先前我們實驗室利用轉染Oct4以及Sox2這兩種基因製造出一株新的 iPS，不同於一般的iPS做法，我們利用非病毒感染(FuGENE)及去除 致癌基因(Kil4, c-Myc)的方式，在轉染基因的6小時中，放置在正常氧 氣濃度的細胞培養箱，之後再將細胞放置在缺氧的缺氧的培養箱中24 小時以提升iPS的生產效率。我們實驗室將這株iPS命名爲iPS-OSH。
貳、研究架構與動機 1. 研究背景
I. 中風在台灣是排行第三名的死亡原因，對於存活者則會造成殘障 的後遺症。目前的治療方法並不能解決存活者殘疾的後遺症。
II. 帕金森氏症為老年人主要神經退化性疾病，目前僅能利用藥物來 抑制病情惡化，而無法有效的治療。
2. 研究目的
移殖誘導性萬能幹細胞分化的神經幹細胞來評估對缺血性中風以 及帕金森氏症的治療效果。
3. 研究假設
誘導性萬能幹細胞所誘導分化的神經幹細胞可以再分化成為中樞 神經系統的細胞，或改善腦中受損區的微環境，回復生理功能。
叄、材料與方法
B. Hyclon fetal bovine serum (Thermo) C. β-mercaptoethan (Invitrogen)
D. L-Glutamine (Invitrogen) E. Penicillin
F. Streptomycin
G. DMEM/F12 (GIBCO) H. ITS-G media supplement I. N-2 media supplement J. bFGF (Invitrogen) K. Fibronectin
J. Nanog
PBS，PFA，Choral hydrate, Hoeschst 33342 (bisbenzimide) 1.3 實驗儀器與耗材
2.2 iPS 細胞誘導分化成為神經幹細胞
先使用不含有LIF的幹細胞培養液[ 85% DMEM、15% Hyclon fetal bovine sreum、1% L-Glutamine、1 mM β-mercaptoethan、1%
non-essential amino acid、penicillin (100 U/ml)、streptomycin (100 µg/ml) ]懸浮培養2x106個iPS細胞於10公分細菌培養皿中，每兩 天更換一次不含LIF的幹細胞培養液。四天後，吸取由iPS所形 成的胚球體(embryo body)至一般的10公分細胞培養皿，待24小 時細胞貼附之後，更換培養液為ITS-FN [DMEM/F12添加2 mM L-Glutamine、penicillin (100 U/ml)、streptomycin (100 µg/ml)、
1% ITS-G media supplement、5 µg/ml Fibronectin ]。四天後，用 PBS清洗細胞兩次，並以0.05%的Trypsin-EDTA作用5分鐘，再 加入與Trypsin-EDTA等體積不含LIF的幹細胞培養液來終止 Trypsin-EDTA作用。將全部的細胞液吸取至15 ml離心管中，靜 置5分鐘，讓較大的團塊(未分化的胚球體)沈澱至管底。吸取上 清液到新的15 ml離心管並以800 rpm的速度離心5分鐘，之後去 除上清液，在以N-2培養液[ DMEM/F12添加2 mM L-Glutamine、
penicillin (100 U/ml)、streptomycin (100 µg/ml)、1% N-2 media supplement、20 ng/ml bFGF ]回溶細胞團塊，調整細胞密度為 1.5x105 cells/ml ， 並 將 10ml 的 細 胞 液 吸 取 至 事 先 以 Poly-L-ornithine/Fibronectin預處理[15 µg/ml Poly-L-ornithine溶 於PBS中，加入培養皿後至於37℃細胞培養箱中培養24小時。
2.3 流式細胞儀分析(Flow cytometry analysis)
吸乾培養神經幹細胞的培養皿內的培養液之後，利用PBS清洗 培養皿兩次，將培養皿上殘存的培養液沖洗乾淨。加入0.05%
的Trypsin-EDTA作用5分鐘，再加入與Trypsin-EDTA同體積的 培養液來終止Trypsin的作用，收取所有的細胞液到15 ml離心管 中，以800 rpm離心5分鐘後去除上清議，再用FACS buffer (5%
FBS、2 mM EDTA溶於1x PBS中)回溶，並調整細胞密度為5x105 cells/ml~1x106 cells/ml。取200 µl的細胞與p75的1級抗體(2.5 µl/5x105 cells)作用30分鐘，在加入2級抗體(anti-rabbit conjugated PE)避光作用30分鐘，並另取200 µl的細胞液與rabbit IgG isotype (PE-conjugated)抗體反應1小時，來當作控制組。染色完成後，
小鼠利用4%的Choral Hydrate進行麻醉，劑量給予10 µl/g。等到 藥劑生效之後，以剃毛刀將小鼠的頸部、頭頂至右耳前方以及
2.5 MPTP 誘導帕金森氏症小鼠模型建立 先以Hoechst 33342處理1小時來作標記(1 µl /ml)，1小時後離心，
去 除 上 清 液 後 再 以 生 理 食 鹽 水 回 溶 。 施 打 細 胞 的 順 序 為
2.8 n-butylidenephthalide (BP)餵食
n-butylidenephthalide (BP)為當歸的主要成份，本實驗中所使用 的n-butylidenephthalide 購於景明化工有限公司。餵食劑量為 500 mg/kg，以玉米油(SIGMA)作為中間調和劑。
2.9 動物行為模式分析
2.9.3 Beam Walking
以一架高且狹窄的橋來評估嚙齒類動物的協調能力[36]。橋的
將大腦部位均分為3 mm的厚度。靠近嗅球的部分稱為A，反之 片浸泡在0.3% Triton-X100中30分鐘，讓細胞膜穿孔，後以 TBST/PBST清洗玻片10分鐘來洗淨0.3% Triton-X100，用5%
FBS調配而成的blocking buffer處理玻片1個小時，來阻擋抗體的
Enzyme-linked Immunosorbent Assay kit for Dopamine。
2.13 TUNEL assay
先以 PBS 清洗玻片 5 分鐘，將鼠腦切片外圍的 OCT 洗淨。將 腦片浸泡在0.2% Triton-100/PBS 中 5 分鐘來打開細胞膜，再利 用PBS 清洗玻片兩次，每次清洗 5 分鐘。將玻片平放在室溫的 染色盒中，以100 µl 的 Equilibration Buffer 浸潤 10 分鐘，再加 入50 µl 的 TdT Mix 到每個 sample，再將染色盒底部盛滿水以
避免 sample 乾掉，置於 37℃ 的避光環境 1 小時進行反應。1 小時後，加入 2X 的 SSC 終止反應，作用時間 15 分鐘。PBS 清洗玻片3 次，每次 5 分鐘。DAPI 用於染細胞核，再以水膠封 片 。 本 實 驗 所 使 用 的 TUNEL Kit 為 Promega 所 生 產 的 DeadEndTM Fluorometric TUNEL System。
2.14 統計分析
實驗數據以平均值加減其標準差(Means ± SD)來表示，利用 Student’s t-test來評估控制組與控制組和實驗組之間的平均差異。
相 關 數 據 機 間 的 差 異 則 利 用Two-way analysis of variance (ANOVA)分析，若p < 0.05則表示統計上有顯著的差異。
肆、結果 1. 誘導性萬能幹細胞分化
先前在我們實驗室已經以非病毒感染並且去除致癌基因的 方式製造出一株新的誘導性萬能幹細胞(iPS-OSH)，為了研究這株 幹細胞在臨床治療上的應用，我們希望將iPS-OSH專一性誘導，
使其分化成為神經幹細胞(neural stem cells, NSC)，iPS-OSH經過一 連串的步驟分化(Figure 1A)成為神經幹細胞後，我們利用神經幹 細胞專一性表現標記Nestin和Tuj1進行免疫螢光染色，實驗數據顯 示，大多數分化細胞皆有表現Nestin以及Tuj1 (Figure 1B)；而以 RT-PCR偵測神經幹細胞專一性基因的表現，結果顯示，Pax 6在 分化之後，有明顯增加的趨勢，而幹細胞專一性基因Oct 4的表現，
則是在分化後有減少的趨勢(Figure 1C)；另外，我們也利用流式 細胞儀(Flow cytometry)偵測表現在分化後的神經幹細胞表面的 Neurotrophin receptor (p75)，p75是一種穿模蛋白，又稱為nerve growth factor receptor，可以與一些神經營養因子結合，像是：
Neuron growth factor (NGF) 、 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)、Neurotrophin-3 (NT-3)和Neurotrophin-4 (NT-4)，所以可
用三種行為模式去評估手術前後以及治療與否的行為差異。三種 的14天以及21天，小鼠的移動距離有增加的趨勢(Figure 3A)；
Rotarod的數據也顯示出，在細胞移殖之後的7天及14天，小鼠維 持在旋轉軸上的時間也有增加的趨勢(Figure 3B)；Beam Walking 的數據顯示，不論是在時間(Figure 4A)或是四肢滑離beam的次數 (Figure 4B)，細胞移殖之後的14天及21天都有減少的趨勢。此結
(MPTP group)、口服 BP 治療組(BP group)、細胞移殖治療組(cells group)以及細胞移殖治療伴隨口服當歸的共同治療組(cells+BP group)，並使用兩種行為模式去評估手術前後以及治療與否的行 為差異。兩種行為模式分別為 Rotarod 以及 Beam walking。Rotarod 紀錄小鼠保持在旋轉軸上的時間，Beam walking 分成兩個部分，
一個為小鼠通過一段固定距離所需要的時間，另一個是小鼠在通 過一段固定距離的過程中，四肢滑出 beam 的次數。經過統計，
Beam Walking 的數據顯示不論是在時間(Figure 7A)或是四肢滑離 beam 的次數(Figure 7B)，細胞移殖之後都有減少的趨勢；Rotarod TH+ cells數量大量減少(Figure 8B)；在治療組別的部分，cells group 中，我們可以看到我們移殖的細胞(藍光)會遷移到SN，TH+ cells 的數量相較於MPTP group別有明顯的增多(Figure 8C)；cells+BP group中，SN的TH+ cells數量顯著的增加，移殖的細胞同樣會遷移 到SN (Figure 8D)；BP group中，SN的TH+ cells也有回復的情況，
細胞數量比cells group多，但沒有統計上的顯著差異(Figure 8E)。
另外，我們同時也觀察到在有移殖細胞的組別(cells and cells + BP) 中，除了會分化成多巴胺神經(TH) (Figure 9A and D)之外，還會 分化成為膠狀神經(GFAP) (Figure 9B and E)以及正在分化的神經 (Neu-N) (Figure 9C and F)。
7. 以免疫螢光染色探討利用 iPS-OSH 誘導分化的神經幹細胞 10C)；cells+BP group 中，SN 的 TH+ cells 數量顯著的增加(Figure 10D)；BP group，SN 的 TH+ cells 也有回復的情況，細胞數量稍 微比 cells group 多，但沒有統計上的顯著差異(Figure 10E)。在 striatum 中，一般小鼠的 striatum 中 TH 表現量很高(Figure 11 A)，
經過 MPTP 處理之後，TH+ cells 數量大幅減少(Figure 11B)；在治 量表現在 striatum 中(Figure 12B)；在治療組別的部分，不論是 cells group (Figure 12C), cells+BP group (Figure 12D)以及 BP group (Figure 12E)，Iba1 都有明顯減少。另外，在 SVZ 的區域，一般的 小鼠會表現細胞增生的 KI67 標記(Figure 13A)，經過 MPTP 處理 之後，不會有 KI67 的表現(Figure 13B)；在治療組別的部分，不 論是 cells group (Figure 13C), cells+BP group (Figure 13D)以及 BP
8. 以酵素免疫分析法來探討小鼠血液中多巴胺的表現量變化 根據先前的實驗數據顯示，在經過治療的組別，SN 區域的 TH+ cells 的數量都有增加，因此我們想知道在經過治療後，血清 中多巴胺的表現量是否有變化。從行為模式分析的數據我們可以 發現，在第 9 天，行為就有回復的現象。所以我們取了第 9 天以 及第 23 天的血清來做 DA 的 ELISA 分析。根據 ELISA 的結果 (Figure 14) ，在第 9 天的 MPTP group，其 DA 的表現量有顯著的 下降；而經過治療的組別(cells group, cells+BP group 以及 BP group)，DA 的量就已經回復到接近於正常表現的水平。第 23 天 的數據顯示，MPTP group 的 DA 表現量也逐漸回復到接近正常 表現的水平；而經過治療的組別((cells group, cells+BP group 以及 BP group)，DA 的量依舊維持表現。
9. 以 TUNEL assay 探討短時間(5 天)細胞移殖療法的機制
根據先前的研究，MPTP 會引發 SN 的細胞凋亡[11]。因此，
我們利用 TUNEL assay 來觀察經過治療後的變化。一般未經過處 理的組別，僅有些許的 TUNEL 表現(Figure 15A)，而經過 MPTP 處理過的組別，TUNEL 大量表現(Figure 15B)；在經過治療組別：
cells group (Figure 15C), cells+BP group (Figure 15D)以及 BP group (Figure 15E)都可以看見 TUNEL 的表現有顯著的下降，特別是 cells+BP group。
伍、討論
間葉幹細胞[44]、intracerebral peripheral blood stem cells (CD34+)[45]
以及嗅鞘細胞[46]。我們所使用的iPS-OSH derived neuronal stem cell 可以改善行為模式的數據(Figure 3、Figure 4) ，並且分化成為神經 (Figure 6)；取得的方式也比骨髓幹細胞以及intracerebral peripheral blood stem cells (CD34+)來得方便，在未來的臨床運用上有很大的效 力。 為 alpha-synuclein 蛋白錯誤摺疊而導致的 PD 有些許的不同[51]；本 實驗室從美國 Jackson Laboratory 引進一種帶有人類 synuclein, alpha
細胞來治療帕金森氏症：嗅鞘細胞[54, 55]，嗅鞘細胞在於神經損傷 的治療方面都有不錯的成效[56, 57]。我們所使用的 iPS-OSH derived neuronal stem cell 對於帕金森氏症的治療在細胞移植後 5 天就可以發 現行為模式的改善(Figure 5)，在 SN 區多巴胺神經的數量也有明顯增 加(Figure 8、Figure 10)，並且降低的細胞凋亡的發生(Figure 15)。
實驗的數據顯示，我們實驗室所製造的iPS-OSH對缺氧性中風以 及帕金森氏症都有治療的功效，有作為未來細胞移植臨床治療的來 源。
陸、結論
本實驗室製造出不帶致癌基因以及非病毒轉染的誘導性多功能
本實驗室製造出不帶致癌基因以及非病毒轉染的誘導性多功能