Real-time Quantitative PCR

取50 ng/μl DNA 1 μl 和下列試劑混合：10 pmole target-specific primer 2 μl、

SYBR Green I 1 μl、MgCl² 1.2 μl、H²O 4.8 μl。Real-time quatitative PCR 設定條 件如下：Heart start 94℃ 5 分鐘，接下來為 31 個循環週次的設定條件，94℃ 30 秒、62℃ 30 秒、72℃ 30 秒、79℃ 2 分鐘。結果使用 LightCycler Analysis 分析。

5. 電泳(electrophoresis)

取6 μl PCR 產物，以 1.2%或 2.5% agarose gel、100 伏特電壓下，在 Mupid-2J 迷你水平電泳槽(Cosmo Bio, Tokyo, Japan)，使用 0.5 倍 TBE 緩衝液(0.1 M Tris, 0.1 M boric acid, 2 mM EDTA-Na2, pH 8.0)進行瓊膠電泳。再以 ethidium bromide (50 μg/ml)進行 5~10 分鐘的染色，於紫外光線透視燈(Viber Lourmat photo-print 008-SD, Cedex, France)下檢視 DNA 的長度。結果再利用 Photo-captMW 定量系 統(UniEquip, Fraunhoferstrasse, Germany)分析 DNA 量。

十三、流式細胞儀(Flow cytometry)分析 1.細胞處理

將子宮內膜異位細胞Hec-1A 培養於 10 cm 培養皿，以無酚紅培養液 starvation 及給予不同藥物刺激不同時間之後，以PBS 沖洗一次，加入 1ml trypsin-EDTA 作 用1 至 3 分鐘，收集細胞液至 15 ml 離心管，600×g 離心 5 分鐘，丟棄上清液後 再以PBS 沖洗，於 600×g 離心 5 分鐘後，丟棄上清液並以 1ml PBS 均勻打散細 胞，加入染劑後使用流式細胞儀(BectonDickinson FACScan system, Mountain View, CA)進行分析。

2.粒線體數量(mitochondrial mass)偵測

MitoTracker Green FM 是常用來偵測粒線體生合成數量(mitochondrial mass) 的螢光染劑，因MitoTracker Green FM 含有 thiol-reactive chloromethyl moiety 可 以 在 粒 線 體 膜 上 形 成 胜 肽 和 蛋 白 質 的 穩 定 結 合 物(peptide and protein conjugates) ， 不 需 藉 助 粒 線 體 膜 電 位 ， 染 劑 即 可 堆 積 在 粒 線 體 的 lipid environment(Oubrahim et al, 2001)。將細胞以 1%的 paraformaldehyde 固定 5 分 鐘，PBS 清洗 2 次， 加入染劑反應 15 分鐘，在一小時內以流式細胞儀偵測螢 光反應。

3. 細胞凋亡(apoptosis)測定

細 胞 膜 的 基 本 成 分 主 要 有 三 種 磷 脂 質 ， 分 別 為 磷 脂 醯 乙 醇 胺 (phosphatidylethanolamine)、磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)與磷脂醯絲胺酸 (phosphatidylserine, PS)。在正常狀態的細胞中，PS 是存在於細胞膜的雙層磷脂 質內葉(inner leaflet)的蛋白質，當細胞凋亡機制被啟動時，細胞凋亡初期(early apoptosis) DNA 尚未斷裂，細胞膜雙層磷脂質的不對稱性分佈消失，細胞膜的塌 陷、崩解造成 PS 由細胞膜內側轉移至外葉(outer leaflet)，而 Annexin-V 對 PS 具 有極高親和力，在鈣離子存在下(Ca²⁺ dependent)可與細胞表面的 PS 緊密結合，

藉由 Annexin-V 與螢光物質 FITC 的結合，可用於偵測早期細胞凋亡的發生。

Propidium iodide (PI)是核酸(nucleic acid)的特異性染劑，常用於區別細胞存活與 否，在細胞核崩解、DNA 斷裂成片段的細胞凋亡後期(late apoptosis)，可藉由觀 察同時染上Annexin-V 與 PI 的細胞進行測定。以無酚紅培養液 starvation 及給予

不同藥物刺激不同時間處理細胞之後，移除細胞培養液，以PBS 清洗細胞兩次，

再依據TACS^TM Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kits (R&D Systems, Inc., Minneapolis, State)的作用，完成後 Annexin-V incubation reagent 需放置在冰上並 避光。將加藥處理後收集下來的細胞與reagent 在室溫下避光作用 15~30 分鐘進 行結合反應(binding reaction)，最後以 1×結合緩衝液(binding buffer)洗去未與細胞 結合上的染劑兩次之後，並在1 小時內以流式細胞儀完成偵測。

4.活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS )的測量

2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)是用於測量細胞內 ROS 含量的螢光染劑。2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)具有兩個親脂性基 團，故可通透細胞膜進入細胞，DCFH-DA 在細胞內會被酯酶(esterase)分解成無 法穿過細胞膜的2’,7’-dichlorofluoresin (DCFH)，當細胞中有 ROS 存在時，ROS 會與DCFH 反應，生成具有綠色螢光的 2’,7’-dichlorofluorescein (DCF)化合物。

螢光化合物DCF 藉由 488 nm 的雷射光源激發(excitation)，並且在 520 nm 處能 放射(emission)最大的螢光值，藉流式細胞技術與螢光強度來偵測細胞內 ROS 含 量變化，評估細胞整體氧化壓力的程度。將加藥處理後收集下來的細胞，加入1 ml PBS 均勻拍散細胞，避光環境下加入 5 μM H2DCFDA，作用 15 分鐘，在 1 小時內以流式細胞儀進行偵測。

5.粒線體膜電位分析

使 用 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)偵測細胞中粒線體Δψ的變化。粒線體在呼吸及氧化磷酸化過程中，將產

生的能量以電化學位能儲存於粒線體 IM(約 250mV)，稱之為 mitochondrial membrane potential (Δψ)，為外正內負的形式。JC-1 螢光染劑為親脂性的陽離子 化合物，加入細胞染色後，會和粒線體 IM 的負電荷結合，當Δψ在低膜電位(＜

100mV)時會以 monomer 的形式存在，excitation 在光源 488 nm 處，emission 在 525 nm 放出綠色螢光；而當Δψ 逐漸升高，JC-1 會行聚合作用(polymerization) 在粒線體IM 形成的 J-aggregates，在 590 nm 放出橘紅色螢光。以紅綠螢光強度 的比值，便可算出細胞中粒線體膜電位差的高低(Smiley et al, 1991)。JC-1 因較 傳統粒線體膜電位的染劑有更高的敏感性和解析分辨能力。將加藥處理後收集 下來的細胞，加入1 ml PBS 均勻拍散細胞後，避光環境下加入 5 μM JC-1，作 用15 分鐘，於一小時內以流式細胞儀進行偵測。

十四、雷射共軛焦顯微鏡

1. 雷射共軛顯微鏡(confocal microscopy)

本實驗使用共軛焦顯微鏡(TCS SP5 AODS, Leica, Germany)來觀察 ERβ在細 胞內的分布情形。共軛焦顯微鏡原理與光學顯微鏡相似，主要差別在於共軛焦 顯微鏡以不同波長雷射光作為光源，由於雷射光波長較可見光長短，使得共軛 焦顯微鏡的解析力介於光學與電子顯微鏡之間，解析度達0.18 μm，可以讓我們 穿透細胞的表層組織，運用多次及多面的切片式掃描，可進行胞器體積的測量，

觀察細胞中的胞器功能與位置分佈，深入了解細胞內部的三度空間結構。

2. Transfection

在6 well 中種入 5×10⁵細胞，分別取Lipofectamine 2000 12 μl 與 5 μg target

DNA 與 OPTIMEM 作用靜置 5 分鐘，各別加入細胞中，6-8 小時候在換回新的 culture medium，72 小時後篩藥（取 600 μg/ml G418 篩選），篩選完後取100 μg/ml 繼續培養。

3.螢光染劑及細胞免疫螢光染色

在6-well 的培養盤上放入滅過菌的 cover glass (直徑 22 mm)，將 Hec-1A 細 胞培養於cover glass 上，第二天細胞約四成滿時，分別加藥後移除細胞培養液，

以4°C PBS 清洗 2 次停止細胞週期，加入 50 nM 的 MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes)於 37°C 下避光反應 30 分鐘，以 HEPES buffer (20mM)洗滌 10 分鐘，重複 2 次後，再以 4% paraformaldehyde 室溫作用 30 分鐘固定細胞，用 PBS 清洗細胞 2 次，之後加入含有 0.2% Triton X-100 之 PBS 作用 10 分鐘，目 的是將細胞膜打洞。再以PBS 清洗 2 次後，加入 blocking solution (3% BSA in PBS) 在 37°C 作 用 1 小 時 。 去 除 blocking solution 後 ， 加 入 一 級 抗 體 rabbit anti-ERβ Ab、Mouse anti-cytochrome c 4°C 反應一個晚上。移去一級抗體後，以 PBS 清洗細胞 5 分鐘，重複 3 次。再加入二級抗體 FITC-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG、FITC-conjugated AffiniPure goat anti-mouse IgG 37°C 反應 2 小時。移去二級抗體後，以 PBS 清 洗細胞 5 分鐘，重複 3 次。取 8 μl 的螢 光抗退劑VECTASHIELD^® Mounting medium 滴於載玻片上，延緩螢光隨時間減 退(photobleaching)的速度，維持螢光至少在 50%以上。將 cover glass 覆蓋於上，

把周圍的水分吸乾，避免氣泡產生，周圍用透明指甲油封片。MitoTracker^® Red 主要用來標記粒線體的位置，以雷射共軛顯微鏡觀察，可瞭解其細胞內分佈，

為常見的粒線體螢光標定物質。MitoTracker^® Red 激發波長為 588nm，放射波長 為 622nm，在細胞內觀察到的絲狀或點狀的紅色螢光，即為粒線體。利用雷射 掃瞄共軛焦顯微鏡觀察紅光的粒線體再對照免疫螢光染色後的綠光FITC，觀察 ERβ及 Cytochrome c 在細胞內粒線體中分佈的情形。

十五、統計分析

以 Student’s paried t test 作分析，p＜0.05 表示具有統計意義。實驗結果以 mean ± standard error mean (S.E.M.) 表示。