TW6 細胞暴露於檳榔特有生物鹼、檳榔特有亞硝胺與檳榔搾汁液 (對應分項目標 2) (1) 細胞存活實驗

因前述的CT-DNA 直接暴露實驗無法觀察到新生成的 2'-dN 鍵結物，故本研究進一步採用細 胞模型來進行檳榔暴露實驗。細胞實驗採用 TW2.6 細胞株，此株細胞源自有抽菸與嚼食檳榔習 慣的鱗狀上皮癌患者頰黏膜組織 [Kok et al. 2007]。TW2.6 細胞的暴露實驗採用：(1) 檳榔子內最 具代表性且含量佔比最高的生物鹼arecoline；(2) 生物鹼經亞硝化形成的致癌性檳榔特有亞硝胺 MNPN (IARC group 2B)；(3) 檳榔子汁液與 (4) 白灰檳榔汁液。細胞實驗前為確認毒物暴露劑量 適當，細胞能存活而產生DNA 鍵結物，故先以細胞存活率分析實驗(MTT assay)對檳榔毒物的進 行劑量評估：arecoline (0.1, 0.5, 2, 5 mM)、MNPN (0.1, 1, 5, 20 mM)、檳榔子汁液(0.1%, 0.5%, 2%, 5%, v/v)與白灰檳榔汁液(0.1%, 0.5%, 2%, 5%, v/v)。

圖二十四(A-D)為 TW2.6 細胞於 arecoline、MNPN、檳榔子汁液與白灰檳榔汁液不同劑量暴 露下的存活結果。圖二十四(A)顯示當 arecoline 濃度增加至 2 mM 時，MTT 結果已呈現超過 50%

的細胞死亡，其IC 50 濃度為 1.8 mM，我們選擇 0.5 mM 進行後續的細胞暴露實驗。MNPN 暴 露 TW2.6 細胞後，從圖二十四(B)發現濃度增加至最高 20 mM 時，細胞的存活狀況與控制組相 近，表示 MNPN 對 TW2.6 的細胞毒性低，我們採用 20 mM 濃度進行後續的測試。與過去文獻 比較[Sundqvist et al. 1989]，本研究以 arecoline 與 MNPN 暴露口腔細胞的毒性測試結果與文獻相 符。圖二十四(C)顯示檳榔子汁液的添加劑量超過 0.1%時，細胞便開始死亡，且隨劑量增加存活

率下降，故本研究採用添加0.1%作為後續的測試條件。圖二十四(D)為白灰檳榔汁液於不同添加 劑量下對 TW2.6 細胞的影響，可發現細胞在各個劑量下的存活皆與控制組相近，表示白灰檳榔 汁液對TW2.6 細胞的毒性低，最終以添加 5%做為後續的白灰檳榔汁液暴露劑量。針對複雜組成 的檳榔汁液對 TW2.6 細胞的毒性實驗，目前未有任何文獻報導，但根據本研究結果，檳榔子汁 液對細胞造成的毒性(圖二十四(C))遠比白灰檳榔汁液(圖二十四(D))來得高；因白灰檳榔嚼塊汁 液含熟石灰(Ca(OH2))，造成嚼塊汁液 pH 升高( pH > 10)可能改變檳榔嚼塊汁液成分的細胞毒性，

未來仍需近一步探討。

圖二十四、TW2.6 細胞暴露於(A) arecoline、(B) MNPN、(C) 檳榔子汁液與 (D) 白灰檳榔汁液 的存活率(n = 4；＊表示與控制組統計上顯著 P < 0.05)

(2) TW2.6 細胞暴露後之基因鍵結體

基因鍵結體分析試驗係利用前述細胞存活結果選擇合適的劑量對 TW2.6 細胞暴露。圖二十 五(A-C)為控制組、arecoline (0.5 mM)與 MNPN (20 mM)暴露後的 adductome map。Map 上可觀察 到32 個共有的 2'-dN 離子訊號，這些訊號在控制組(圖二十五(A))與暴露組(圖二十五(B)與(C))皆 可測得，相較控制組無發現新生成的基因鍵結物；亦即這些測得的共有訊號可能趨向 TW2.6 細 胞的內生性2'-dN 物質。

針對32 個 DD-NL-MS³測得的2'-dN 離子訊號，我們進一步採用主成份分析法(PCA)，以統

計方式找出細胞經暴露後訊號強度顯著變化的離子。結果發現經 3 重複實驗操作的控制組、

arecoline 與 MNPN 暴露組，皆因各自組內的訊號強度極為相近，因此於 PCA scores plot 上各自

被歸類在一起，表示細胞實驗的再現性佳。此外，組間測得的訊號因強度上的顯著差異而導致3

個暴露組別的離群，離群越遠代表群組間的差異越大。接著透過PCA loadings plot 得知是哪些離 子訊號導致離群的結果，最終我們找到4 個 2'-dN 離子訊號(Ion 1-4)：Ion 1 (9.66 min, m/z 348.2114)、

Ion 2 (10.83 min, m/z 242.1137)、Ion 3 (22.73 min, m/z 223.1540)與 Ion 4 (24.95 min, m/z 266.1250)，

此4 個 2'-dN 訊號強度明顯於 arecoline 暴露組皆大於控制組如圖二十五(D)。

圖二十五、(A) TW2.6 細胞控制組、(B) arecoline (0.5 mM)與(C) MNPN (20 mM)暴露後的 adductome map；(D)具訊號強度變化的特徵離子 box plot (Ion 1-4)

圖二十六(A-C)分別為細胞控制組(培養基)與細胞暴露於複雜成分的檳榔子汁液(0.1%, v/v)與 白灰檳榔汁液(5%, v/v)經 HRMS-based DNA adductomics 分析後所得 adductome map。與控制組 (圖二十六(A))相比，細胞經兩種檳榔汁液暴露(圖二十六(B)與(C))後，未有新生成的基因鍵結物。

相較於暴露純化合物arecoline 與 MNPN 的分析結果，檳榔汁液暴露 TW2.6 細胞並沒有產生較多 的離子訊號(皆為 32 個)，推測這些觀察到的 2'-dN 訊號皆屬於 TW2.6 細胞的內生性 2'-dN。此 外，將TW2.6 細胞 DNA 與前述的 CT-DNA 控制組相比，TW2.6 細胞可測得的 2'-dN 訊號數量相 對較多，顯示TW2.6 細胞的內生性基因鍵結修飾比 CT-DNA 複雜。

接著利用PCA 分析 TW2.6 細胞經檳榔子汁液與白灰檳榔汁液後具有強度差異的離子訊號，

從PCA scores plot 一樣可觀察到組間的離群，表示存有訊號強度差異的訊號。透過 PCA loadings plot 可找到 4 個離子訊號(Ion 1-4)，其強度於暴露組中皆大於控制組，其中又以檳榔子汁液暴露 最為顯著如圖二十六(D)。此 4 個訊號與前述暴露 arecoline 與 MNPN 找到的相同。經由高解析質 譜所提供的MS¹母離子與MS²、MS³碎片離子準確質量，經鑑定後發現Ion 2 與 Ion 4 分別為 5-MedC 與 N⁶-methyl-2'-deoxyadenosine (N⁶-MedA)；其餘兩個 2'-dN 分子結構仍待進一步鑑定。

圖二十六、(A) TW2.6 細胞控制組、(B)檳榔子汁液(0.1%, v/v)與(C)白灰檳榔汁液(5%, v/v)暴露 後的adductome map；(D)具強度變化的特徵離子訊號的 box plot (Ion 1-4)

TW2.6 細胞經 arecoline、MNPN、與兩種檳榔汁液暴露後，皆無法從 map 上找出相較於控制 組有新生成的基因鍵結物，推測可能暴露後新生成的基因鍵結物含量過低或TW2.6 細胞的 DNA 修復快；造成質譜MS¹訊號強度低於DD-NL-MS³方法的啟動門檻(強度>10,000)，無法產生 NL-MS³掃描事件而記錄於 adductome map。未來仍須進一步改善分析方法靈敏度以提升篩選能力。