SCA8基因轉殖鼠之建立

我 們 利 用 原 核 胚 顯 微 注 射 的 方 式 ， 已 經 成 功 建 立 了 NSE-SCA8-157 R-EGFP的轉殖小鼠，目前得到共3個founder line(圖三 十九)，將小鼠腦部組織萃取後，利用西方轉漬的方式我們發現在 40 kDa左右的位置看到一個疑似fusion form的EGFP蛋白(圖四十)；在先 前本系未發表的實驗結果指出，在電腦分析的預測之下，SCA8基因 上 有 三 個 片 段 具 有ORF(open reading frame) 的 轉 錄 活 性 ， 而 以 luciferase的reporter assay 也支持這樣子的推論，如此一來，SCA8的 CTG可能會編碼成polyLeu而造成蛋白質的堆積，進一步形成內涵體 (inclusion body)造成細胞的毒性；而就以本構築而言，如果靠近SCA8 3’端的第三個ORF成功轉譯出蛋白，則有可能一併轉譯出polyLeu並且 fusion後面的flag tag以及EGFP，使得原本27 kDa的EGFP，會增加成 接近40 kDa左右大小的融合蛋白，而在(圖四十)中也可看到這樣的一 個結果；由於目前仍未有人可以證明SCA8具有轉譯的活性，所以也 沒有抗體可供選擇，所以目前實驗室已將SDS-PAGE中相對位置的蛋 白挖出，經由in gel digestion後，送至長庚蛋白質體研究中心進行 MALDI-TOF分析，初步發現該蛋白質組成，可能與一Leucine rich的 蛋白質相似，我們將更進一步純化該蛋白質，希望利用氨基酸序列的

分析方式，來更加確定該蛋白質的組成。

在確認轉殖基因在腦部組織的表現之後，我們將進行一系列的行 為檢測，來檢驗帶有CTG擴增的SCA8基因是否會對老鼠的行為造成 影響，並且進行免疫組織染色來觀察這樣的行為差異是否也反映在病 理組織分析上；我們也將利用此一模式來了解SCA8的可能的致病機 轉，其病程是否與SCA8病人相似，並期望以此模式動物作為藥物篩 檢的平臺，找出有效的治療方式途徑來造福SCA8以及其它脊髓小腦 萎縮症的患者。

E、SCA8基因轉殖細胞株之建立與分析

我們將原核胚注射的相同構築，利用 Liposome (Lipofetamine 2000) 的方式轉殖進入大鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞株中，並以篩選基 因 puromycin (2μg/ml) 得 到 穩 定 的 基 因 轉 殖 細 胞 群 落 (stable clone)(圖四十一，圖四十二)，分別是載體控制組(NSE-EGFP, CTL)、

正常擴增範圍的SCA8 轉殖細胞株(NSE-SCA8-23R-EGFP, 23R) 、致 病擴增範圍的 SCA8 轉殖細胞株(NSE-SCA8-157R-EGFP, 157R)；在 生長速率的分析(MTT test)之後，我們可以發現帶有致病擴增範圍的

Hirokazu(2005)的實驗也指出，250 個 CTG 擴增的 mRNA 就會造成 PC12 細胞株的生長受到影響。

我們也更進一步地利用NGF誘導PC12細胞株分化後，觀察具有 神經細胞特性的細胞株，其受CTG擴增的SCA8轉殖基因的影響(圖四 十三，四十四)，發現CTG擴增的SCA8基因影響到PC12細胞的分化，

而使其分化程度及比例降低(圖四十九，五十，五十一)，而這樣分化 不完全的157R細胞株對於低劑量處理的氧化藥物TBH(圖四十五，四 十六)及STS(圖四十七，四十八)的耐受性較差，顯示CTG擴增的SCA8 會對於神經細胞造成影響(圖五十二)，並可以發現帶有致病擴增SCA8 基因，且分化的PC12細胞對於氧化壓力的耐受性較差。

我們也利用西方轉漬的方式發現氧化壓力 marker，MnSOD (Mn Superoxide Dismutase)的表現增加，，較控制組有較多的 MnSOD 表 現，顯示這兩者的細胞內的氧化壓力較高；另外也發現了在p53 的表 現也看到相同的情形，顯示細胞的存活率降低，可能是由於細胞自戕 (apoptosis)所致；而 Heat shock protein 70 則是在控制組有較高的表現 量(圖五十三)，顯示未轉殖基因的 PC12 細胞株以及構築控制組(vector control)，具有較好的神經保護的機制。由於 STS 在先前的文獻指出

及氧化壓力，而我們也藉由西方轉漬分析發現了，157R 細胞株，其 mitochondria mediated apoptosis 訊息 caspase 9 及 cytochrome c 較控制 組來的高，使得157R 的存活率比其它組別來的差。

我們也希望更進一步地利用其他的壓力，例如:LPS…等等，來觀 察帶有致病 CTG 擴增的 SCA8 基因是否也會影響神經細胞對於其他 壓力來源的耐受性，來更加確認先前的結果；另外我們也將著手構築 inducible 的 construct，來驗證目前所得到的結果。