I. 試藥與儀器
A. FAPGG (N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly) (Sigma Co., F7131)
B. ACE (angiotensin-converting enzyme) (Sigma Co., A6778) C. 50 mM Tris-HCl 含 0.3 M NaCl (pH 7.5)
II. 方法
依序加入下列試藥：不同濃度(0.1, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mM)之 FAPGG 1 mL、12.8 μM TN1 dioscorin及 1 U ACE 20 μL，再用分 光光度計測量五分鐘內 345 nm 吸光值的變化(△A 345 nm/min)，
根據 Lineweaver-Burk plot 公式，1/[S]當作 x 軸，1/V 當成 y 軸，
計算結果作圖，從控制組和實驗組的雙倒數回歸線交點，判斷出 抑制劑和酵素之作用型態，帶入 Michaelis-Mwnten 公式求得 Km 及 Km’，抑制常數 Ki以公式 Ki=[I]/(Km’/Km)-1 求出([I]為加入台農 一號山藥 dioscorin 的濃度)。
三、自發性高血壓鼠(Spontaneously Hypertensive Rat，
SHR)餵食實驗
(Chen et al., 2003)餵食 6 週齡雄性自發性高血壓鼠，每天餵食一次，飲水不限，溫 度控制在 23 ± 2 ℃，燈光 12 小時明暗更替所有的動物飼養條件規範 皆參照 1994 年我國國科會所公布的規範條款，飼養至 9 週齡時開始 進行實驗。先將各種不同山藥萃取出之 dioscorin 溶於 normal saline 中，經口餵食(10, 20, 40 mg/kg)，並以餵食 normal saline 為空白組，
以 captopril (2 mg/kg)為正對照組。先測餵食前血壓後，於餵食後每兩 小時時間點再監測其血壓變化。測量血壓時先將 SHR 置於 60 W 的燈 泡下自由活動 10 分鐘後，移置於量測高血壓的保溫袋(39 ± 1 ℃)並將 老鼠固定，以 Indirect blood pressure BP-98A meter 裝置(Softron Co.
Ltd., Japan)測量老鼠尾部收縮壓(Systolic blood pressure, SBP)、舒張壓 (Diastolic blood pressure, DBP)，每隻 SHR 皆分別測定 3 次取其平均 值。
四、糖尿病鼠血液流變實驗
1. 糖尿病鼠的誘發
6 週齡之 Wistar 公鼠，每天餵食一次，飲水不限，溫度控制 在 23 ± 2 ℃，燈光 12 小時明暗更替，飼養至 8 週齡時開始誘導 糖尿病的形成。參考 Masiello 等人(1998)的模式，以腹腔注射的 方式首先注射 nicotinamide (200 mg/kg, Sigma Co., N3376)，15 分 鐘後再注射 streptozotocin (STZ, Sigma Co., S0130) 50 mg/kg，兩 天後相同的劑量再施打一次。再經兩週後測其禁食血糖，當 Wistar 禁食血糖大於 180 mg/dl 時則認定為已被誘導成糖尿病。
2. 血液的採集
在購買六週齡的 wistar 鼠後，分成九組，前五組為誘導成糖 尿病八週後再餵食台農一號山藥 dioscorin 三週，分述如下：第 一組為沒有誘發糖尿病之正常鼠，第二組為八週齡時誘發成糖尿 病鼠後正常餵食外不給予任何處理，第三、四、五組亦為八週齡 時 分 別 為 誘 發 成 糖 尿 病 鼠 後 每 天 經 口 餵 食 台 農 一 號 山 藥 dioscorin 10 mg/kg、20 mg/kg、40mg/kg 連續餵食三週；六至九 組為誘導糖尿病十六週後再餵食台農一號山藥 dioscorin 三週，
分述如下：第六組為誘發成糖尿病鼠後十六週齡時正常餵食外不 給予任何處理，第七、八、九組為分別為誘發成糖尿病鼠後十六 週 齡時每天 經口餵 食台農一 號山藥 dioscorin 10 mg/kg、 20 mg/kg、40 mg/kg 連續餵食三週。以上各組在禁食一夜後，隔天 以乙醚迷昏鼠隻，自心臟採血，再將血液收集至含有 heparin 之 離心管裏，其中 2 cc 血液送至台灣優品醫事檢驗中心檢測，分析
其紅血球數、白血球數、血小板數及血球容積比。血糖則使用泰 博克立測血糖血壓測試儀系統(TD-3213)測得。
3. 血液黏度測定
本實驗量測血液及血漿黏度之方式，是利用 Steady state 之方 式測定剪切率(Shear rate)與血液黏度之關係。取 4 cc 全血加入黏 度儀，操作條件在 37 ℃定溫下測剪切率 400 sec-1到 1 sec-1之黏度 變化。
4. 紅血球變形及聚集度測量
紅血球的變形度(Deformability)是藉由紅血球黏度的影響而 測定的。測量方法是藉由剪切率使紅血球伸長變形後，以雷射光 通過約 3 - 5 μm的孔洞測量紅血球形狀改變的多寡。本實驗所使 用的儀器為 LG-B-190 型 Ektacytometer。剪切率(Shear rate)測試 範圍為 1~ 1000 sec-1。取 40 μl全血，加入 1 ml 測試液後混和均 勻，再取800 μl到儀器中測試。
而紅血球的聚集度則取800 μl的全血，加到儀器中去測試紅 血球的聚集度。
第三章 結果與討論
一、山藥儲藏性蛋白質 dioscorin 的分離與純化
圖十三為以 10 mM Tris (pH 8.3)含 0.15 M NaCl 沖提之 DE-52 管 柱層析圖。收集第 8 ~ 33 管，再經過濃縮、透析、冷凍乾燥後，可得 到山藥之儲藏性蛋白質 dioscorin。
將所得之蛋白質取 10 μg經 SDS-PAGE 後，以 Coomassie Brillian Blue R (CBR)染色，發現約在 32 kDa 有一主要的蛋白質(圖十四 a)，
再以 Anti-Sheep Serum antibody produced in rabbit (Sigma Co., S4265) 為二次抗體，經 Western blot 試驗(圖十四 b)，證實此 32 kDa 蛋白質 為山藥之儲藏性蛋白質 dioscorin (Conlan et al., 1995, Liao et al., 2004)。
二、抑制 ACE 活性試驗
1. 不同山藥 dioscorins 抑制 ACE 活性的測定
Holmquist 等人在 1979 年以 N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Phe-Gly -Gly (FAPGG)為 ACE 為受質，FAPGG 會被分解成 F-phe + GG，
在波長 345 nm 下之吸光值會有變化。
各種山藥之 dioscorin 抑制 ACE (20 mU)之能力如附圖一~六 所示，x 軸為時間，y 軸為波長 345 nm 下之吸光值，當其斜率 愈小時，其 FAPGG 被分解之能力則愈低，也就是 FAPGG 被 ACE 分解的活性降低。圖十五中表示各種山藥加入 250, 500, 750 及 1000 μg 相當於 6.4, 12.8, 19.21, 25.6 μM，台農一號山藥 dioscorin 抑制率各為 41.9, 47.7, 53.5 及 57.0 %；台農二號山藥
dioscorin 的抑制 ACE 活性各為 21.4, 23.2, 23.2, 25 %；基隆山藥 dioscorin 的抑制 ACE 活性各為 32, 33, 35, 38.9 %；名間山藥 dioscorin 的抑制 ACE 活性各為 25, 31.5, 33.7, 41.3 %；日本山 藥 dioscorin 的抑制 ACE 活性各為 16.4, 21.8, 34.5, 45.5 %。綜 合以上可以發現台農一號山藥 dioscorin 在 6.4 μM (相當於 250 μg)時即有很好的抑制 ACE 活性的效果，而日本、名間、基隆 山藥都要加到 25.6 μM (相當於 1000 μg)才會有明顯的活性。接 著再將各種山藥 dioscorin 的不同濃度(6.4 , 12.8, 19.21, 25.6 μM) 及 captopril (0.047, 0.094, 0.141, 0.189 μM)以 log 值帶入 x 軸，對 應以 ACE 抑制率的 y 軸，如圖十五，就可以很明顯發現在各種 山藥中以台農一號山藥 dioscorin 的抑制 ACE 效果是最佳的，
其 IC50為 15.98 μM (相當於 623.8 μg dioscorin)。
2. ACE 抑制動力學(Enzyme Kinetic analysis)
Michaelis-Menten 依照酶的作用理論，提出酵素動力學曲 線 1/V = Km/[Vmax][S] + 1/Vmax。抑制劑藉由與酵素產生非共價 鍵的結合，阻礙基質進入酵素活性區，或者改變酵素構形而導 致酵素失去活性。此種抑制酵素的機制，依抑制劑[I]與酵素[E]
的結合方式，可以分成三種型態：競爭型抑制(Competitive)、非 競爭型抑制(non-competitive)及不競爭型抑制(uncompetitive)。如 果增加受質濃度可降低抑制作用，此種抑制劑屬於競爭型抑制
劑，此種會使酶表現出來的 Km值會增加，但 Vmax不會改變。
而非競爭型抑制其抑制劑在酶上的結合部位不影響酶與受質的 結合位置，此類抑制可減少酶的催化活性，使酶的含量似乎減 少，因此 Vmax減少但酶的 Km值不受影響。
故由抑制劑對酵素動力學的曲線，即可得知是何種抑制方 式。在此分成兩個部分，一部份不加抑制劑，另一部份加入抑 制劑，再與不同濃度的受質(FAPGG)，及固定濃度的酵素(ACE) 反應，帶入酵素動力學曲線 1/V = Km/[Vmax][S] + 1/Vmax 以 Lineweaver-Burk 雙倒數作圖(圖十六)，結果發現在空白對照組 中得到的 Km值為 0.387 mM，有加入台農一號山藥 dioscorin 時 其 Km’值為 0.727 mM，帶入公式 Ki = [I] / (Km’/Km) – 1，求得 抑制常數 Ki為27.35 μM。以台農一號 dioscorin (12.8 μM)當作 抑制劑，其 Vmax不變 Km變大，所以得知為競爭型抑制。也就 是提高受質(FAPGG)的濃度，可以克服抑制劑的抑制。
三、自發性高血壓鼠(SHR)餵食實驗
目前有許多以口服餵食胜肽具有類似 ACEI 活性而降低高血壓鼠 血壓的相關文獻發表，例如 Shin 等人(2001)從韓國大豆中分離出來的 胜肽 His-His- Leu 中發現可以降低血壓； Sato 等人(2002)亦從 Wakame 海藻中找到降血壓的成分； Saiga 等人(2003)也從雞胸肉中 分離出降血壓的胜肽；另外 Yang 等人(2003)也從菠菜(Spinach rubisco) 葉中分離出抑制 ACE 活性的胜肽；在 2006 年 Miguel 等人所整理的 雞蛋蛋白質的降血壓作用也都是使用此模式；2006 年 Ichimura 等人 運用此動物模式發現在百香果(Passiflora edulis)有降血壓的成分。
1983 年 Harvey 及 Boulter 從 D. rotundata 中分離出主要儲藏性蛋 白質，含量大約佔所有蛋白質的 85%，分子量約為 31 kDa。隨後 1995 年 Conlan 等人從 D. cayenesis 中 clone 出兩條主要儲藏性蛋白質的 cDNAs，而且其中有 70 %的相似序列。Harvey 及 Boulter (1983)指出 這些 dioscorins 以單硫鍵結合，但是 Conlan (1995)指出應是以雙硫鍵 結合。dioscorin A 與 B 的胺基酸序列中皆有三個 cysteine 殘基，但是 僅有兩個位置是相同的。所以第三個 cysteine 殘基位置的不同可以區 分 dioscorin A 及 B。2004 年在 Liao 等人利用 Fourier transform (FT)-Raman spectroscopy 分析 D. alata L.、D. alata L. var. purpurea 及 D.
japonica 等三種山藥 dioscorin 的結構，結果發現 D. alata L.的 dioscorin
主要是呈現 α-helix 的二級結構，D. alata L. var. purpurea 主要是反平 行β-sheet 結構，而 D. japonica 則是 α-helix 及 β-sheet 混合結構。三 種不同來源的 dioscorin 雖有相同的分子量(32 kDa)，但是其胺基酸組 成不同，造成二級結構不同，所表現出來的生理活性也就有所不同。在本實驗中，採用品種不同的 dioscorin，所表現不同的活性也就可以
得到推論。
在以台農一號山藥 dioscorin 40 mg/kg 餵食後測量其 24 小時內 short term SHR 之尾動脈壓，發現第二小時收縮壓便已經開始下降，
至第四小時 SBP 更降低了 21.5 mmHg (p<0.01)(表一)，另外以 20 mg/kg 餵食 SHR 量測 24 小時內的血壓變化，第二小時也開始降低，
到第四小時降了 12.4 mmHg (p<0.01)，而在正對照組 Captopril (10 mg/kg)的部分，兩小時後 SBP 降低了 18.4 mmHg (p<0.01)，四小時降 低了 25.2 mmHg (p<0.01)。在第 24 小時再測其血壓，各組的 SBP 皆 回復到原來的血壓，大約在 200 mmHg 左右。另外在以台農二號 40 mg/kg 餵食後其收縮壓在第 2, 4 小時各降低 15.6 (p<0.01), 13.2 mmHg (p<0.01)；以基隆山藥 40 mg/kg 餵食後其收縮壓在第 2, 4 小時各降低 8.2 (p=0,019), 14.8 mmHg (p<0.01)；在以名間山藥 40 mg/kg 餵食後其 收縮壓在第 4 小時降低 7.7 mmHg (p=0.024)；而以日本山藥 40 mg/kg 餵食後其收縮壓在第 4 小時降低 10.5 mmHg (p=0.00105)。目前大多 數的期刊關於口服餵食測量 SHR 血壓大都是觀測 short tern (24 hr)，
本實驗中以台農一號山藥 dioscorin 40 mg/kg 每天經口給予 SHR 連續 25 天，發現其收縮壓在第九天降最明顯降低了 27.7 mmHg (p<0.001) (圖十九 a)，而舒張壓也是在第九天明顯降低了 28.3 mmHg (p<0.001) (圖十九 b)，平均壓則在第 8、9 天也有顯著的下降(圖十九 c)。根據 以上的結果可以發現 YSP-TN1 不管是在 short term 或是 long term 對 於 SHR 皆有降低血壓的作用。
2000 年 Fujita 等人發現八胜肽中的 FFGRCVSP (IC50 = 0.4 μM) 及 ERKIKVYL (IC50 = 1.2 μM)有類似 ACEI 的活性，但是經餵食 SHR 後卻喪失了此活性。另外 2002 年 Sato 等人也提到三種胜肽，包括
AW (IC50= 18.8 μM)、VW (IC50 = 3.3 μM)、 LW (IC50= 23.6 μM)，
在 in vitro 中皆有類似 ACEI 的活性，但是在餵食 SHR 後也失去這樣 的活性。基於以上的結果，具有類似 ACEI 活性的胜肽在 in vivo 中經 過動物消化道的酵素分解後，有可能會喪失其原有活性。因此我們將 試驗台農一號山藥 dioscorin 在經過酵素水解後是否還保留原有的活 性。首先我們再準備一批 SHR，另外，將台農一號山藥 dioscorin 以 pepsin 水解 24 小時後，經 pepstatin 去除掉 pepsin 後，冷凍乾燥所得 之產物(peptic hydrolyzates, PH-TN1)以 40 mg/kg 餵食高血壓鼠，測量 其 24 小時內血壓的變化，我們發現在餵食後的 2, 4, 6, 8 小時後其收 縮壓各下降 4.2, 21.3, 25.3, 32.8 mmHg (圖二十 a)，舒張壓各下降 4, 13, 20, 34.5 mmHg (圖二十 b)，平均壓則各下降 3.6, 15.3, 21.7 33.7 mmHg (圖二十 c)。另外再以 trypsin 水解台農一號山藥 dioscorin 24 小時後，
冷凍乾燥所得之產物(TH-TN1)，以 20 mg/kg 餵食 SHR，在餵食後的 2, 4, 6 小時後其收縮壓各下降 20.3, 27.2, 8.4 mmHg (圖二十一)。Hsu 等人(2002) 以水解後的 PH-TN1 在 in vitro 中抑制 ACE 活性皆比未水 解的 dioscorin 的能力更好，而在本實驗 in vivo 餵食台農一號山藥 dioscorin 經過 pepsin、trypsin 水解後的產物，亦有相同的效果。台農
冷凍乾燥所得之產物(TH-TN1)，以 20 mg/kg 餵食 SHR，在餵食後的 2, 4, 6 小時後其收縮壓各下降 20.3, 27.2, 8.4 mmHg (圖二十一)。Hsu 等人(2002) 以水解後的 PH-TN1 在 in vitro 中抑制 ACE 活性皆比未水 解的 dioscorin 的能力更好，而在本實驗 in vivo 餵食台農一號山藥 dioscorin 經過 pepsin、trypsin 水解後的產物，亦有相同的效果。台農