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第一節過敏原基因之選殖
由目前所發表之←關於螞過敏車還殖的文章中，所主主用的
方法在最早期是叫氣嗚茹人血清和銷粗萃取物進行反應，發現 1 7 種螞粗萃取輪會和 19E 有反應，而其中 14 種萃取物有較強的 反應。在 Dermatophagoídes 此屬螞中，推測至少有入殺過敏 原 (Ia~g RB et a 卜， 1988 Nakanishik et a 卜. 199 0 KL Lin et a l .
， 1991~ 其分子輩分別為 10kD ， 60kD ， 55kD
, 43kD , 3fkD , 27kD , 16kD , 15kD.
至目前已於時屬之兩類家塵嘴中找出壯起的過敏尿，分
射命名 'A ])çr pI 呻 VII ， Der fI-VlIo 且也於分子生物技街的 日趨成匙，大多數鵝過敏原暴自己被選殖血來，尚未被選殖出來 的只接 Ðer
flII.IV
,V
,VI
,Ðer
pIV ， Vl 。但是 ÐerpIV
,VI
,Der
fIII 的到端序刻也已被找車，其 cDNA 全長的選殖也正在進行申 e
目前用以選殖家塵媽過敏原的常用技衛有 DNAJ家針雜交
法 (DNA probe hybridization) ，是以一段 DNA 標示放品物 質後'A據針，於基因庫中搜尋相似基因、o
Der
flcDNA 便是用此 詩找到。另外有多聚合梅鍊反應按 (PCR) ，此法是以設計好且具特異性之小Ji段 DNA 引子 (primer) 於基因庫中，利用 PCR 方法
一40 …
第一輩研究背景
放大出相似基因，而達到選殖的目的。 Der fII , Dèr fVII , Der fIII 等，便是以此法找出其 cDNA <>
此外，還有一種相當常用的方式便是菌斑社射免疫法
(plaque radioimmunoassa
汁。它亦為一種利用揉針選殖的技樹，只是所利用的樣對烏具有特異性或專一性的多抹或單棒
抗體或是氣喘病人的血清。用此法尚有一個好處，便是可以肯定 所表現出來的蛋白質，具有拉原柱。目前多數過敏犀皆是以此詩
選殖血，如 Der pI. Der pII, Der pV.Der pVII. 及其持 多異構體 (Iosform) 。
除了以上的方式外 ， Der fIII 因其接蛋白鵬的特性，也 可以用親合管拉將之純化。而第六組過敏原皆由培養基分離nQ
待。大體言之，過敏尿的純化或選殖，並其是一定的方式，而是鑽
多方的科試。
-41 一
第一節多聚合駱鍊反應法
(A)Der f cDNA 基因庫之構集
首先以修錦過的 guanidiumHCl/CsCl 方法 (Stewart
GA et a l . , 1987;Thomas WR et a l . ， 198 圳，抽取 Der f 塵媽的 mRN
A
'再以反轉婊多聚合駐反應 (RTPCR) 的方法，以最高提供試劑 (Amersham I n t e r n a t i o n Inc. ， Bucks) 將 之合成 cDNA(Gubler U et al. ， 1983). 再以磷酸化的 EcoRI 連接子 (Li n. ker_} 接舍，並構學至 λg t 11 及 λZAP 載體
中。色裝成嘩菌體後，可惡毒至宿主 YI090 或 XL 凹 1 blue 大腸
萬中， (Huynah et a 卜， 1 986 ) ，將之增殖後可加入 7% di -methyl sulfoxíde(DMSO) 立在運於- 7 0 <> C 保存。
(B)Der f λ 噬菌體的增殖
把由 (A) 訝得的 λ 噬菌體由 1 /10 依序做 100 怯稀釋於
PSB(phage sorbent buffer). 並加入一滴氯封遺於 4 0 C 4幸存。將宿主大腸菌培養於 L- 肉汁，於 37 0 C 震暈培養過夜，
次晨將之做 100 倍稀釋至新鮮 L 一肉汁，於 37 0 C 震愛培養 2-3
小時，直到 OD600 之 o
.
5 後，把菌波於 4 o C'5000rpm 離心 5 分錯，去除上清淚，加入 30ml PSB 清洗一次後，將之憨浮於一是 2
第二章材料及方法
5ml PSB 中。取 300 u 1 的雇主懸浮液，加入適量的噬菌體保存
液中，於 37
0C 孵育 30 分鐘，加入 9m145
0C 的液態 L+G 洋菜
膠混合均勻，迅遠街至 L+G 培養基土，援國 f是置於 37 0 C 孵當整 痕。次日溶菌斑形成後，加入 15ml PSB' 再直於 4 0 C 騙子支援，
吸出 PSB '於 4 oC 10000rpm 離心 1 0 分鐘，去除況嚴翰，加 數滴氯桔蓋於 4 0 C 保存，或 7%DMSO 於- 70 0 C 保存。
(C)DfλcDNA 的純化
把由( B )取得之 PSB 溶液(每盤培養基約可歸故 1 0 扒}
加入 100ul Lambdasorb phage adsorbent (promaga
， Madison.WI) 混合均勻復於室還下震盪 30 分鐘，使試劑中
Staphylococcus aureus 及兔子抗 λ 噬菌體多棒抗體的蘊含
物，和嘩菌體結合，再以 10000rpm' 5 分鐘離下來，去母土
液後用 lm1 PSB 打散沉濃物，並移至擻量離心管，以 PSB 清洗
三次，再加入噬菌體釋放 j容法( r e叫lease buffer , 10m
T r i s 咱 C 1 p 踅 7.8 10mM EDTA) 打散 i況兄揖激史物，置入 70 0 c 水浴 10 分鐘後，特噬菌體 DNA 釋放出後，以 10000rp 眩， 5 分鐘離 心去除沉澱物，再以聆/氯偉 (phenol/chloroform) 法純化 DNA: 本方法的目的是利階盼及氯信把溶液中蛋白質變性才是-k
除。首先加入等量體積的 1 e a d. e rp h e n
0 1 ( p h e n 0 1 : c h 1 0 r 0自 form: isoamyl alc 之 25:24:1) ，震最 1 分鐘，施以 1 2 000
43
rpm.3 分鐘離心，如此重稜 2 寸次，再以 chloroform{chlo
- r 0 f 0 r m : i S 0 a my 1 a 1 c
=
24 : 1 )萃取一次，之後加入 1/10 體積之 3Msodium acetate 及 2 . 5 皓體積之純酒蜻置，斗 o 0 c 沉澱 30min 再以 14000rpm 離心 15 位此，去除土清波後再以 70%酒蜻清洗一次，以去除鹽類。特乾爆後加入適量 TE 溶解 4幸存。