Aneilema scaberrimum 毛果水竹葉 2 0 0
* “8(1,0)”括號外之數字”8”代表鹼基indel 之長度變異(bp)、括號內左方數字代表 出現indel 位點之數目，括號內右方數字代表種內出現鹼基取代位點之數目。
（二）植物樣品間之鹼基變異
經由此二基因位之序列分析及比較後發現本研究中的 269 個種 大部分具有種內特異的序列型，其中只有少數幾個屬其種間具有相同 的序列型，例如於trnL intron 序列中發現三個屬其屬內各有兩個種具 有相同的序列型，包括菊科的白花藿香薊（Ageratum conyzoides）及 紫花藿香薊（A. houstonianum）、兔兒菜（Ixeris chinensis）及細葉剪 刀股（I. japonica var. litoralis）、禾本科的升馬唐（Digitaria ciliaris）
及短穎馬唐（D. setigera）；至於 trnL-trnF IGS 序列除了上述此三組 序列分別具有相同序列型之外，尚發現另外兩個屬也具有相同的情 形，即樟科的紅楠（Machilus. thunbergii）及香楠（M. zuihoensis）與 桑科的水同木（Ficus. fistulosa）、澀葉榕（F. irisana）及稜果榕（F.
septica）亦分別具有相同的序列型。
由分析結果也發現此二基因位之序列也存在種內的變異，例如在 具有兩個個體以上之64 個種中於 trnL intron 序列發現 27 個種具有種 內的鹼基變異，其中有10 種同時具有種內之鹼基 indel 及鹼基取代之 變異、12 種僅具有種內之鹼基 indel 變異、5 種僅具有種內鹼基取代 之變異（表 2-9）；而 trnL-trnF IGS 序列則發現 22 個種具有種內的 鹼基變異，其中有 8 種同時具有種內之鹼基 indel 及鹼基取代之變異、
9 種僅具有種內之鹼基 indel 變異、5 種僅具有種內鹼基取代之變異。
由表2-9之結果發現有些種其trnL-trnF IGS 序列比 trnL intron 者具有 較高的變異，但也有些種則呈現 trnL intron 具有較高的鹼基變異。由 此二基因位之分析結果並未發現種內有超過 6 個鹼基取代之變異位 點，且亦未出現超過兩個位點具有 indel 變異者，以上顯示此二基因 位之DNA 序列於種內應具有較穩定的特徵。至於屬內其種間於此二 基因位之鹼基變異程度由上述長度變異之結果已發現具有多個分散 位點的鹼基 indel 現象，經各屬內其序列排比之結果亦發現比種內具 有較多的鹼基取代之變異位點。也由於其種內的變異度低於種間的變 異程度，因此這些樣品之 DNA 序列於後續所建立之資料庫中經搜尋 比對後也能得到正確的結果。
本 研 究 以 櫻 草 科 （primulaceae ） 為 例 ， 探 討 其 科 內 、 屬 內
（Lysimachia 屬 ） 及 種 內 （ 星 宿 菜 ） 之 鹼 基 變 異 程 度 ， 星 宿 菜
（Lysimachia fortunei）的兩個檢體於 trnL intron 之序列排比結果顯示 2 個位點具有鹼基取代變異及 1 個位點具有鹼基 indel 變異（圖 2-5）；
於trnL-trnF IGS 則顯示 6 個位點具有鹼基取代變異（圖 2-6）。至於 Lysimachia 屬的 5 個種於 trnL intron 之序列排比結果則顯示 14 個位 點具有鹼基取代變異及 6 個位點具有鹼基 indel 變異（圖 2-7）；於 trnL-trnF IGS 則顯示 32 個位點具有鹼基取代變異及 8 個位點具有鹼 基indel 變異（圖 2-8）。櫻草科內的 3 個屬（7 個種）於 trnL intron
之序列排比結果顯示66 個位點具有鹼基取代變異及 13 個位點具有鹼 基indel 變異（圖 2-9）；於 trnL-trnF IGS 則顯示 85 個位點具有鹼基 取代變異及14 個位點具有鹼基 indel 變異（圖 2-10）。經由櫻草科內 不同分類階層其鹼基變異程度的探討也印證低階的（種內）變異較小 而高階物種間的鹼基變異程度則較為顯著（科內）。
由表 2-6 至表 2-9 之結果發現此二基因位於不同分類群間各具有 不同的變異程度，雖然大部分科內及屬內之序列出現 trnL-trnF IGS 比 trnL intron 者具有較高的變異，但也有些科內或屬內發現其 trnL intron 具有較高的變異，種內的變異程度亦具有類似的情形。雖然有 少數屬其種間無法以此二基因位之序列有效的鑑別，但由目前之分析 結果尚未發現不同屬間或科間的種具有相同的序列型，故此二基因位 應可成功的應用於植物屬間及科間的鑑別，而由本研究之結果也僅發 現少數屬內會出現種間之序列無法有效鑑別的例子，故此兩個位於葉 綠體基因組的基因位應具有植物種屬鑑定應用之價值。
10 20 30 40 50 60 70 80
170 180 190 200 210 220 230 240
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . .. | . . . . | . . . . | . . . . |. . . . | . . . . | . . . . | . .. . | . . . . | type-1 GAGGAATCCTTTCATCAAAACTTCAGAAAGGATGAAAGATAAACG-TATATACATATGTACGAAAATCCTATATTAAAAA type-2 ...G...
250 260 270 280 290 300 310 320
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . .. | . . . . | . . . . | . . . . |. . . . | . . . . | . . . . | . .. . | . . . . | type-1 AAG-GCTTCTTTTTTCTATGAAAAATAGAAGAATCGTTGCGAATCGATTCCACATTCCACATTGAATAAAGAATTTCATA type-2 ..AT...
330 340 350 360 370 380 390 400
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . .. | . . . . | . . . . | . . . . |. . . . | . . . . | . . . . | . .. . | . . . . |
170 180 190 200 210 220 230 240
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
10 20 30 40 50 60 70 80
170 180 190 200 210 220 230 240
. . . . |.. .. |. . ..| ... .| ... .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .|. ... |. ... |.. ..| .. .. | ... .|. .. .|
250 260 270 280 290 300 310 320
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
330 340 350 360 370 380 390 400
. . . . |.. .. |. . ..| ... .| ... .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .|. ... |. ... |.. ..| .. .. | ... .|. .. .|
圖2-7 Lysimachia 屬於 trnL intron 基因位其屬內鹼基之變異。
10 20 30 40 50 60 70 80
170 180 190 200 210 220 230 240
. .. . | . .. . | . .. . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . |. . . . |. . . . |. . . . |. . . . |. . . . |. . . . |
250 260 270 280
. .. . | . .. . | . .. . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . | .. . . | .
圖2-8 Lysimachia 屬於 trnL-trnF IGS 基因位其屬內鹼基之變異。
10 20 30 40 50 60 70 80 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Androsace umbellata TAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCTGGAATTAATAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTCTTTTTAGAAAACAAAGA Anagalis arvensis G...C...--....A...C...
L.japonica G...C...C... Androsace umbellata TTAAGATTAAAGGAAAATAACAATAAGGGGGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATGGAGTTGGTT Anagalis arvensis G.---...A..---...-...A.C L.japonica ..---...A..---A...A.C
170 180 190 200 210 220 230 240
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Androsace umbellata GCATTGGTAGAGAAATCCTGTCATCAAAACTTCAGAAAAGGATGAAAGATAAGATAAATGGATATATATACACATATTGA Anagalis arvensis ..G...A...G...T..---...-..C...---.CA--...C.T.TG..CA..
L.japonica ..G...G...T...-...---.C.--...C.T.TG..CA..
250 260 270 280 290 300 310 320
. . . . | ... .|. ... |. ... |.. ..| ... .|. .. .|. ... |.. ..| ... .| ... .|. ... |.. ..| .. ..| ... .|. ... | Androsace umbellata AATACTATATA---AAAATAAAATGATTTTTTCTATGAAAAATAAAAAAAAAAATAGAAGAATTGTTGCGAATCAATTCC Anagalis arvensis ...C...T---...T...AA.A..C...TCTTC...----G...A...C...
L.japonica ...C...CCTAT.TTA....AA.A.GC....T.TTTCT..---G...C...G...
330 340 350 360 370 380 390 400
. . . . | ... .|. ... |. ... |.. ..| ... .|. .. .|. ... |.. ..| ... .| ... .|. ... |.. ..| .. ..| ... .|. ... | Androsace umbellata ACAGTCAACATGGATTAAAGAATTTCATATTCAGTTATCAAATCATTTACTCCATAGTCTGATA---GATCTTGTGAA Anagalis arvensis .T.T..C....T..A...T.G...C...A...---...
L.japonica ...T.---..A...T.G...A...TAATA...
410 420 430 440
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .. . . | . . . . | . . . . | . . . . | . Androsace umbellata TAACTGATTAATCAGTCGAGAATAAAGATAGAGTCCCATTC Anagalis arvensis ...T..G.A...
L.japonica ...G.A...
10 20 30 40 50 60 70 80 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Androsace umbellata CAAGAGTTTATTTCACTCCCTAACTATGTATCCTATGCTATTTATACTATCTCTTTTTCGTTAGCAACCACCCTTTTTTA Anagalis arvensis ---CA.
L.japonica ---CA. Androsace umbellata TAATTCACTTTACGCCTTGACAAACGGATTCGAGCAGAAAAGCT-TTTTCTTATTCTCCGTTTTTGTGGTATAATAAATG Anagalis arvensis A.G..TGT..G..T....A..T.TTTAT----CCT.TGCT.TT.A.AC.A...C.A.A.TC....T.---L.japonica
A.G..T.T..G..T..C.A..T.TTTAT----CCT.TGCT.TTGA.AC.A...C.A.A.TC....T..T...---170 180 190 200 210 220 230 240
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Androsace umbellata AACATCTTTGATCAAGGAATC---CTCACGGGAATGATT---CACAGTCCATATCATTATTCG-TACTGAAA Anagalis arvensis ---....G...T---.C..TTT....A...---...G.C...G...G...
L.japonica ---....G...GAATC.C..TTT....A...TGAATAATT...G.C...-...
250 260 270 280 290 300 310 320
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Androsace umbellata CTTACCCCGTTTTCTTTGT--TTTTTATTTAATCCACGAAATTACAGAGTA----TAAGACTTTAATA---A Anagalis arvensis ...A.AA....GA---A...G..A...G.CT---...AT----ACCCCC L.japonica ...A.AA...CA...TCCT....GTGAA...G..A...G.CTCACA...---ATGCCC
330 340 350 360 370 380
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . Androsace umbellata TAT--TTTGTAATTGACATAGACTCAAATCATCTAGTAAAATGAGGATGATGCATCGTGAG Anagalis arvensis .T.--...T...C...G...T...G...
L.japonica .T.--...T...---...G..GA..
三、DNA 資料庫之建立及盲樣分析
由於發現本研究所採用之葉綠體基因組的trnL intron 及 trnL-trnF IGS 此二基因位可能具有植物種屬鑑定應用之價值，因此本研究所採 集的387 個植物樣品於此二基因位所分析之 DNA 序列經序列擷取後 均以 BioEdit 軟體建立 DNA 資料庫，以期應用於植物之種屬鑑定。
為了評估此 DNA 資料庫於台灣地區常見植物種屬鑑別之效力，本研 究採用 20 個檢體進行盲樣測試，其中包含已建立於本資料庫之 9 個 台灣特有種及 6 個非特有種、尚未建立於本資料庫的 5 個種等（表 2-10），此 20 個盲樣於此二基因位之序列分別以本研究所建立之資料 庫（trnL intron 及 trnL-trnF IGS）及國外 DNA 資料庫（GenBank 與 EMBL）進行序列的搜尋及比對，其中已建立於本研究之資料庫的 15 個種均能於本資料庫中搜尋出正確的種別，且其相似度均高達99.4 % 以上，至於其他尚未建立於本資料庫之5 個種之序列也均能搜尋比對 出與本資料庫中相似度最高的分類群。但於GenBank 與 EMBL 資料 庫搜尋比對之結果則發現此 20 個盲樣只有 7 個種可以搜尋出正確的 種別（其中的三個種已建立於本研究之資料庫中），表示這 7 個種於 此二基因位的序列已建立於國外的 DNA 資料庫中，其相似度可達 99.2 % 以上，其它 13 個樣品經搜尋比對後其相似度最高者與樣品之 實際種名並不相符（包括表十中的 9 個台灣特有種），可見台灣地區
這些常見植物之種屬於此二基因位之序列大部分仍尚未登錄於國外 的 DNA 資料庫中。由上述盲樣之 DNA 序列搜尋比對之結果顯示，
不論是本研究或國外所建立之DNA 資料庫，只要資料庫內已建立的 種別幾乎都可以正確的鑑別出植物的種屬，且搜尋比對後均可以達到 99 % 以上的相似度，由於台灣地區具有高比例的特有種植物，因此 基於植物種屬鑑定之應用，台灣地區植物DNA 資料庫應具有其建立 的價值。
四、DNA 序列之歸群分析
為了進一步比較及評估此二基因位之序列變異於不同分類階層 之解析能力，本研究於表2-6中隨機挑選18 個科別內之種屬共 67 個 種、於表2-10中隨機挑選 10 個種當作盲樣、選取毛茛科的三個種當 作外群，共計 80 個分類單元。盲樣的加入是為了瞭解未知檢體於此 二基因位所建立之DNA 資料庫之歸群情形，以進一步評估其種屬鑑 別之效力，至於選擇毛茛科當外群乃根據近年來被子植物分類之親緣 分群（angiosperm phylogeny group, APG）等相關資訊而訂定（Soltis et al., 2000；Soltis et al., 2003；Hilu et al., 2003；The Angiosperm Phylogeny Group, 2003）。這 80 個分類單元於 trnL intron 及 trnL-trnF IGS 等二基因位之序列長度分別介於 433 bp ~ 627 bp 及 203 bp ~ 548 bp，由於這些樣品間其序列長度具有很大的變異，因此，也增加進行
序列排比時其最佳化排比條件選擇之困難度，經過多組排比條件的比 較，本研究所採用之最適排比條件其 gap creation penalty 及 gap extension penalty 分別為 5 和 1，這些樣品於 trnL intron 及 trnL-trnF IGS 等二基因位之序列長度經排比後之長度則分別為654 bp 及 625 bp。
以鄰近歸群法（neighbor-joining methods）進行樣品間之歸群分析所 得之演化樹如圖2-11 及圖 2-12所示，圖 2-11為trnL intron 序列之歸 群結果，幾乎所有分類單元（包括盲樣在內）均歸群在正確的屬及科 內，且其 bootstrap values 也幾乎達 80％以上，其中唯一的例外則為 薔薇科被分成兩個群。圖2-12 為trnL-trnF IGS 序列歸群之結果，雖 然大部分的分類單元仍可正確的歸在其所屬的科別及屬別內，但其 bootstrap values 則 明 顯 比 trnL intron 者 為 低 ， 特 別 是 在 菊 科
（astereceae）、敗醬科（valerianaceae）、繖形花科（apiaceae）、苦苣 苔科（gesneriaceae）、木犀科（oleaceae）、桑科（moraceae）和蕁麻 科（urticaceae）等最為明顯，由歸群分析之結果則發現有三個科分別 被 歸 成 兩 個 群 ， 包 括 桔 梗 科 （ Campanulaceae ）、 玄 參 科
（Scrophulariaceae）及櫻草科（Primulaceae）等。由此二基因位歸群 之結果發現 trnL intron 應用於種屬鑑定之可信度或解析力應較 trnL-trnF IGS 者為高，此結論與上述種間鹼基變異程度之探討的結論 相類似。Fangan 等人及 Taberlet 等學者進行植物界諸多類群於此二基
因位之序列分析的相關研究（Taberlet et al., 1991；Fangan et al., 1994），與本研究之結果具有相類似的建議，亦發現 trnL intron 應用 於較大範圍之植物類群之演化關係的探討應比 trnL-trnF IGS 者更為
IGS 相似度最高的種屬 trnL intron trnL-F IGS
於trnL intron 及 trnL-F
IGS 相似度最高的種屬 trnL intron trnL-F IGS Alstonia scholarisb
（黑板樹）
Marsdenia formosana
（台灣牛彌菜）
89.4 92.6 Alstonia scholaris
（黑板樹）
100.0 99.4 Ficus benjamina
（斑葉垂榕）
100.0 99.7
Cassia surattensisb
（黃槐）
Chamaecrista mimosoides
（假含羞草）
93.8 94.4 Caesalpinia bonduc
（刺果蘇木）
(Batesia floribunda)c
（巴西多花番櫻桃）
99.8 100.0 Lantana camara
（馬櫻丹）
100.0 100.0 Stachytarpheta dichotoma
（馬鞭草）
98.3 97.4
Pyracantha fortuneanab
（火刺木）
Malus docmeri
（臺灣蘋果）
99.5 98.1 Pyracantha fortuneana
（火刺木）
100.0 100.0 Taraxacum officinale
（蒲公英）
100.0 100.0 Chionanthus retusus
（流蘇）
100.0 100.0
Mallotus japonicusb
（野桐）
Mallotus paniculatus
（白匏子）
99.7 97.0 Mallotus japonicus
（野桐）
100.0 99.2
Cinnamomum camphorab
（樟樹）
Machilus zuihoensis
（香楠）
99.5 99.4 Cinnamomum camphora
（樟樹）
100.0 100.0
Farfugium japonicum var.
formosanum
（台灣山菊）
Farfugium japonicum var.
formosanum
（台灣山菊）
100.0 100.0 Farfugium japonicum
（台灣山菊）
99.7 97.9
表2-10（續）
本資料庫之搜尋比對 GenBank 及 EMBL 之搜尋比對
相似度 (%) 相似度(%)
盲樣 於trnL intron 及 trnL-F
IGS 相似度最高的種屬 trnL intron trnL-F IGS
於trnL intron 及 trnL-F
IGS 相似度最高的種屬 trnL intron trnL-F IGS Desmodium gracillimuma
（細葉山螞蝗）
Desmodium gracillimum
（細葉山螞蝗）
100.0 100.0 Desmodium elegans
（圓錐山螞蝗）
(Glycine clandestina)c
（大豆）
96.6 85.4
Salvia nipponica var.
formosanaa
（黃花鼠尾草）
Salvia nipponica var.
Formosana
（黃花鼠尾草）
100.0 100.0 Salvia glutinosa
（膠質鼠尾草）
99.5 100.0
Hibiscus taiwanensisa
Hibiscus taiwanensisa