2.1 化學合成方法
2.1.5 N -benzyl-N-cyclohexylbenzamide (3) 之製備
以 合 成 出 的 N-benzylcyclohexanamide 接 續 下 一 步 的 benzoylation, 嘗 試 以
N
-benzyl-N-(cyclo-2-enyl)benzamide (2)的合成方法以及之前所發表相似產物的合成條件,來進行測試, 發現因六圓環所造成的立體障礙以及二級胺的質子不易解
離的情況下,在 mild base 和室溫之下的溫和反應條件,是無法使得二級胺去質子
化,必須採用較強的鹼以及較高的反應溫度才能勉強進行 benzoylation; 並加入
0.1eq KI, 其在溶液中解離出的 iodide 來置換 benzoyl chloride 形成 benzoyl iodide, iodide 為比 bromide 更好的 leaving group, 如表二; 以 Entry 5 條件反應一天後, 用MeOH 終止未反應的 sodium hydride ,再直接減壓濃縮抽乾,之後用 NaHCO3中 和crude,接著以 DCM 萃取濃縮後以逆向的 HPLC 分離 (mobile phase : ACN/H2O
= 3/1)得到純的化合物。
Entry Solvent Base Equivalence Time Temp. Yield
1. DCM Et
3N 3 1 day R.T. N.R.
2. DCM Et
3N/pyr. 1/0.1 1 day R.T. N.R.
3. DCM Et
3N/DMAP 1/0.1 1 day R.T. N.R.
4. THF NaH 1.1 1 day R.T. N.R.
5. DMF NaH 1.5 1 day 60℃ 6%
表二、N -benzylcyclohexanamide 進行 benzoylation 之條件嘗試
NH
N O
57 3
Reagents and conditions : benzoyl chloride, sodium hydride, KI, DMF, 60℃, 1day, 6% for one step.
路徑七、 N
-benzyl-N-cyclohexylbenzamide (3)之合成路徑之一24
由於以SN2 的方法進行 benzoylation 所花費時間太長, 且產率不高,所以重新更 改設計合成路徑,以原本的 N-benzyl-N-(cyclo-2-enyl)benzamide (2)做為起始物, 用 palladium on activated carbon 當非勻相催化劑對雙鍵做直接的氫化還原,以 RP-TLC (mobile phase : ACN/H2O = 1/2) 確認反應是否結束之後, 用 celite 除去 Pd/C, 以 Methanol 沖洗後減壓濃縮, 再用 flash column 以 EtOAc/ Hexane 系統純 化得到純的 N-benzyl-N-cyclohexylbenzamide (3) ; 由於此方法可以避免六圓環所
造成的立障過大而無法使 secondary amine 去質子化的問題, 因此可以大幅提升
Reagents and conditions : Palladium on activated carbon, Methanol, hydrogen gas (1 atm).
路徑八、 N-benzyl-N-cyclohexylbenzamide (3)之合成路徑之二
25
26
Percentage of inhibition (Inh%) at 10 µg/ml concentration. Results are presented as mean ± S.E.M.(n=3 or 4). aConcentration necessary for 50% inhibition (IC50)
由表三我們可以歸納出下列四點:
27
p
-OMe 的 2 倍, 因此結合第 1, 2 點做出歸納出 benzyl group 上的取代位置對 抗發炎活性的影響程度為 ortho＞meta＞para。4. 除了化合物 29、30 呈現在雙鍵消失後, 抗發炎活性上升外, 其餘化合物都呈
現活性下降的趨勢; 值得注意的是化合物 6 對比化合物 5 的抗發炎活性雖略
微下降, 但對照其他化合物, 也表現出優異的抗發炎活性(IC50 = 0.19±0.03 µg/ml), 顯示出 ortho-position 的重要性。
28
11 20.67±0.26 10.37±0.55 16.68±0.49 18.67±0.22
12 31.30±0.94 (－)
14 23.47±0.14 10.63±0.28 19.09±0.80 20.51±0.17
15 11.24±0.40 12.48±0.40
17 22.61±0.31 14.82±0.98 17.31±0.70 20.57±0.35
18 10.39±0.70 12.17±0.35
20 10.01±0.18 10.46±0.16 10.02±0.06 10.31±0.13
21 5.82±0.51 13.09±0.24
23 23.02±0.15 10.70±0.24 11.16±0.51 16.45±0.33
24 6.78±0.38 11.38±0.44
26 27.42±0.89 20.52±0.18 18.99±0.53 24.53±0.50
27 14.06±0.14 20.71±0.81
29 25.03±0.12 18.50±0.43 20.22±0.14 22.66±0.05
30 8.59±0.18 11.56±0.14
32 (－) (－) (－) (－)
29
33 23.15±0.66 (－)
35 (－) (－) (－) (－)
36 (－) (－)
38 12.74±0.40 13.98±0.41
39 13.13±0.28 13.67±0.55
40 31.36±0.40 (－)
41 (－) (－)
(－): ED50 ＞40µg/40ml Cell line:
HEp-2: Human laryngeal carcinoma Hep G2: Human heptocellular carcinoma MCF-7: Human breast adenocarcinoma A549: Human lung carcinoma
表四、化合物 2 , 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14,15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27 29 , 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41 之抗癌活性
兩組化合物比較之下, 在 HEp-2 的項目中,雙鍵的存在對於活性產生明顯的差
異, 例如化合物 3 對 2、化合物 6 對 5、化合物 9 對 8、化合物 15 對 14、化合物
18 對 17、化合物 21 對 20 以及化合物 27 對 26 之抗喉癌活性都有明顯的提升約
2 倍左右, 而化合物 24 對 23、化合物 30 對 29 之活性更是提高約 4 倍, 而化合物21
(ED50 = 5.82±0.51 μg/ml)表現最為優異, 其次依序為化合物 24 (ED50 = 6.78±0.38 μg/ml )和化合物 30 (ED50 = 8.59±0.18 μg/ml) , 依此可推測在 benzyl group 的 ortho 位置有-O-X (X = CH3, CF3) group 取代可以大幅提升 bindfing affinity, 而 若只有單原子取代則效果提升則不那麼明顯如化合物 6 (ED50 = 15.20± 0.14 μg/ml) 之 benzyl group 的 ortho group 以 fluorine 取 代 ; 因 此 可 以 在
30
N
-cyclohexylbenzamides 系列的 benzyl group 的 ortho 位置再進行不同的 funtion group 做修飾, 同時以化合物 21、24 和 30 的 cyclohexyl group 以及 benzoyl group做取代修飾, 期待是否對於抗喉癌活性是否能再進一步提升。
而 在 MCF-7, 雙 鍵 所 造 成 之 影 響 則 無 太 大 差 異 , 除 了 化 合 物 30 (ED50
=11.56±0.14 μg/ml)對化合物 29 (ED50 = 20.22±0.14 μg/ml)提升將近 2 倍的活性外,
其餘都在相近範圍之間, 可以嘗試在六圓環或是 benzoyl group 上以不同取代基
來嘗試開發。
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三、結論
我們利用化學方法合成出 N-benzyl-N-(cyclo-2-enyl)benzamide (2)及一系列 12 個衍生物, 其中化合物 5 具有卓越的抗發炎效果 (IC50= 0.11±0.05 µg/ml),而根據 抗發炎活性(表三), 可以做出以下三點結論: (1) 化合物 2 的 benzyl group 之 meta 位置最好不要有取代基, 否則會使得活性下降。(2) 化合物 2 的 benzyl group 之
para 位置上的取代基之大小變化在一定範圍內時對整體活性的影響不大
, 反觀 benzyl group 之 ortho 位置上的取代基之大小對於抗發炎活性之表現的浮動程度甚鉅。(3) 化合物 2 的 benzyl group 之苯環上三個位置對整體抗發炎活性的影響
力為 ortho＞meta＞para。而未來可以嘗試在化合物 2 的 benzyl group 的 ortho 位
置嘗試接上Cl, Br, I 等不同原子的取代基來觀察是否有更優異的抗發炎表現。
為了討論化合物 5 的 cyclohexene 的雙鍵對於抗發炎活性的影響,我們合成
N
-benzyl-N-cyclohexylbenzamide (3)以及其它 12 個衍生物; 根據過去所發表類似化合物 3 的化合物的方法來合成化合物 3 及其衍生物, 發現產率低落,且耗時長
久, 顯示要對 N-benzylcyclohexanamide 進行去質子化來進行 benzoylation 會遇到 cyclohexyl group 所造成的立體障礙過大的問題; 因此我們開發出了另一條路徑, 使用原本已合成出的 N-benzyl-N-(cyclo-2-enyl)benzamide (2)及一系列衍生物來對 其cyclohexene group 做直接的氫化反應來合成 N-benzyl-N-cyclohexylbenzamide (3) 及其它 12 個衍生物, 結果發現反應時間大幅縮短為 3 小時左右, 且反應條件
不需過於劇烈, 並大幅減少耗材成本, 為此類似骨架之化合物提供一個簡便的合
成途徑。最後在抗發炎的實驗中顯示出, 除了化合物 30 為呈現在雙鍵消失後, 抗
發炎活性上升外, 其餘化合物都呈現活性下降的趨勢, 但 ortho 位置依然對嗜中
性白血球釋出superoxide anion 的抑制活性上扮演關鍵的角色。
N-benzyl-N-(cyclo-2-enyl)benzamide(2)及一系列 12 個衍生物在抗癌細胞活性中, 以 化 合 物 20 在 喉 癌 、 肺 癌 和 乳 腺 癌 測 試 項 目 中 表 現 最 佳, ED50 分 別 為
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10.01±0.18µl/ml、10.31±0.13µl/ml 以及 10.02±0.06 µl/ml; 而在而在肝癌項目中則 為 化 合 物
11
(ED50 = 10.37 ± 0.55 μl/ml) 表 現 最 好 ; 而 與N
-benzyl-N-cyclohexylbenzamide 及其它 12 個無雙鍵之 benzamides 相比, 在 HEp-2 的項目中, 無雙鍵的 N-cyclohexylbenzamides 的抗喉癌活性明顯提升許多, 尤其是benzyl group 的 ortho- position 以-O-X (X = CH3, CF3) group 取代可以大幅 提升抗癌活性, 例如活性最佳的化合物 21 (ED50 =5.82±0.51 μl/ml) 和次之的化合 物 24 (ED50 =6.78±0.38 μl/ml) 和化合物 30 (ED50 = 8.59±0.18 μl/ml)。藉由合成這 26 個化合物, 我們對化合物 3 完成部分結構 SAR 的探討,以做為更
進一步 SAR 的設計及修飾來提供一個大致的方向, 希望未來能夠開發出更具潛
力的benzamide 抗發炎藥物。
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