F 2 族群對關聯性定位的驗證

以台灣優良品種台中秈 10 號 (TCS10) 為母本，候選親本蒙古種原 Kon Suito (GN721) 為父本，雜交所得 F2種子，於2016 年 3 月種下。試驗設計為種 下F2種子500 棵，於 DAS 15 時隨機拔去 148 棵，並將剩下的 352 棵再隨機選 取半數進行低溫處理。其餘種植流程則同前述。

1. 外表型調查

幼苗根系的掃描與長度測量，皆同於本章第一節 2.外表型調查時所述。

2. 幼葉 DNA 萃取

收穫時同時收取地上部幼葉數片，經冷凍乾燥 20 小時並保存於 -20˚C 冰箱 以利後續基因型分析。以CTAB 法抽取幼葉 DNA，CTAB 萃取液的配方為 CTAB (hexade cyltrimethyl ammonium bromine) 2.0 % (w/v)、NaCl(aq) 1.4 M、

EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) 0.5 M、Tris 緩衝液 0.1 M、β-ME (2-mercaptoethanol) 0.2 % (w/v)、PVP (polyvinylpolypyrrolidone) 1~2 % (w/v)、20 mM RNAase。剪下三段幼葉約 0.02 g 裝入 2.0 mL 離心管，並加入數十顆 0.2 mm 玻璃珠共約 0.5 g，以研磨機震盪 30 秒兩次後，加入 800 μL 的 CTAB 萃取 液。接著65˚C 水浴加熱 1 小時，每 15 分鐘取出上下搖晃以利充分反應。

水浴後以 16000 xg (14299 rpm) 離心 10 分鐘，再將約 500 μL 的深綠色上 清液倒入新的1.5 mL 離心管，並加入等體積 500 μL 的氯仿/異戊醇

(chloroform/isoamylalcohol (24:1) ) 以震盪器劇烈震盪 30 秒使溶液混合，再以

16000 xg (14299 rpm) 離心 10 分鐘。接著吸取約 400 μL 的清綠色上清液至已加 μL 的 Sybrgreen (SEEBIOSCIENCE, Cat. NO: SE - 100)，倒入電泳槽並待其冷 卻。電泳條件為100 伏特、40 分鐘，結束後將膠片放置於 UV 燈上觀察 DNA

的濃度。將待測DNA 同 λ DNA 一同以 qPCR (ABI 7500 fast) 測量各待測品 picogreen 之螢光值，並計算各待測 DNA 的濃度。

3. 基因型分析

自 44K panel 的 SNP 中選出秈稻與稉稻兩次族群間多型性表現良好者，並 以能均勻散佈於水稻全基因組12 條染色體為佳，最後配合 Fluidigm 96×96 晶片 的通量，選出96 個最具代表性者作為 SNP Assay，各條染色體上所選的 SNP 依 其長度有所不同，約有6 ~ 11 個 SNP 不等，名單列於附表 3。本次 F2族群正常 處理組與冷處理組各進行兩片96×96 晶片，每片晶片的前 8 個樣品分別為 TCS10、Kon Suito、人工模擬之 F1 -1 (TCS10 × Kon Suito)、QH2O、IR64、

Nipponbare、人工模擬 F1-2 (IR64 × Nipponbare)、QH2O，以利作為對照。兩個 人工模擬之F1係分別以其兩親本picogreen 定量至 10 ng/μL 後，取等量混合而 成。每晶片可進行88 個 F2族群單株的基因型分析。

Fluidigm 96×96 晶片為可同時進行 96 個個體與 96 個 SNP 的基因型分析平 台。本組SNP Assay 中，每個 SNP 包含三組引子 (primer)，分別為 Locus Specific Primer (LSP)、Specific Target Amplification Primer (STA) 及 Allele Specific Primer (ASP)；而針對一個 SNP 兩種型式的對偶基因，分別有能與其黏 合並擴增的ASP，並帶有不同顏色的螢光片段，以利對偶基因的判別。

上晶片前先以 LSP 與 STA 兩組引子產生針對 SNP 的專一性產物，放大基 因組中SNP 所在之片段，能有效優化後續 ASP 的擴增。先將 96 組 LSP 與 96 組STA 混合為 STA Primer Mix，並稀釋為 500 nM 後，取 0.5 μL 加入 2.5 μL 的 Master Mix (Qiagen 2× Multiplex PCR Master Mix)、1.25 μL 的 DNA 液 (10 ng/μL)，再加 0.75 μL 的 QH2O 將反應體積充足至 5 μL。以此進行第一次

PCR，條件為 95˚C 15 分鐘；95˚C 15 秒、60˚C 4 分鐘共 14 循環。完成後，將 STA 產物以 45 μL 的 TE 緩衝液稀釋 10 倍後保存於 -20˚C。

將 96 個 SNP 各別的 LSP 與 ASP 混為一管，並以 TE 緩衝液稀釋為 7.5μM、20 μM 作為 SNPtype Assay Mix。後取 1.0 μL 的 SNPtype Assay Mix 加 入2.5μL 的 2× Assay Loading Reagent (Fluidigm, PN 85000736)，再加 1.5 μL 的 QH2O 將反應體積充足至 5 μL。取 0.1× 的 STA 產物 5 μL 以 45 μL 的 QH2O 再 稀釋10 倍後為 0.01× 的 STA 產物，再取 2.5 μL 的 0.01x STA 產物，加入 3.0 μL 的 Biotium 2× Fast Probe Master Mix (Biotium, PN 31005)、0.3 μL 的 SNPtype 20x Sample Reagent (Fluidigm, FN 100-6425)、0.1 μL 的 SNPtype Reagent

(Fluidigm, FN 100-3402)、0.036 μL 的 ROX (Invitrogen, PN 12223-012)，並以 QH2O 將反應體積充足至 6.0 μL 作為 Sample Mix。

分別將 SNPtype Assay Mix 與 Sample Mix 注入 Fluidigm 96×96 晶片後，將 晶片放入IFC Controller MX Load Mix，模式選擇 Load Mix，機器會將兩邊的 Mix 漸漸注下。後將晶片取出，放進 PCR Machine FC1 Cycler 進行 PCR，PCR 的條件為：樣品加熱階段70˚C 30 分鐘、25 ˚C 10 分鐘；酵素 Hot Satrt 階段 95˚C 5 分鐘；Touchdown 階段時每循環皆為 95˚C 15 秒、64˚C 45 秒、72˚C 15 秒，但每階段中的黏合 (annealing) 溫度從 64˚C 每次下降 1˚C，直至 61 ˚C，共 4 循環；擴增階段 90˚C 15 秒，60˚C 45 秒，72˚C 15 秒，共 34 循環；最後以 25˚C 冷卻 10 秒。PCR 完成後將晶片取出，放入 EP1 System 照相，選擇的螢光 為Reference Dye (ROX)、Allele 1 (FAM)、Allele 2 (HEX)，機器會自動偵測最 適曝光時間並照相。自EP1 System 存出照相的結果，其為一.bml 檔。

使用 Fluidigm 的 SNP Genotyping Analysis 軟體對其影像結果進行分析。匯 入晶片所得之.bml 檔後，於 Chip Explore 介面 Sample Setup 匯入樣品之配置清 單 (以 excel 表複製貼入)，並指定兩個 QH2O 作為 NTC；於同介面 Assay Setup

之Plate Setting 的 Mapping 下選擇 96-96 Assay-SBS96 後，匯入 96 個 SNP 的清 單。後於Chip Explore 介面下的 Detail Views 即可觀看本次基因型分析的結果，

軟體預設的分群數為3 (K = 3)，將各個體依其兩種螢光的讀值畫為散佈圖，再 將之分為三群 (圖 4)：靠近稉稻親本及對照 (Kon Suito、Nipponbare) 者會貼近 於x 軸，以紅點表示其為稉型同質結合體 (XX)；靠近秈稻親本及對照

(TCS10、IR64) 者會貼近於 y 軸，以綠點表示其為秈型同質結合體 (YY)；靠 近人工F1者則會貼近於y 軸於 x = y 的 45˚斜直線上，以藍點表示其為異質結合 體 (XY)；NTC 應靠近原點，以黑點表示。若有軟體明顯判讀錯誤者，也可手 動更改。確認基因型判讀得結果後，輸出為.csv。再以 R 語言將 XX 轉換為 A、YY 轉換為 B、XY 轉換為 H，缺值以「-」表示，並與外表型觀測值整合為 一新.csv。

圖 4 Fluidigm SNP Genotyping Analysis 軟體對基因型的判別

預設的分群數為3 (K=3)，軟體會將各個體依兩種螢光的讀值畫為散佈圖，再區 分為三種基因型；黑點代表NTC。

4. 單一分子標誌迴歸 (Single marker regression)

對所得之分子標誌作單一分子標誌的迴歸，每個分子標誌的各種型式作為 變級，即A、B、H。模式如下：

y = 𝛽₀+ 𝛽₁𝑥₁+ 𝜖 --- (3)

y 為外表型觀測值；𝛽₀為迴歸模式之截距項；𝛽₁為迴歸係數；𝑥₁為分子標誌的 型式；𝜖為殘差項。而透過 F 檢定來檢驗𝛽₁是否存在：

H₀: 𝛽₁ = 0 𝑣𝑠. H_𝑎: 𝛽₁ ≠ 0

而所得F 統計值我們將轉換為 LOD 值以表示，LOD 值係兩個迴歸模式之殘差 平方和之比值，並取10 為底的對數。第一個模式為假設分子標誌所在位置存在 QTL，即式(3)；第二個模式則假設分子標誌所在位置不存在 QTL，如式(4)：

y = 𝛽₀+ 𝜖 --- (4)

LOD =^𝑛

2× log₁₀(^{𝑆𝑆𝑒0}

𝑆𝑆𝑒1) --- (5)

式(5)中，SSe0代表式(4)的殘差平方和；SSe1代表式(3)的殘差平方和。兩模式殘 差平方和的比值，為模式中加入此分子標誌後對外表變異解釋的提升量，可視 為QTL 存在與否的指標。F 值與 LOD 的轉換如式(6) (Broman and Sen, 2009)：

F = (10^{𝑛2×𝐿𝑂𝐷} − 1)(^{𝑛−𝑑𝑓−1}

𝑑𝑓 ) --- (6)

將 F2族群各單株外表型觀測值及其基因型資料 (A、B、H) 之.csv 輸入 R 語言。以函數lm() 運算各分子標誌的迴歸模式，並以函數 anova() 取出其 F 統 計值與P-value。再將 F 統計值轉換為 LOD 值後繪圖觀察。