第五章 實驗結果
5.2 NIH-3T3 細胞生長週期
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圖 5-2 細胞存活曲線
由細胞生長曲線我們可以發現正常細胞於九十六小時時達生長 頂峰，當九十六小時以後慢慢的細胞逐漸凋亡，這是由於細胞培養液 內的養份已經逐漸消耗完畢接著培養液內細胞所產生的有毒代謝物 濃度亦逐漸提高使得細胞凋亡速度加快，所以一般細胞培養通常在第 三天也就是 72 小時左右就必須重新分盤加入新的培養液，使得細胞 有足夠生長空間與充足的養分來成長。
5.3 MTT assay細胞活性測試
三種氧化鋅奈米粒子在不同濃度下之細胞活性測試
在本實驗中，我們分別對三種尺寸的奈米粒子做不同時間及不同 濃度下對細胞活性的影響，由下圖的結果可知，低濃度劑量(～<9ppm)
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的奈米粒子對細胞活性沒有產生任何毒性而使細胞凋亡，而半致死劑 量濃度(LC50)在四個實驗時間點皆介於9～18ppm之間，超過半致死 劑量濃度(20ppm)則幾乎全部因奈米粒子的毒性而凋亡。我們也發現 隨著奈米粒子作用時間的增加，半致死劑量有往左位移的趨勢
，即細胞數量隨著粒子作用時間的增加逐漸凋亡減少，因此僅需較小 的粒子濃度即可達到半致死劑量。此外我們也發現奈米粒子的尺寸越 小，對細胞的毒性越大。
（a）12hr
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（b）24hr
（c）48hr
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（d）72hr
圖 5-3（a）12hr MTT 細胞存活曲線（b）24hr MTT 細胞 存活曲線（c）48hr MTT 細胞存活曲線（d）72hr MTT 細 胞存活曲線
5.4 Cytochalasin D 對於氧化鋅奈米粒子毒性之影響
• Cytochalasin D is a cell-permeable fungal toxin which binds to the barbed end of actin filaments inhibiting both the association and dissociation of subunits.
• Molecular Formula: C30H37NO6
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圖 5-4 Cytochalasin D 化學結構式
• Molecular Weight: 507.6
5.5 Cytochalasin D 對於奈米粒子於細胞毒性之測試
• Cytochalasin D 的 MTT 測試
（a）20nm
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（b）150nm
（c）700nm
圖 5-5 Cytochalasin D MTT 測試圖（a）20nm（b）150nm
（c）700nm
由
Cytochalasin D 的 MTT 測試我們可以發現在 24 小時內，Cytochalasin D 對於三種尺寸的奈米粒子對細胞所造成的毒性皆有
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一定的減緩作用，由圖 5-5（a）、（b）、（c）可以發現於 24 小時內 有加入 Cytochalasin D 的細胞存活率很明顯的高於只有 ZnO 奈米 粒子，當 48 小時以後可以發現加入 Cytochalasin D 的細胞存活率 反而低於單純只加奈米粒子的存活率，對於這種情形我們推測有 可能是於 24 小時內 Cytochalasin D 已經被細胞吸收完了所以療效 減低並且由於 Cytochalasin D 本身亦有一定的細胞毒性，在此時因 為療效已消失且 Cytochalasin D 的毒性亦顯現出來，再加上奈米粒 子的毒性雙重作用下使的細胞存活率比只有奈米粒子的還要低。
5. 6 Cytochalasin D 的 SEM
• ZnO：20nm（24hr）
a b
c d
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圖 5-6.1（a）24hr 時正常細胞（b）加 20nm ZnO 的細胞於 24hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 20nmZnO 的細胞於 24hr（d）24h 時單獨
只加 Cytochalasin D 的細胞
• ZnO:20nm（48hr）
圖 5-6.2（a）48hr 時正常細胞（b）加 20nmZ nO 的細胞於 48hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 20nmZnO 的細胞於 48hr（d）48hr 時單獨
只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
c d
42
• ZnO：20nm（72hr）
圖 5-6.3（a）72hr 時正常細胞（b）加 20nm ZnO 的細胞於 72hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 20nmZnO 的細胞於 72hr（d）72hr 時單獨
只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
c d
43
• ZnO：150nm（24hr）
圖 5-7.1（a）24hr 時正常細胞（b）加 150nm ZnO 的細胞於 24hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 150nmZnO 的細胞於 24hr（d）24hr 時單
獨只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
d
c
44
• ZnO：150nm（48hr）
圖 5-7.2（a）48hr 時正常細胞（b）加 150nm ZnO 的細胞於 48hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 150nmZnO 的細胞於 48hr（d）48hr 時單
獨只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
c d
45
• ZnO：150nm（72hr）
圖 5-7.3（a）72hr 時正常細胞（b）加 150nm ZnO 的細胞於 72hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 150nmZnO 的細胞於 72hr（d）72hr 時單
獨只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
c d
46
• ZnO：700nm（24hr）
圖 5-8.1（a）24hr 時正常細胞（b）加 700nm ZnO 的細胞於 24hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 700nmZnO 的細胞於 24hr（d）24hr 時單
獨只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
c d
47
• ZnO：700nm（48hr）
圖 5-8.2（a）48hr 時正常細胞（b）加 700nm ZnO 的細胞於 48hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 700nmZnO 的細胞於 48hr（d）48hr 時單
獨只加 Cytochalasin D 的細胞
a b
c d
48
• ZnO：700nm（72hr）
圖 5-8.3（a）72hr 時正常細胞（b）加 700nm ZnO 的細胞於 72hr 時 （c）加 Cytochalasin D 於 700nmZnO 的細胞於 72hr（d）72hr 時單
獨只加 Cytochalasin D 的細胞
藉由以上的細胞的 SEM 圖，我們可以明顯發現無論是 20nm、
150nm 或是 700nm 的 ZnO 奈米粒子於均會使得細胞的 morphology 產 生改變，由於四十八小時的 SEM 圖可以很明顯的看出細胞培養液中 加 入 奈 米 粒 子 時 ， 細 胞 會 產 生 圓 形 的 類 似 Endocytosis 或 是 Exocytosis 的現象
a b
c d
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這些圓形的類似腫瘤的外型平均直徑大約數μm，這個大小遠大 於我們所使用的奈米粒子直徑，因此我們推論這個東西不是奈米粒 子，而有可能是奈米粒子對於細胞造成的毒性而使 morphology 產生 改變，亦有可能是細胞的 Endocytosis 或是 Exocytosis，但是因我們 無法確認，所以這一部份是將來必須要加以確認的。
而由圖 6-4、6-5、6-6 均可發現當含奈米粒子的細胞培養液再加 入 Cytochalasin D 時可以發現原先細胞表面的圓形 morphology 消失了
a b
c
圖 5-9（a）20nm ZnO 中細胞局部放大（b）150nm ZnO 中細胞局部 放大（c）700nm ZnO 中細胞局部 放大
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有些細胞甚至恢復了較接近原先正常的 morphology，由此我們可知 Cytochalasin D 對於奈米粒子毒性有減低的效果，這個現象的原理是 以後所必須探討的，而若培養液中只有 Cytochalasin D 而無奈米粒子 時，也可以發現細胞的 morphology 也是有相當程度的改變，這亦可 證實我們之所說的 Cytochalasin D 也是有毒性的。
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