圖5.將PC-3細胞不加入(A)及加入1mM Eu-NB-TTDA-BN(B，C)，分別培養於4 C(B)及37
C(C)之光學影像。
六、In vitro MR 影像研究
圖6為Gd-NB-TTDA-BN在in vitro磁振造影之影像圖，由結果可得之GRPR過度表現之 PC-3人類前列腺癌細胞，加入Gd- NP-TTDA-BN相較於未加入對比劑之訊號強度增加三 倍，相對於臨床使用的對比劑[Gd (DTPA)]2-及[Gd (NP-TTDA)]2-也明顯的增加了影像的對 比，而在競爭實驗中，我們加入四倍量的BN胜肽競爭GRPR，而使影像強度較低，這樣的 結 果顯示Gd-NB-TTDA-BN可利用BN去鍵結到GRPR而可成為一具有目標化的MRI對比藥劑。
圖6. PC-3 cells(GRPR過度表現)及KB cells(GRPR無過度表現)分別未加入及加入1.0M [Gd (DTPA)]2-、[Gd (NP-TTDA)]2-、Gd-NP-TTDA-BN、四倍BN胜肽之體外MRI影像。
七、CLIO-Herceptin 之物化特性探討
本實驗利用傅立葉轉換紅外線光譜儀(FT-IR)(圖 7)及熱分析儀(TGA)(圖 8) 鑑 定 所 合 成 之 SPIO 、 CLIO 、 CLIO-EDBE 及 CLIO-Herceptin。圖一中，SPIO (a)在 3300cm -1 有-OH 官能基的吸收、在 2800 cm -1 有低強度的吸收，是-CH 2 -官能基訊號，這兩個吸收峰 為 dextran 的吸收訊號。CLIO (b)在 3300 cm -1 有-OH 官能基的吸收。CLIO-EDBE (c)在 3000~3400 cm -1 有一個寬帶的訊號，為−NH 2 和−OH 的混合訊號，且在 2900 cm -1 有低強 度 的 吸 收 。 這 些 吸 收 峰 代 表 氧 化 鐵 奈 米 粒 子 表 面 確 實 接 上 dextran 、 epichlorohydrin 及 2,2’-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) (EDBE)。將每一步驟的產物抽乾送測 熱分析儀，由圖二可以看出在每一步驟產物經過高溫(600°C)燃燒後剩餘產物的百分比，SPIO (60 %)、CLIO (56 %)、CLIO-EDBE (52 %)及 CLIO-Herceptin (39 %)，被燃燒的部份為氧化鐵 奈米粒子表面的有機物，而核心的氧化鐵奈米粒子則是要 1000°C 以上的高溫才會被燃燒掉，
由圖一及圖二結果顯示，本實驗確實成功合成且得到最終產物。
圖 7. 氧化鐵奈米粒子表面修飾上 dextran、epichlorohydrin 及 EDBE 之紅外線光譜圖。
(a)SPIO，(b)CLIO 及(c)CLIO-EDBE。
圖 8. 氧化鐵奈米粒子表面修飾上 dextran、epichlorohydrin、EDBE 及 Herceptin 利用熱分 析儀分析後之圖譜。(a)SPIO，(b)CLIO，(c)CLIO-EDBE 及(d)CLIO-EDBE-Herceptin。
氧化鐵奈米粒子在尚未包覆具生物相容性之材料時，易因磁性產生聚集形成巨大顆粒而 造成沉澱。在包覆良好生物相容性之材料後，每個氧化鐵奈米粒子之外層，形成一層薄膜，
此薄膜讓氧化鐵奈米粒子不易產生聚集且增加分散性。由穿透式電子顯微鏡的觀察，即可判 斷氧化鐵奈米粒子是否聚集，藉此證明已包覆良好生物相容性之材料可增加其分散性，並量 測所合成之氧化鐵奈米粒子之鐵核部份的平均粒徑大小。將合成之 CLIO-Herceptin 利用穿 透式電子顯微鏡分析，結果如圖 9 所示，由影像可看出氧化鐵奈米粒子分散良好且無聚集現 象，並計算其平均氧化鐵奈米粒子核心直徑為 3.5 ± 0.3 nm。
圖 9. CLIO-Herceptin 溶液滴在鍍碳銅網上並利用穿透式電子顯微鏡觀察所得之影像。
白色 bar 為 20nm。
利用粒徑分析儀測量每一步驟產物之水合直徑，其利徑分布如圖 10 所示，SPIO、CLIO、
CLIO-EDBE 及 CLIO-Herceptin 的平均粒徑分別為 26.1 ± 0.2、35.2 ± 1.1、41.3 ± 0.8 及 67.2 ± 1.4 nm。SPIO 的粒徑略小於目前臨床使用的瑞瑟維斯(Resovist ®，50~60 nm)，鍵結上 Herceptin 後直徑變大，推測是因為 Herceptin 本身體積較大之緣故。由文獻探討，雖然本實驗所合成的 奈米粒子尺寸分布略大於用熱裂解方法合成的超順磁氧化鐵奈米粒子，但由文獻推測本研究 中所合成的 CLIO-Herceptin 整體尺寸較小，且有包覆上生物相容性的聚合物，若打入動物體 內，可減少被網狀內皮系統(reticuloendothelial system， RES)吞噬的機率，則可提高到達目 標腫瘤位置的機率。
圖 10. 使用粒徑分析儀測量(a)SPIO，(b)CLIO，(c)CLIO-EDBE 及(d)CLIO-Herceptin 之水 合粒徑分布。
8 CLIO-Herceptin 具超順磁性、無磁滯現象並得飽和磁化率為 80 emu/g，此數值比過去文獻發 表，利用二價鐵、三價鐵混合得 到 氧 化 鐵 奈 米 粒 子 且 包 覆 dextran 的 數 值 略 水溶液下分散狀態。圖 12 為長時間量測 SPIO、CLIO、CLIO-EDBE 及 CLIO-Herceptin 之粒 徑大小，由結果發現並無明顯團聚造成粒徑變大之現象，初步顯示本實驗中所合成之產物相
9 圖 12. 利用
粒徑分析儀在不同時間量測(a)SPIO ，(b)CLIO ，(c)CLIO-EDBE 及(d)CLIO-Herceptin 之 水合粒徑分布且觀察其穩定度。
圖 13. 在 37°C 下 用 20 MHz relaxometer 在 不 同 時 間 量 測 CLIO-Herceptin 之弛緩率並觀察其穩定度。
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圖 14. 將 CLIO-Herceptin 分散於不同 pH 值水溶液下，並長時間觀察其分散現象。
八、CLIO-Herceptin 之體外實驗
本實驗中，選用具有不同 HER2/neu 表現量之乳癌細胞，BT-474、SKBR-3、MDA-MB-231、
MCF-7 及 KB 細胞，進行體外實驗之探討。藉由螢光影像討論 CLIO-Herceptin 對細胞目標化 的成效。將細胞培養於六孔盤中，與 CLIO-Herceptin 培養後加入
anti-human-IgG(γ-chain)-FITC，再利用 螢 光 顯 微 鏡 觀 測 。 Herceptin 是 屬 於 IgG1 抗 體 ，anti-human-IgG(γ-chain)-FITC 是遇到 IgG1 的抗體時，會標的在 IgG1 抗體的γ-chain 上，再藉由 anti-human-IgG(γ-chain)-FITC 上的 FITC，就可以利用倒立螢光顯微鏡偵測 CLIO-Herceptin 是否有標的到細胞膜上的受器。當細胞膜上有 CLIO-Herceptin 鍵結至 HER2/neu 基因受器時，則加入 anti-human-IgG(γ-chain)-FITC 即可在螢光顯微鏡上有 FITC 的綠光表現。而為了測試並比對 CLIO-Herceptin 對不同細胞膜上受器的鍵結狀況，在本實驗 準備每一種細胞各 2 個樣品，一個加入 CLIO-Herceptin，另一個不加入 CLIO-Herceptin 將其 結果互相比對，以了解細胞膜上的受器鍵結的狀況。BT-474 及 SKBR-3 是具有 HER2/neu 基因高度表現細胞，當其遇到 Herceptin 時，Herceptin 會大量鍵結到其細胞膜表面上；
MDA-MB-231 及 MCF-7 則為少量表現之細胞，KB 則是不表現 HER2/neu 基因。由圖 15 結 果顯示，HER2/neu 基因表現量愈高的細胞其螢光表現愈亮，沒有表現 HER2/neu 基因的細胞 則無螢光反應。
圖 15. 不同 HER2/neu 基因表現量之細胞在 4°C 下與 CLIO-Herceptin 培養後，並以 anti-human-IgG(γ-chain)-FITC 追蹤所得螢光影像。
利用不同 HER2/neu 基因表現量之細胞株來測試 CLIO-Herceptin 的細胞毒性，在細胞毒性實 驗中選擇三種不同含鐵濃度：1、5、10 mM 對定量細胞(10 4個細胞)進行測試。由圖 16 細胞 毒性實驗結果顯示，當使用含有高濃度鐵的 CLIO-Herceptin(10 mM)與細胞培養，會大量抑
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制細胞生長，尤其反應在 HER2/neu 基因較多表現的細胞上，反之在低濃度下，細胞存活率 達 90%以上，此結果顯示本研究確實將 Herceptin 鍵結在氧化鐵奈米粒子上，且確實可達到 目標化作用，對於大量表現 HER2/neu 基因的乳癌細胞亦會抑制其細胞生長，換算此抑制細 胞生長濃度遠大於欲施打至動物體之對比劑濃度，此濃度下並不造成腫瘤或正常組織毒殺作 用。
圖 16. 不同 HER2/neu 基因表現量之細胞與不同濃度 之 CLIO-Herceptin 培養後，以 MTT 方法檢測細胞存活率。綠色為 BT-474 細胞；紅色為 SKBR-3 細胞；黃色為 MDA-MB-231 細
胞；藍色為 MCF-7 細胞；紫色為 KB 細胞。
在體外影像實驗中，選用不同程度 HER2/neu 基因表現的細胞株與 CLIO-Herceptin 進行培 養後，使用 3.0 T MRI 進行掃描。圖 17 為體外影像結果。由結果顯示細胞膜外層表現愈多 HER2/neu 基因受器的細胞(BT-474 及 SKBR-3)，其影像明顯變黑、訊號值下降多，相對於 較少表現 HER2/neu 基因受器的細胞(MDA-MB-231 及 MCF-7)，其影像較少變化、訊號值 下降亦不多。將實驗組細胞(BT-474、SKBR-3、MDA-MB-231 及 MCF-7)加入對比劑的訊號 除以未加入對比劑的訊號值，可得細胞影像的 enhancement(%)，分別是 75.4±2.4，70.9±1.2，
40.8±0.9 及 25.3±1.8 %，在控制組細胞(KB)加入對比劑前後，enhancement(%)無明顯變化。
另外，將磁振造影所得的體外灰階影像利用 Kodak MI 軟體進行套色，色碼圖之紅色代表 訊號值較高，往紫色方向代表訊號值逐漸下降，由彩色影像可以看出，細胞在未與
CLIO-Herceptin 培養前皆為黃綠色，與 CLIO-Hercptin 培養後，表現較多 HER2/neu 基因的 乳癌細胞(BT-474 及 SKBR-3)變為紫色，而較少表現 HER2/neu 基因的乳癌細胞
(MDA-MB-231 及 MCF-7) 則呈現藍色，不表現 HER2/neu 基因的細胞則無顏色變化仍呈 現黃綠色。
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圖 17. 不同 HER2/neu 基因表現量之細胞與 CLIO-Herceptin 在 4°C 下培養後利用 3.0 T MRI 進行造影所得之影像，並且利用光學影像軟體 Kodak MI 將灰階影像套上色譜。色
碼圖紅色部分代表訊號值較高，往紫色方向代表訊號值下降。
九、CLIO-Herceptin 之體內實驗
在動物實驗中，選擇無特定病源裸鼠(nude mice)，在其左右後腿上方接腫 SKBR-3 及 KB 細胞，待腫瘤長成約 0.5 平方公分後，由尾部靜脈注射 CLIO-Herceptin(其劑量為 20μmol/kg)，再以 3.0 T MRI 進行造影。圖 18 為注射對比劑前後一小時之影像，可由圖像 得知在 SKBR-3 腫 瘤 區 塊 有 明 顯 變 黑 現 象 ， SI pre 表示注射對比劑前腫瘤 部位的訊號強度，SI p.pre 表示注射對比劑前 phantom 的訊號強度，SI post 表示注射對比 劑後腫瘤區塊的訊號強度，SI p.post 表示注射對比劑之後 phantom 的訊號強度。由公式計算 可得知，打入對比劑後的腫瘤部位比打入對比劑前下降 45%，由結果顯示，本研究所設計合 成目標化的對比劑發揮其功效，具有標的特殊部位之效果。另外，將磁振造影所得的體內灰 階影像利用 Kodak MI 軟體進行套色，色碼圖之紅色代表訊號值較高，往紫色方向代表訊 號值下降，由彩色影像可以看出，腫瘤在未打入 CLIO-Herceptin 前皆為黃綠色，經由尾部靜 脈注射 CLIO-Hercptin 後，SKBR-3 腫瘤呈現藍紫色，代表訊號下降，而無表現 HER2/neu 基 因的乳癌腫瘤則無顏色變化仍呈現黃綠色。
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圖 18. 將接腫 SKBR-3 及 KB 腫瘤小鼠以尾部靜脈注射 CLIO-Herceptin 一小時後利用 3.0 T MRI 進行造影所得之影像，並且利用光學影像軟體 Kodak MI 將灰階影像套上色譜。
色碼圖紅色部分代表訊號值較高，往紫色方向代表訊號值下降。
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