一般來說，顯微技術可分為電子顯微鏡以及光學顯微鏡。電子顯微鏡解析度 較光學顯微鏡來得好很多，可達 10-10-10-11 m 的解析度，但缺點是只能觀察樣本表 面，且樣本必須經過特別處理並只能在真空下觀察，無法觀察活體生物樣本[1]。
而光學顯微鏡的好處是光可被聚焦於生物樣本較深處而不會有太大散射，可直接 用來觀察活體樣本，但缺點則是解析度較差，大約是 10-6-10-7 m [1]. 在雷射掃描顯 微技術中，雷射光會被物鏡聚焦成一個光點，以此光點掃描樣本，可取得樣本影 像。但由於光波繞射的關係，此光點無法被聚成無限小，而是有個極限，被稱為 繞射極限。若以此有限大小的光點來掃描樣本，所獲得的影像解析度將會受到限 制。此極限可由 Abbe 於 1873 年發表的顯微鏡解析度公式決定：
d NA
2
(1.1)
其中，d 是顯微鏡系統的解析度，λ 是使用的激發波長，NA 是數值孔徑(numerical aperture).
1.1 Background
最近十年來，能克服光波繞射極限之超解析遠場螢光顯微技術，已成為熱門 研究對象，因為它們在生醫研究上，尤其是細胞活動的解析上，可有許多應用方 面的應用潛力。例如：使用光敏定位顯微術(photoactivated localization microscopy, PALM)可以奈米級解析度觀察到細胞器 lysosome 和 mitochondrion 中之特定蛋白質 標定物(例如：vinculin, actin)之分佈[2]。而使用隨機光學重建顯微術(stochastic
optical reconstruction microscopy, STORM) 則 可 解 析 出 BS-C-1 細 胞 中 之 微 管 (microtubules)和腦中之神經突觸(synapse)的分佈型態[3, 4]。在多種超解析螢光顯微 技 術 中 ， 我 們 主 要 選 擇 受 激 放 射 耗 乏 顯 微 術 (stimulated emission depletion microscopy, STED microscopy) [5]來做研究，因為它容易與共軛焦雷射掃描系統 (confocal laser scanning system)做結合[6, 7]，而能提供快速掃描[8]以及光學切片能 力[9]，目前在活體觀察和 3D 奈米成像[9]方面皆有許多方面的應用。透過兩道雷 射分別入射至樣本並利用受激放射原理對螢光分子做光學操縱，來達到超解析成 像的受激放射耗乏顯微術，目前已可達僅僅只有數十奈米的解析度[1]，是生物醫 學研究上，例如活體神經突觸觀察的好工具[10-12]。由於受激放射耗乏顯微術與 其它超解析螢光顯微技術(例如：飽和結構光學顯微術[13], 光敏定位顯微術[2], 隨 機光學重建顯微術[14]等)相比之下所具有的許多優勢，如 Fig. 1.1 [1]所示，由於受 激放射耗乏顯微術於活細胞中可達之空間以及時間解析度高，因此吸引我們以它 作為我們的研究題材。
Fig. 1.1 受激放射耗乏顯微術(STED microscopy)除了解析度可達數十奈米，其時 間解析度(temporal resolution)可達 100 - 101秒的數量級，甚至可達 28 frames/s (即 10-2 秒的數量級[8])。GSD: 基態耗乏(ground-state depletion); SSIM: 飽和結構光學
顯 微 術 (saturated structured-illumination microscopy); PALM: 光 敏 定 位 顯 微 術 (photoactivated localization microscopy); STORM: 隨機光學重建顯微術(stochastic optical reconstruction microscopy); NSOM: 近 場 掃 描 式 光 學 顯 微 術 (near-field scanning optical microscopy); EM: 電 子 顯 微 術 (electron microscopy); ND: not determined; NA: not applicable
1.2 Motivation
在操作受激放射耗乏顯微術時，根據不同樣本，需選擇螢光放光波長適當且 光穩定性佳(例如：可連續接受高強度雷射照射而不易光漂白、飽和強度低而使得 螢光易被耗乏光耗乏)之螢光分子來標定樣本。例如：鑽石結構會發螢光之 nitrogen vacancies 材料，就以其能承受高強度激發光以及耗乏光照射聞名，而可用此標定 物達到 6 nm 的解析度[15]。目前已知有些金屬奈米粒子(metallic nanoclusters, NCs) 可發螢光[16]且比起一般有機染劑有較少的光漂白(photobleach) [17]. 然而，目前並 無文獻探討這些螢光金屬奈米粒子於受激放射耗乏顯微術中應用之可能性。加上 考慮到此螢光標定物需能配合生醫相關研究，因此我們選擇了胰島素金奈米粒子 (insulin-gold nanoclusters, IGNCs)作為我們的研究材料[16]，並評估以 IGNCs 搭配 受激放射耗乏顯微術之應用潛力。
利用受激放射耗乏顯微術掃描樣本的過程中，我們需要一道實心的激發光 (excitation beam)去激發樣本，以及另一道甜甜圈形狀的耗乏光(depletion beam)趁螢 光分子尚未自發螢光前引導外圍的螢光分子做受激放射(stimulated emission)，如 Fig. 1.1。沒有受到耗乏光影響的中心區域，發光機制仍是自發放射(spontaneous emission). 而受到耗乏光影響的外圍區域，發光機制則是受激放射。最後將會以偵
測器收光(若為雷射掃描，通常是搭配光電倍增管收光)，而偵測器前會放置濾光器 (filter)將受激放射的訊號過濾掉，只收自發螢光訊號。因此從偵測器的角度看，可 視為是原本的自發螢光被耗乏光給關掉了
Fig. 1.2 STED microscopy 原理示意圖
為了預測受激放射耗乏顯微術的解析度，Harke 利用拋物面形狀的強度分布，
來近似耗乏光在焦平面上的強度分布，而推導了受激放射耗乏顯微術之解析度公 式[18] (詳細內容將於第 2 章做說明)，一般寫為[7]：
s d e p c o n f o c a l S T E D
I I d d
1
(1.2)
dSTED和 dconfocal分別代表受激放射耗乏顯微術與共軛焦顯微術的解析度。Idep代表
耗乏光的強度。Is則是飽和強度(saturation intensity), 被定義為當螢光被關掉一半時，
此時所對應到的耗乏光強度，並且不同的螢光分子通常會有不同的飽和強度。根 據 Eq. (1.2)我們可推論，若耗乏光強度越高，或所搭配的螢光標定物容易被激發及 耗乏(若 Is低則易被耗乏)，影像解析度將會越好。然而，在此條件下，我們所使用 的螢光標定物將必須具備絕佳的光穩定性以承受強耗乏光照射。又或者，我們可 搭配 Is值較低之螢光標定物，如此一來，將可用較低強度之耗乏光執行受激放射 耗乏顯微術，而不會對樣本造成太大傷害。而檢驗材料之螢光是否呈現絕佳光穩 定性或者易被耗乏，便成為我們在研究中的主要目標。
前文已提到過我們選擇了 IGNCs 作為研究材料。至於為什麼會挑選 IGNC 作 為研究材料的主要原因，除了螢光金奈米粒子比起一般有機染劑有較少的光漂白 之外，也是因為有文獻報告指出，IGNC 的自發螢光生命期(lifetime)約為 2 μs [16], 比一般螢光染劑還要來得長(~ 10-9 s). 而根據 Eq. (1.3) [19]:
l i f e t i m e s
I hc
(1.3)
長的生命期將會導致較小的飽和強度。Eq. (1.3)中，Is是飽和強度，h 是 Planck 常 數，c 是光速，λ 是激發光的波長，σ 是螢光分子的吸收截面(cross section), τlifetime 是螢光分子的生命期(lifetime). 因此，在本論文的研究中，我們才會選擇 IGNCs. 至 於有關 IGNCs 的詳細介紹以及合成方式，將會於第 3 章提到。
1.3 Aim
此論文中，我們將檢測 IGNCs 其受激放射耗乏特性(自發螢光是否會因為耗乏 光的加入，而有螢光被耗乏的效應發生)、飽和強度(saturation intensity)、光穩定性 (利用耗乏光對 IGNCs 之自發螢光做連續開關操作之後，螢光訊號是否仍能維持穩
定)，並與常用於受激放射耗乏顯微術之其它螢光標定物(如 Atto565)做比較，評估 利用 IGNCs 搭配受激放射耗乏顯微術之應用潛力。