為進一步了解 PiVX 缺失性 RNA 的預測轉譯架構在植物上表現累積之情形，
利用帶有 XcmI 限制酶切位之引子對 X2-4-tag-F 與 X2-4-tag-R，進行聚合酶連鎖 反應，將帶有 C4 與 myc 蛋白標籤之 DNA 序列片段擴增出來，並以 XcmI 限制 酶切位將此片段以維持轉譯架構的方式插入 PiVX-N1 中，經定序後預期將使 PiVX-N1 轉譯出之蛋白 C 端攜帶一段 C4 與 myc 蛋白標籤，可供偵測使用，稱 此選殖株為 PiVX-N1-tag。將 p35S-PIVX5 單獨或分別與 PiVX-N1、PiVX-N1-tag
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共同接種至白藜上，每株白藜接種 3 片葉子，於 7 天後收取接種葉萃取植物全蛋 白質。並以北方雜合反應與西方墨漬法試驗觀察實驗結果。從結果上可以發現，
在接種葉上，PiVX-N1-tag 與 PiVX-N1 之 RNA 累積並無顯著之差異(圖十四-A)，
但卻在西方墨漬法中，無論使用 C4 抗體或 myc 抗體，皆無法偵測到 PiVX-N1 重組蛋白之累積。但若以 CP 抗體進行偵測，則可偵測到 35S-PiVX5 鞘蛋白之累 積(圖十四-B)。由本實驗結果可知，缺失性 RNA 重組蛋白無法在白藜上明顯累 積，顯示 PiVX 缺失性 RNA 攜帶的轉譯架構在白藜中可能不表現或累積量較低。
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伍、 討論
PiVX 基因體組成與其他 potexvirus 相似(李, 2010)，因此在尚未選殖出天然 產生之 PiVX 缺失性 RNA 前，先嘗試依曾報導過之 potexvirus 缺失性 RNA 特性 (White et al., 1991; Yeh et al., 1999)，以人為方式構築一系列包含 PiVX 基因體 5’
端及3’端部分序列之 PiVX 人為缺失性 RNA(圖一)。將這些 PiVX 人為缺失性 RNA 單獨或與輔助病毒共同接種於菸草原生質體中，結果顯示在輔助病毒 PiVX 存在下，PiVX 人為缺失性 RNA 皆具有被複製之能力。其中，PiVX-MM 僅具有 531 個核苷酸即具有被複製之能力，故可推知在 5’端 269 與 3’端 362 個核苷酸區 域序列應具有可被 PiVX 複製酶所辨識之 cis-acting element。而 PiVX-MM 於菸 草原生質體中累積之量明顯高於其他人為缺失性 RNA(圖二)，推測其複製潛力應 較其它人為缺失性 RNA 為佳，其原因可能為 PiVX-MM 擁有最短之全長序列，
故在單位時間內具有最多之複製機會(Pathak & Nagy, 2009)；而觀察全長最長的 PiVX-AA，也可發現累積量較其他人為缺失性 RNA 少(圖二)，但仍需進一步定 量才能肯定。除受到本身長度之影響外，PiVX-MM 較短之基因體可能降低 PTGS 對其之影響，進而提高 PiVX-MM 在細胞中的累積量(Szittya, 2002)；但我們也發 現 PiVX-MM 所殘留接種源量亦較高(圖二)，故不能排除 PiVX-MM 之 RNA 二級 結構可能也較為穩定之因素。
進一步將此一系列人為缺失性 RNA 單獨或與 PiVX 共同接種至白藜植株，
從北方雜合反應的結果，可以發現在輔助病毒 PiVX 存在的狀況下，PiVX-AB 及 EB 可在接種葉上複製累積，但 PiVX-AA、BB 及 MM 則皆無法在白藜接種葉累 積其 RNA(圖三)。推論最短的 PiVX-MM 可能已經缺失了與細胞間移動
(cell-to-cell movement)相關之序列，因而無法在植物組織中大量累積。而將無法 累積的 PiVX-AA、BB 與可於葉片上累積之 PiVX-AB 進行比較，可發現三者之
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間主要差異為 PiVX-AA 於 3’端之保留區域較 PiVX-AB 長，而 PiVX-BB 則是於 5’端之保留區域較 PiVX-AB 長，PiVX-AA 與 BB 已包含 PiVX-AB 之序列(圖一)，
故理論上，PiVX-AA 與 BB 皆應具有與於葉片上累積相關之序列，但卻仍然無 法在接種葉上偵測到其累積，表示缺失性 RNA 除須保留必須之 cis-acting element 序列外，保留之區域長度亦為影響其累積能力之重要因子，這可能和較長之序列 長度造成 PiVX-AA 與 BB 複製潛力較低、較易受到 PTGS 之影響(Szittya, 2002)，
且較難以進行細胞間移動有關(Pathak & Nagy, 2009)。而在一些研究中，亦指出 缺失干擾性 RNA 之增殖能力會直接受到其本身基因體長度之影響(Makino et al., 1990)。但因本研究所使用之原生質體來自菸草，與植物接種試驗使用之白藜不 同，故也不能排除有寄主因子的影響(Llamas et al., 2004; Zhang & Nuss, 2008)。
由此部分之實驗可知，利用人為方式將 PiVX 基因體進行改造，是可以模擬創造 出人為缺失性 RNA，但如同其它病毒天然缺失干擾性或缺失性 RNA 一般，其生 物活性仍受到許多因子之影響，包括：序列保留區域、序列長度、二級結構與寄 主種類等，皆有可能影響到 PiVX 人為缺失性 RNA 之生物活性。
為了誘導 PiVX 天然缺失性 RNA 之產生，將高濃度 PiVX 連續繼代接種至 白藜上，期間以北方雜合反應進行分析。從結果可以發現從接種第二代開始，除 可偵測到 PiVX 基因體 RNA 訊號外，無論是否有接種 PiVX 人為缺失性 RNA 選 殖株，各處理皆可偵測到疑似 PiVX 天然缺失性 RNA 之訊號。健康植物樣本並 未偵測到這些疑似 PiVX 天然缺失性 RNA 之訊號，因此可知它們必定是病毒基 因體 RNA 之衍生物(圖五-A)。一方面為了觀察這些疑似 PVX 缺失性 RNA 之訊 號是否穩定出現，一方面則是因在前人關於 Potexvirus 屬植物病毒缺失性 RNA 的研究中，並沒有如此快速產生缺失性 RNA 的報導(Calvert et al., 1996; White et al., 1991; Yeh et al., 1999)，所以繼續繼代接種試驗並持續以北方雜合反應進行分 析。在接下來的兩次繼代中，這些疑似天然缺失性 RNA 的訊號仍持續出現(圖五
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-B, C)，其中，較為明顯的為一條大小約 3 kb 與數條約 1 kb 附近之訊號，因此便 針對這些核酸進行 TA 選殖。然而，在進行 RT-PCR 後，發現可擴增出大小約 1 kb 之產物，但並未擴增出約 3 kb 大小之產物(圖六-A)，因此推測此約 3 kb 大小之 片段可能具有病毒基因體5’端之序列，但卻缺乏 3’端之序列，有可能為類似缺 失性 RNA 之病毒基因體衍生物，但尚待研究證明。在近幾年的報告中，開始認 為缺失干擾性 RNA 或缺失性 RNA 並非只是單純地對輔助病毒造成不利之影響，
而是有其它相對的有利功能，使缺失性干擾性 RNA 或缺失性 RNA 可在演化的 過程中被保留下來(Pathak & Nagy, 2009; Simon et al., 2004)。而在本研究中，我 們發現 PiVX 產生缺失性 RNA 的速度相當快，且此一現象在我們的試驗過程中 相當穩定的出現；因此，我們推測 PiVX 以如此快速的方式產生缺失性 RNA，
應有兩者在共演化上之意義，但仍需進一步的研究以了解其關係為何。
從連續繼代接種 PiVX 之白藜接種葉，以及長時間感染 PiVX 之紅龍果植株 上，我們一共選殖出 9 種不同類型之缺失性 RNA，這 9 種缺失性 RNA 皆為 PiVX 基因體缺失中間大片段序列後，由5’端 214-859 個核苷酸與 3’端 73-768 個核苷 酸重新組合而成(圖七)。將這 9 種缺失性 RNA 混合輔助病毒 PiVX 共同接種至白 藜上，發現由白藜選殖出來的天然缺失性 RNA 中，除了 PiVX-N3 之外，PiVX-N1、
N2、N4 及 N5 皆能在白藜接種葉上累積(圖九)。而由紅龍果中選殖出來的天然缺 失性 RNA 中，只有 PiVX-P1 類型可以在白藜接種葉中偵測到累積(圖十)。在比 較 PiVX-N3 與人為缺失性 RNA 之序列後，我們認為其無法在植物組織中累積可 能與其較 PiVX-MM 短的 5’端保留區域，以及較 PiVX-BB 長的 3’端保留區域有 關。而 PiVX-N1、N2、N4、N5 及 P1 等可在植物組織中累積的天然缺失性 RNA 所保留區域與長度之類型則和其它 Potecvirus 病毒缺失性 RNA 相似，因 PiVX 基因體組成與其它 Potecvirus 相同，故其 cis-acting element 所在區域可能也較為 相似的緣故(李, 2010)。
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在同屬 Potexvirus 的 ClYMV 缺失性 RNA 研究上發現，ClYMV 缺失性 RNA 攜帶了一個由其複製酶與鞘蛋白以相同轉譯架(in frame)方式組成的融合蛋白轉 譯架構(White et al., 1991)。而對 ClYMV 缺失性 RNA 而言，保有鞘蛋白基因原 本之轉譯架構是相當重要的，當破壞兩基因之間的轉譯架構使其不再保有原鞘蛋 白基因之轉譯架構，則 ClYMV 缺失性 RNA 會失去複製之能力(White et al., 1992)。
在 poliovirus 與 coronavirus 上發現之缺失干擾性 RNA 亦有類似的情況 (Hagino-Yamagishi & Nomoto, 1989; van der Most et al., 1991)。在以程式預測 PiVX 天然缺失性 RNA 後發現，PiVX-N2、N3、N4 與 P2 維持了一個由複製酶 與鞘蛋白序列 in frame 組合之融合蛋白轉譯架構，但 PiVX-N1、N5、P1、P3 及 P4 則出現了兩基因間轉譯架轉換，未維持原本鞘蛋白部分之轉譯架構(圖八和圖 十一)。但比對在植物上生物活性測試之結果，PiVX- N1、N2、N4、N5 及 P1 皆 可在植物組織中複製累積(圖九和圖十)，代表了在 PiVX 天然缺失性 RNA 中，複 製酶與鞘蛋白 in frame 之轉譯架構的維持，對缺失性 RNA 在植物組織中複製累 積之能力並不具決定性的影響。此特性與 ClYMV 缺失性 RNA 明顯不同，但與 由菸草中選殖出之 BaMV 缺失性 RNA 相同(李, 2000)。
前人研究顯示轉譯架構的維持與否對 BaMV 缺失性 RNA 的增殖有決定性的 影響，利用點突變使 BaMV 缺失性 RNA 喪失攜帶之 RdRp 轉譯架構後，BaMV 缺失性 RNA 亦失去其增殖能力(李, 2000)。但在本研究中，我們發現既使將 PiVX-N1 之 RdRp 轉譯架構以點突變方式除去，其仍可在輔助病毒的協助下於植 物上進行複製與累積，但其 RNA 累積量下降(圖十三)，表示轉譯架構的維持與 否對 PiVX 缺失性 RNA 的增殖可能有影響，但並非必要性。在 Potexvirus 屬病 毒的5’非轉譯區域(untranslation region, UTR)的研究中，發現其在轉譯起始密碼 附近具有四大類保守性的二級結構(Chen et al., 2010)，並在之後的研究中發現
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BaMV 衛星核酸(satBaMV)也具有相似之結構，且此結構應和複製酶進行 RNA 合 成作用有關，而 satBaMV 可能是以此二級結構和 BaMV 競爭複製酶(Chen et al., 2012)。當我們以 MFOLD 程式分析 PiVX 5’UTR 之序列，可以預測出 PiVX 轉譯 起始密碼附近也具有保守的二級結構，而我們將起始碼由 AUG 突變成 GUG，預 期並不會改變此保守的二級結構(圖十五)，這或許是 PiVX-N1D 能維持一定之累 積量的原因，但仍需更多實驗以證明此一假設。
我們推測 PiVX-MM 已經缺失了在植物組織中累積必須之序列，在與可在葉 片上累積的 PiVX-N1 進行比較後，我們推測這段序列應存在於 270-755 nt 之間。
為更仔細的將此段序列找尋出來，我們構築了缺失 270-755 nt 間不同長度之 PiVX-N1 突變株進行試驗。結果顯示當我們將 356-562 nt 區域移除後，PiVX-R2 便失去了在葉片上累積之能力(圖十二)，由此得知此區域序列應具有 PiVX 缺失 性 RNA 於植物組織中累積必須之序列。但在 PVX 的研究中，PVX 進行細胞間
為更仔細的將此段序列找尋出來，我們構築了缺失 270-755 nt 間不同長度之 PiVX-N1 突變株進行試驗。結果顯示當我們將 356-562 nt 區域移除後，PiVX-R2 便失去了在葉片上累積之能力(圖十二)，由此得知此區域序列應具有 PiVX 缺失 性 RNA 於植物組織中累積必須之序列。但在 PVX 的研究中，PVX 進行細胞間