天後之長骨切片顯微觀察圖。
Figure 4.8 Histological observations of long bone of chick embryo treated with the crude water extract of Gusuibu for 8 days. A, low power view of HE staining of 5- m section of the mid-diaphysis of the tibia of chick embryo treated with the crude water extract of Gusuibu for 8 days (HE ×4). B, higher power view of the selected section in Figure 4.8-A （HE×40）.
及骨小樑的生成之現象（圖4.3），當繼續慢性注射 0.7% NaCl 至 8 天後 之鷄胚胎長骨切片，觀察到完整且緻密的骨小樑組織，同時此期並無觀 察到任何的軟骨細胞（圖 4.6），因此，可推論鷄胚胎長骨骨化作用於孵 育後第 16 天完成。另外，經骨碎補水萃物慢性注射 4 天後之鷄胚胎長 骨切片中，可觀察到此時期之軟骨細胞幾乎已完全骨化為骨小樑，且骨 小樑組織完整、緻密（圖4.5），而於骨碎補水萃物慢性注射 8 天後之切 片中觀察到仍是緻密且完整之骨小樑組織（圖 4.8）。
另外，連續注射檸檬酸鋁4 天後之鷄胚胎長骨切片顯示出軟骨細胞 增生，及未骨化之類骨質（圖4.4），慢性注射檸檬酸鋁 8 天後（圖 4.7）
之軟骨細胞增生面積較注射檸檬酸鋁4 天者增加，且慢性注射檸檬酸鋁 8 天後之鷄胚胎長骨切片完全觀察不到骨小樑生成，同時骨外徑亦因骨 化不全而出現更嚴重變形，因此無法取得完整中段骨橫切面。由此可觀 察到經檸檬酸鋁注射之鷄胚胎長骨切片顯示出軟骨細胞增生的現象，且 隨檸檬酸鋁注射時間增加，軟骨細胞面積也隨之增加，但因觀察不到骨 小樑形成，而推論骨化作用被鋁所抑制。
長骨組織切片中之軟骨細胞面積、皮質骨面積及骨徑寬等數據與骨 化作用程度、骨強度有關，故以 Image Pro-Lite 電腦軟體計算骨切片之 軟骨細胞面積、皮質骨面積及骨徑寬，依下列定義量測及計算上述三項
25,26（圖4.9）。
1.骨切片面積（cross-sectional area）：骨切片中沿外骨膜（periosteal surface）範圍所描繪之區域，包括髓質面積。
2.髓質面積（medullary area）：沿骨切片中之內骨膜（endosteal surface）
描繪出來電腦計算所得區域。
3.軟骨細胞面積（chondrocyte area）：骨切片中描繪軟骨細胞區域並經電 腦計算統計所得。
4.皮質骨面積（cortical bone area）：骨切片面積扣除軟骨細胞面積、髓質 面積及空白區後經電腦計算統計所得。
5.骨徑寬（thickness of cortical bone）：選定該骨切片中骨徑最寬之位置，
定位後以電腦游標畫一直線所得之距離。
外骨膜；
Periosteal surface
內骨膜；
Endosteal surface
骨徑寬；
Thickness of cortical bone
圖4.9 骨切片示意圖。 參考來源：Endocrine Reviews.19 (1):55-79, 1998
以Image Pro-Lite 軟體進行骨切片組織顯微測量之結果並經軟體計算與 統計後之結果綜合整理於表4.2、表 4.3 及圖 4.4 至 4.7。
表 4.2 得知慢性注射骨碎補水萃物 4 天後之皮質骨面積、皮質骨徑及軟 骨細胞面積與控制組於統計上均無顯著差異性（p >0.05），此外，經 8 天慢性注射骨碎補水萃物之皮質骨面積較同時期之控制組大（754594.20
± 123264.54 µm2 v.s. 576075.49± 74965.67 µm2，
p <0.05），且皮質骨徑亦較同時期之控制組厚（349.03± 21.14 µm v.s 310.67± 41.89 µm， p <0.05），意即為，慢性注射 4 天後骨碎補組與控 制組並無顯著差異，直至慢性注射8 天後，觀察到骨碎補組之皮質骨較 同期之控制組大且厚。
法量測，而此時期之控制組及骨碎補組則因骨化作用完成，而無法觀察 到軟骨細胞。
表4.2 慢性注射三種不同樣品 4 日及 8 日後之鷄胚胎脛骨中段切片之皮 質骨面積、皮質骨厚度、軟骨細胞面積比較
Table 4.2 Effect of each treatment on bone measurements at the tibia mid-diaphysisa
Treatment Cortical bone surface (µm2)
Thickness of cortical bone (µm)
Chondrocyte surface (µm2)
Day 4- 0.7% NaCl
466702.25± 194394.16 266.23± 157.50 139307.90± 177077.37
Day 4 -Guisubu
640327.21± 331712.37d 337.01± 48.90c 19789.39± 15599.21
Day 4 -aluminum
104085.32± 162584.83 31.40± 6.63 162984.38± 17430.32
Day 8 -0.7% NaCl
576075.49± 74965.67d,f 310.67± 41.89c,e NAb
Day 8 -Guisubu
754594.20± 123264.54f 349.03± 21.14e NAb
aResults are the mean±SD.
bNA=not available.
c,e,f p<0.05.
d p>0.05.
三組慢性注射4 日及 8 日後，長骨切片中軟骨細胞面積與皮質骨面積
Table 4.3 The ratio of chondrocytes area and cortical bone area on cross-sectional area.
Treatment Cross-sectional area ( m2)
Chondrocytes area (%)
Cortical bone area (%)
aNA= not available.
組之皮質骨面積較控制組與骨碎補組小，且於慢性注射鋁8 天後因骨嚴
0.7% NaCl Gusuibu Aluminum Treatment
cortical bone area (µm2 )
day4 day8
#
*
圖4.10 比較三組慢性注射後第四天及第八天之皮質骨面積.
Figure 4.10 Measurements of the area of cortical bone surface after treatment with 0.7%
NaCl, the crude water extract of Gusuibu and aluminum.
Results are expressed as mean ±S.D.(* p <0.05 vs. control and Gusuibu groups.
# p <0.05 vs. control group)
比較三組於慢性注射 4 天及 8 天後之皮質骨厚度，發現慢性注射 4
0.7% NaCl Gusuibu Aluminum Treating solution
Τhickness of cortical bone (µm)
day4 day8
#
*
圖4.11 比較三組慢性注射後第四天及第八天之皮質骨厚度.
Figure 4.11 Measurements of the thickness of cortical bone after treatment with 0.7%
NaCl, the crude water extract of Gusuibu and aluminum.
Results are expressed as mean ±S.D.(* p <0.05 vs. control and Gusuibu groups. # p <0.05 vs. control group)
慢性注射4 天之骨碎補組之皮質骨面積與 8 天之控制組相似（640327.21±
331712.37 µm2 v.s 576075.49± 74965.67 µm2），意即為，4 天之骨碎補組 之皮質骨面積相當於 8 天之控制組之皮質骨面積（圖 4.12）。
0.00 100000.00 200000.00 300000.00 400000.00 500000.00 600000.00 700000.00 800000.00
day 8- 0.7% NaCl day 4-Gusuibu Treating solution Cortical bone area (µm2 )
*
圖4.12 慢性注射後第 8 天控制組與第 4 天骨碎補組之皮質骨面積比較 Figure 4.12 Comparison of the area of cortical bone between the long bone of day 8-0.7% NaCl and day4-Gusubu treated on chick embryos.
Results are expressed as mean ±S.D. (* p <0.05 vs. day 8-0.7% NaCl)
圖4.13 說明慢性注射 4 天之骨碎補組之皮質骨厚度與 8 天之控制組相似
day 8- 0.7% NaCl day 4-Gusuibu Treatment
thickness of cortical bone (µm)
*
*
圖4.13 慢性注射後第八天控制組與第四天骨碎補組之皮質骨厚度比較 Figure 4.13 Comparison of the thickness of cortical bone between the long bone of day 8-0.7% NaCl and day4-Gusubu treated on chick embryos.
Results are expressed as mean ±S.D. (* p <0.05 vs. day 8-0.7% NaCl)
根據多年以鷄胚胎作為實驗模式之學者Firling 於 1999 年發表文獻 中表示，以鷄胚胎作為實驗模式的優點為（一）鷄胚胎已脫離母體為一 獨立的生存個體，實驗期間之營養均由其卵黃供給，因此不受外界營養 供應之影響，亦無攝食及進食量的問題，（二）鷄胚胎正值成長發育期 許多荷爾蒙均未發展成熟，因此可直接介入觀察其生長初期骨骼的成 長，（三）鷄胚胎時期之骨骼成長發育不受到骨合成（bone formation）
及骨溶蝕（bone resorption）平衡作用的影響，因此以鷄胚胎作為實驗模 式可直接觀察特定之試劑對於骨成長發育之影響 19。
鷄胚胎之長骨礦物質化（mineralization）於孵育後第八天開始27（表 5.1），因此，本實驗自第八天開始，進行慢性注射三種不同樣品入受精 雞蛋之氣室，於注射後的第4 天（孵育第 12 天）及第 8 天（孵育第 16 天）進行巨觀的型態觀察及微觀的骨切片觀察，結果發現鋁抑制了骨化 之過程，並導致骨軟化現象，而骨碎補水萃物則具有促進骨化的作用。
表5.1鷄胚胎孵育各時期之長骨生長情形 參考來源： Develop Biol. 86:147-156, 1981
之鷄胚胎外型生長明顯較其他二組短小，且其長骨於第4 天及第 8 天都 觀察到有明顯彎曲的現象，此項發現與過去的研究報告有一致性，
1994，1999 年 Firling 等人均觀察到，此外，鷄胚胎外型有出血現象。
根據文獻記載鋁有明顯抑制骨骼生長並導致骨軟化症（osteomalacia）
之現象12,16,18,19,20,28，1986 年 Goodman 發表鋁抑制骨生長的可能機轉29
為：（一）鋁可視為一個骨礦物質化之生化抑制劑（physical-chemical inhibitor）；（二）鋁會抑制腎臟中 25(OH)-vitamin D-1.α-hydroxylase 之
為：（一）鋁可視為一個骨礦物質化之生化抑制劑（physical-chemical inhibitor）；（二）鋁會抑制腎臟中 25(OH)-vitamin D-1.α-hydroxylase 之