將萃取出的 DNA 原液稀釋成濃度為 20 ng/µL 的工作液，以進行聚合酶鏈鎖 反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增特定的 DNA 片段，其中 PCR 的反應物 包括：DNA 工作液 2 µL、2.0 µM forward primer 1.5 µL、2.0 µM reverse primer 1.5 µL、MixRed 5µL，共 10 µL，本研究所使用的 MixRed 為 Ampliqon 公司產品，
其組成包括：3 mM MgCl2 PCR buffer、0.4 mM dNTP、0.2 units/µL Ampliqon Taq DNA polymerase 及 Inert red dye and stabilizer。
PCR 反應採用熱循環反應器(Gene AmpTM PCR System 9700)進行，程式設定 如下：以94°C 維持 5 分鐘，再進入過程為 94°C 維持 30 秒；45°C-60°C (依照各 引子黏合溫度設定)維持 30 秒；72°C 維持 20 秒的設定，循環 32 至 34 次，最後 以72°C 維持 10 分鐘，結束程式後將擴增的 PCR 產物保存於 4°C 以供後續電泳 分析使用。
依照 PCR 產物間的長度差距選擇使用 2.0 %、2.5 %或 3.0 % SFR (Super Fine Resolution, Amresco)的瓊脂膠片進行電泳分析，先將 PCR 產物 3 µL 注入浸置於 TBE 緩衝溶液的瓊脂膠片中，並以電壓 80-100 伏特通電持續 120-140 分鐘，隨後 以10 µg/mL 溴化乙錠(ethidium bromide, EtBr)染色 5-15 分鐘，再以清水退染 10-15 分鐘，再照射紫外光並拍照記錄電泳結果供後續分析。
(三)遺傳距離估算
利用 Oryzabase 網站所提供的遺傳圖譜，估算前景選拔分子標誌與目標基因 間的距離，首先自目標基因所在的連鎖群往分子標誌的方向選取最接近連鎖群，
並將二連鎖群間的遺傳距離平均分配至每一單位的物理距離，最後以分子標誌與 目標基因的物理距離估算兩者間的遺傳距離。
(四)外表型測量
本研究之抽穗期(days to heading)計算自種子發芽至第一穗抽出期間的日數；
株高的量測為土表至全株最高穗的高度；粒數計算自單株；一次枝梗與二次枝梗 數計算自最高穗。
(五)遺傳組成估算
利用分子標誌基因型估算植株輪迴親的遺傳組成比例，兩分子標誌基因型 涵蓋範圍以之間的物理位置中點為界，將輪迴親同型結合基因型的區域加權為 1，異型結合的區域加權為 0.5，加總後再除以 12 條染色體全長。
(六)糯性檢測
利用支鏈澱粉與直鏈澱粉的透光程度不同，以區分糯性或非糯性米粒，不透 光的米粒為糯性米粒，剩餘不易以透光度判別的糙米，則利用碘液與澱粉複合的 呈色原理進行判別，染色後呈淡紫紅色的為糯性，呈藍黑色的為不具糯性。
四、結果
(一)分子標誌篩選
1.與 ALK、SPIKE 及 Wx 等三對目標基因連鎖分子標誌之篩選
本研究針對三對欲導入的目標基因，進行緊密連鎖的分子標誌篩選，即以 兩雜交親本(大陸秈及台稉糯 1 號)為材料進行多型性分析，以利使用於雜交與 回交後代的前景選拔。首先在ALK 基因座上測試設計較為特殊的分子標誌，
此設計同時利用4 條引子進行多型性分析，並可以產生 832 bp (alk 專一條帶，
米飯冷卻後較不易硬化)及 543 bp (ALK 專一條帶，米飯冷卻後較易硬化)的電泳 條帶(Bao et al., 2006)，但由於結果中有較雜的電泳條帶出現而干擾判別(圖二)，
因此測試另一與ALK 基因緊密連鎖的 SSR 分子標誌 RGNMS2176，其結果為 易判別的共顯性電泳條帶(圖二)；於 SPIKE 基因的測試中，使用與之緊密連鎖的 RM17483 及 RM17486 等 2 組 SSR 分子標誌進行多型性分析，結果均呈共顯性，
而其中分子標誌RM17486 的多型性較易判別(圖二)；利用可區別 Wx 基因內不同 (CT)n 重複序列的 P484 及 P485 等 2 條引子(Ayres et al., 1997)，雖可於兩親本間 產生多型性，但因為兩共顯性條帶過於接近不易判別(圖二)，故測試另一與 Wx 基因連鎖的SSR 分子標誌 RM4332，其電泳結果為易判別的共顯性條帶(圖二)。
根據以上結果，篩選出RGNMS2176、RM17486 及 RM4332 等 3 組共顯性分子 標誌，依序可應用於ALK、SPIKE 及 Wx 等三對目標基因在雜交及回交後代的 前景選拔，分子標誌與基因間估算遺傳距離分別為0.12 cM、0.26 cM 及 3.66 cM (圖三)，均與目標基因緊密連鎖。
圖二、本研究所篩選與三對目標基因緊密連鎖之分子標誌 Fig. 2. Selected markers linked to 3 target genes
註：P1 為台稉糯 1 號；P2 為大陸秈；1-7 為 7 株 F1世代植株
圖三、ALK (A)、SPIKE (B)及 Wx (C) 等三個目標基因與前景選拔分子標誌間之 物理及遺傳距離示意圖
Fig. 3. An illustration of distances between foreward selection markers and targeted genes, ALK (A), SPIKE (B) and Wx (C)
2.供遺傳背景分析分子標誌之篩選
為了瞭解回交育種後代的輪迴親遺傳比例，本研究首先依研究室先前所建立 的常用分子標誌資料設計101 組 SSR 分子標誌對兩親本進行多型性分析，結果得 到56 組具有多型性，並於其中選出均勻分布於各染色體且易判別的 30 組共顯性 分子標誌，而多型性分子標誌數目仍不足4 個的染色體上，再利用 Gramene 水稻 資料庫設計引子進行補充，基於物理圖譜上均勻分布的原則追加151 組 SSR 分子 標誌進行多型性檢測，合計共篩選252 組 SSR 分子標誌，完成在 12 條染色體上 至少各有4 個分子標誌(圖四)可供遺傳背景的評估利用。常見秈稉雜交親本間的 分子標誌多型性約為20%，而於本研究 101 組分子標誌的測試中，12 條染色體的 多型性平均高達55%，且最低仍有 38.5% (表一)，顯示兩親本大陸秈與台稉糯 1 號之間有較大的遺傳距離，因此在BRL 僅回交 2 代的育種方法下更有機會選拔 出超越親本表現的後代。
表一、101 組 SSR 分子標誌之多型性分析及其在水稻各染色體之分布
Table. 1. Polymorphism analysis of 101 SSR markers distributed on each chromosome of rice
Chromosome
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total Tested markers 6 10 6 9 6 6 11 6 12 6 10 13 101 Polymorphic markers 5 4 4 4 4 6 5 4 5 4 6 5 56
Polymorphism (%) 83.3 40.0 66.7 44.4 66.7 100 45.5 66.7 41.7 66.7 60.0 38.5 55.5
圖四、本研究進行前景選拔及背景選拔所使用之分子標誌及其物理圖譜
Fig. 4. Physical map of foreward and background selection markers used in this study
註：前景選拔之分子標誌以底線表示；篩選自研究室先前建立之多型性分子標誌