Megasphaera只有兩種菌種從猪場分離出來(Holt et al., 1994)，屬於化學異營的厭氧菌，經由厭氧發酵乳酸鹽產生乙 酸，丙酸以及揮發性脂肪酸等，並且也可經由發酵含硫氨基 酸來產生含硫化合物，該菌種理想生長環境為接近中性 pH≒
7.4 溫度為 25-40℃(Jun Zhu et al., 1999)。
表三、乳酸菌之分類-依其形狀與其發酵途徑 球菌 桿菌
同源發酵
C6H12O6 Æ 2CH3-CHOH-COOH
Streptococcus cremoris Thermobacteria
S.diacetilactis、S.faecalis Lactobacillus lactis
S.salivarius、S.thermophilus L.helveticus、L.acidophilus S.lactis、S.pyogenes L.bulgaricus、L.derbruckii Pediococcus cerevisiae L.casei、L.plantarum
Sporalactobacillus inulinus Streptobacteria
異源發酵
C6H12O6 Æ CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2OH + CO2(或 CH3-CHOH)
Leuconostoc mesenterodis Betabacteria、Lactobacillus brevis
L.cremoris L.viridescens、L.fermentum Bifidobacterium bifidum (Ewing & Cole , 1996)
葡萄糖
表四、養猪場主要菌種生長最適溫度以及 pH
bacterial genera pH Temperature(℃)
Streptococcus 4.0-9.6 37
Peptostreptococcus 6-8 25-45(35-37) Eubacterium 6.5-7.5 20-45(37) Lactobacilli 3.6-6.4 2-53(37) Clostridium 6.5-7 15-69(30-37) Propionibacterium 6.5-7.5 30-37(35) Escherichia 4.4-9.0 37
Bacteroides 5.0-8.5 25-45 Megasphaera 7.4-8.0 25-40
(Jun , 2000)
表五、養猪場主要微生物種類及產生臭味的成分
Bacterial genera potential odorous compounds
Streptococcus formic, acetic, propionic, butyric acids, ammonia and volatile amines
Peptostreptococcus formic, acetic, propionic, butyric acids,iso-butyric, valeric, caproic, iso-valeric, ammonia and volatile amines, iso-caproic acid
Eubacterium formic, acetic, propionic, butyric acids,iso-butyric, valeric, caproic, iso-caproic acid, indole and phenols Lactobacilli formic, acetic, propionic, butyric
acids,
Escherichia formic, acetic, propionic, butyric acids, Indole
Clostridium formic, acetic, propionic, butyric acids, iso-butyric, valeric, caproic,
iso-valeric, iso-caproic acid, indole and phenols
Propionibacterium formic, acetic, propionic, butyric acids, iso-butyric, valeric, caproic,
iso-valeric, iso-caproic acid, ammonia and volatile amines
Bacteroides formic, acetic, propionic, butyric acids, iso-butyric, valeric, caproic,
iso-valeric, iso-caproic acid, ammonia and volatile amines
Megasphaera formic, acetic, propionic, butyric acids, iso-butyric, valeric, caproic, iso-caproic acid, volatile S-contaning compounds
Jun and Larry (1999)
参、材料與方法
一、實驗材料
本實驗菌株取得方式為經由食品工業研究所購買，包含 Lactobacillus acidophilus (BCRC14065)、Lactobacillus casei.subsp.rhamonus (BCRC12249)、兩株枯草菌 Bacillus subtilis var.Natto (BCRC 14716) 以及Bacillus subtilis var.Natto (BCRC 17435)以及益生菌Enterococcus faecium (BCRC 12302)等，共五株菌株。
二、實驗器材
1. Gastec GV-100 檢知器(GASTEC Corporation , Japan)
圖五、檢知器介紹圖
圖六、檢知器細部分解圖
上圖為檢知器細部分解圖，內部含有一單向活塞以及逆 止閥，防止空氣回流，當抽取空氣時，內部呈現負壓狀態，
使得空氣經由檢知管流入管中，當空氣進入檢知管之後，檢 知管會產生化學反應產生變色，檢視變色範圍來測得所欲偵 測目標的氣體濃度。
2. Gastec 系列空氣檢知管
依照所偵測的氣體以及濃度，有不同型號的檢知管來搭配，
以下型號是本實驗所需要用到的檢知管：
型號 檢測類別 檢測濃度範圍 3L Ammonia 0.5 to 78 ppm 3La Ammonia 2.5 to 200 ppm 4HM Hydrogen sulfide 25 to 1600 ppm 4L Hydrogen sulfide 1 to 240 ppm 4LT Hydrogen sulfide 0.1 to 2 ppm 60 Phenol 0.4 to 1 ppm 81L Acetic acid 0.1 to 10 ppm 81L Butyric acid 0.1 to 30 ppm 180 Amines 5 to 100 ppm 180L Amines 0.5 t0 5 ppm
圖七、檢知管外觀圖
圖八、檢知管細部圖：依照變色程度對照刻度，來判別所偵測的氣體 濃度
3.檢知器使用方法:圖九為檢知器使用步驟
圖九 將檢知管與檢知器組裝
續圖九 (1) 抽氣使空氣流入檢知管
續圖九 (2) 讀取變色範圍對照刻度，紀錄數值
4. 檢知管變色原理及使用介紹：
使用環境限制：
(4)丙酸(butyric acid):
dioxide)、甲酸(formic acid)會增加 5%以內的誤差。
(5)硫化氫(hydrogen sulfide):
3 壓力依照使用環境壓力換算,
三、藥品及培養基:
7. Brain heart infusion agar (Scharlau 12643) 8. Lactobacilli MRS broth （DIFCO 0881）
9. MacKonky agar (Difco 0075)
10.Muller & Hinton agar (Himedia M-173) 11.Molasses culture solution
(1) Molasses 20.0 ml
14.甘油保存液
(1) 65% (v/v) glycerol (2) 0.1M MgSO4
(3) 0.025 M Tris-Cl, pH 8.0
四、實驗方法:
1. 益生菌培養:
a. 利用食品工業研究所購買的乳酸菌菌株，Lactobacillus acidophilus (BCRC14065)、Lactobacillus
casei.subsp.rhamonus (BCRC12249)、兩株枯草菌
Bacillus Subtilis var.Natto (BCRC 14716) 、Bacillus Subtilis var.Natto (BCRC 17435)以及益生菌
Enterococcus faecium (BCRC 12302)等五株菌株，將冷 凍乾燥菌粉以專用培養液稀釋(附錄 B)，將其分別培養於
成品
食工所購買菌株 以專用培養液將菌粉溶解 接種於300ml培養液隔夜培養
300ml菌液接種于5L培養液 倒入50公升醱酵槽培養 將醱酵液分裝為10等份 醱酵液接種于300公升醱酵槽培養
菌液倒入20公升儲存桶儲存，放 置5-10℃冷藏庫儲存
BCRC 14065 BCRC 12249 BCRC 14716 BCRC 12302 BCRC 17435
圖十、益生菌醱酵培養流程圖
圖十一、五十公升醱酵槽
圖十二、300 公升益生菌醱酵槽
圖十三、將醱酵液分裝於 20 公升儲存桶，置於 5-10℃冷藏庫儲存
五、實驗室測試: 菌液並且塗滿 Muller-Hinton agar plate，並將沾上試驗 菌液的紙片放置中心，觀察生長情形。
2. 空氣臭味抑制實驗:
(1)選擇指標氣體:
養猪場臭味濃度與揮發性脂肪酸(VFAs)濃度強弱有相 關，當 VFAs 濃度越高整體臭味的濃度也一起增加(John, 2005)。在 VFAs 當中乙酸(acetic acid)以及木酸
(propionic acid)分別佔有總量的 70%以及 20%左右(Jun et al. 1999)。除此之外硫化氫(H2S)、氨(NH3)以及胺類 (amines)等也有同樣的關係(McCrory et al., 2001)，而 來自 VFAs 臭味不完全跟 VFAs 總濃度有線性關係，但與丙 酸(butyric acid)有線性關係(Kenneth et al., 2007)。
利用與空氣臭度增減具有相關性的氣體來分析空氣臭味抑
且與臭味濃度有相關性，可做為指標性氣體。實驗方法以
表。
液，實驗組則是糞尿混合液並添加 1ml 的益生菌，並置 於培養箱培養 5 天，觀察血清瓶中濃度變化情形，實驗 進行三重複，以所做實驗數據平均值做成圖表。
6 添加益生菌對於抑制糞尿混合液產生臭味分析:
本實驗討論當糞尿混在一起時益生菌是否能夠有 效的抑制其他雜菌所產生的臭味氣體。將糞便以及尿液 50:50 g/v 混合，放入血清瓶，糞便以及尿液來源為母 猪舍新鮮糞尿，取得後在三十分鐘內進行實驗。對照組 為母猪舍的糞尿混合液，實驗組則是糞尿混合液並添加 1ml 的益生菌，並置於培養箱培養 5 天，觀察血清瓶中 濃度變化情形，實驗進行三重複，以所做實驗數據平均 值做成圖表。
圖十四、實驗室測試架構圖
圖十六、利用血清瓶測試進行尿液臭味抑制試驗
圖十七、利用血清瓶測試進行糞便臭味抑制試驗
3.益生菌液對於大腸菌生長影響
將益生菌混合液，與母猪舍糞便混合，觀察益生菌對 於糞便中大腸菌生長影響。糞便來源為母猪舍的糞便，實 驗前先測定所採集的糞便每公克的含菌量，並將糞便分為 兩組，每組糞便重量為 5g，分別為糞便、糞便加上 100 μL 無菌水、糞便加上 100μL probiotcs，以及糞便加 上 1mL 無菌水、糞便加上 1mL probiotcs，而後將實驗物 品放置於 37℃培養箱培養 3 天，實驗進行三重複，並觀 察大腸菌菌落生長情形，並計算成長倍率。
六、 野外測試
測試堆肥舍環境 檢測堆肥舍指標氣體濃度是否穩定
否 等到堆肥舍氣體穩定在進行對照組試驗 是 進行對照組試驗(噴灑地下水試驗)
停止試驗 7 天 偵測指標氣體是否回歸穩定
否 等待堆肥舍氣體回歸穩定 是 進行對照組實驗(噴灑益生菌)
圖十八、堆肥舍臭味濃度測試流程圖
圖十九、益生菌噴灑裝置圖，分別為 1000 公升儲水桶以及噴霧器
圖二十、密閉式堆肥舍外觀圖
圖二十一、堆肥舍內部，頂部設有噴水頭可將液體平均噴灑於室內
2. 保育舍測試
保育舍為離乳幼猪開始獨立生活的地方，為一半密閉空 間，由於仔猪抵抗力較弱，保育舍床面有空隙使糞便不會堆 積在床面，因此可以保持床面清潔，使疾病不易發生。由於 保育舍清洗時間間隔較長，相較於種猪區、母猪區、高床區、
以及產房等，臭味條件相對穩定，因此挑選為測試地點。
實驗分為三組，空白組、對照組以及實驗組。空白組只 偵測保育舍氣體，不做任何處理。對照組則是將地下水噴灑 於保育舍當中，地下水的含菌量為 8 CFU/100ml，大腸菌則是 未被驗出。噴灑時間為一分鐘，出水量為 24.6 L/min。每日 上午 9 時先偵測保育舍的氣體濃度，10 時進行噴灑，下午 5 時偵測噴灑後濃度差異。
實驗組實驗方法則是將 20 公升混合益生菌液投入 1000 公升儲水桶，將菌液由 20 公升稀釋至 1000 公升，此時菌液 濃度約為 6.4×107 cfu/ml。再將稀釋後的益生菌液噴灑於保 育區當中，噴灑時間為一分鐘，出水量為 24.6 L/min。每日 上午 9 時先偵測保育舍的氣體濃度，10 時進行噴灑，下午 5 時偵測噴灑後濃度差異，實驗進行三重複，以數據平均值作 成圖表，增加準確度。
偵測保育舍指標氣體濃度 清洗保育舍 進行 對照組試驗(噴灑地下水試驗) 清洗保育舍
進行實驗組測試(噴灑益生菌) 清洗保育舍 實驗進行三重複
圖二十二、保育舍臭味濃度測試流程圖
圖二十三、保育舍外觀圖
偵測三天
偵測三天
偵測三天
圖二十四、保育舍內部圖
圖二十五、保育舍細部，由於保育舍清洗時間較長，因此床下會有糞
肆、實驗結果
ㄧ、對峙培養試驗:
益生菌與E.coli進行對峙培養試驗結果，圖二十六為枯 草菌Bacillus subtilis var.Natto (BCRC 14716)，由於枯草 菌具有游走性質，因此會產生向外擴張而成為不規則菌落，將 枯草菌生長範圍內的菌落挑出，並利用革蘭氏染色(Gram stain) 進行鏡檢，結果顯示為純菌株，無其他雜菌交雜其中，因此枯 草菌生長擴散範圍內皆無E.coli生長，推斷該株菌株具有抑 制E.coli增生效果。
圖二十六、枯草菌Bacillus subtilis var.Natto (BCRC 14716)對 峙培養情形，無明顯抑制環產生，枯草菌生長範圍內，E.coli無法 生長
圖二十七則為枯草菌Bacillussubtilis var.Natto (BCRC 17435)對峙培養結果，除了因為具有游走特性而產生不規則菌 落之外，並且產生一圈明顯的抑菌環，抑菌環的寬度為 2 ± 0.5 mm。將枯草菌生長範圍內的菌落挑出，並利用革蘭氏染色(Gram stain)進行鏡檢，結果顯示為純菌株，無其他雜菌交雜其中，
因此枯草菌生長擴散範圍內皆無E.coli生長。
圖二十七、枯草菌Bacillus subtilis var.Natto (BCRC 17435)對 峙培養情形，具有明顯抑制環產生，枯草菌生長範圍內，E.coli無 法生長
圖二十八則為益生菌Enterococcus faecium (BCRC 12302) 對 峙培養結果，抑菌環寬度為 4 ± 1 mm。
圖二十八、Enterococcus faecium (BCRC 12302) 對峙培養結果
圖二十九為乳酸菌Lactobacillus acidophilus (BCRC14065) 對峙培養結果，抑菌環呈現不規則狀，寬度約為 1.5 ± 0.5 mm
不等，acidophilus 能夠分泌過氧化氫的抗菌物質，具有抗菌作
用。
圖二十九、乳酸菌Lactobacillus acidophilus (BCRC14065) 對峙 培養結果
圖三十為乳酸菌Lactobacillus casei.subsp.rhamonus (BCRC12249) 對峙培養結果，抑菌環產生較不明顯，但仍然有 抑制E.coli 效果，寬度約為 3 ± 0.5 mm，此株細菌能夠分泌 大量的酸性物質，因此可以有效酸化猪舍環境，讓猪場環境當 中雜菌較不容易增生。
圖三十、乳酸菌Lactobacillus casei.subsp.rhamonus (BCRC12249) 對峙培養結果
二、 空氣臭味抑制實驗 Feces Urine Autoclave Probiotics Blank 0g 100ml Yes Not added
Test 0g 100ml Yes 1ml Blank Blank
Blank
(5 days later) Test Probiotics
Probiotics
圖三十一、益生菌在無菌尿液臭味產生分析
(2) 添加益生菌對於抑制尿液產生臭味分析 Feces Urine Autoclave Probiotics Blank 0g 100ml No Not added
Test 0g 100ml Yes 1ml Blank Blank
Blank
(5 days later) Test Probiotics
Probiotics
圖三十二、益生菌在對於抑制尿液臭味產生分析
(3) 益生菌在糞便中所產生臭味之分析
(3) 益生菌在糞便中所產生臭味之分析