進一步確認分析miR828 可能的標的基因 RPK、TLD、MYB 在甘藷葉片傷害 後表現情形，分別收取葉片傷害後0.5、1、3 和 6 小時，進行 RT-PCR 分析(圖十
知，DPI 與 NMMA 會抑制傷害誘導 RPK、TLD 表現的情形。證實植物遭受機械 性傷害後調控 RPK、TLD 的表現量可能藉由 NADPH oxidase 產生 H2O2與NOS 產生NO 的影響。
四、 甘藷miRNA 釣取
我們採取Lu 等人於 2007 年發於 Methods 的方法進行釣取甘藷 miRNA (圖十 六)。我們選取甘藷植株進行機械性傷害 0、1 與 3 小時，並且分離 20-30 nts 的小 片段RNA(圖十六 A)。將分離出的 20-30 nts 的小片段 RNA 分別接上 5 端與 3 端 接合子(5’ adaptor 與 3’ adaptor)，並且將之反轉錄成 cDNA，再進行 PCR 反應並 將所得為70-85 nts 大小的片段(圖十六 B)回收，並將之構築於 yT&A 載體上。再 以M13 引子進行 PCR 反應進行確認(圖十六 C)，目前我們約獲得 100 株菌落。
待獲得更多菌落，再進行點晶片(array)，並且經由微陣列晶片(microarray)篩選傷 害相關的菌落，再將篩選出的菌落進行序列分析，以便獲得專屬甘藷傷害相關的 miRNA。
第四章 討論
一、 miR159、miR407、miR828 表現情形
由於未有甘藷 miRNA 的釣取與研究，且 miRNA 序列在演化具有高度的保 留性，我們利用其具有高度保留性的特性，用阿拉伯芥miRNA 的序列當作探針 偵測甘藷植株miR159、miR407、miR828 表現情形(圖一)。
miR159 在演化是屬一高度保留性 miRNA，在種子植物(seed-bearing plants) 中皆可發現。在前人研究中miR159 在韌皮部汁液中扮演著傳遞訊息的角色(Yoo et al., 2004)，參與生長發育與逆境調控(Reyes et al., 2007)，而我們利用阿拉伯芥 miR159 的序列當作探針偵測到在甘藷植株莖中有 miR159 大量表現，而在葉中 則偵測到極少量。由這結果間接推測甘藷的miR159 可能亦存於汁液中扮演著傳 遞訊息的角色，參與甘藷生長發育與逆境調控，但在機械性傷害後並無造成 miR159 表現量有所差異，所以 miR159 可能與甘藷傷害逆境防禦調控無相關。
miR407 在阿拉伯芥中發現，而且具有兩成員，表現在全株植株上，而在其 他物種尚未有對miR407 進行偵測或分析實驗(Sunkar and Zhu, 2004)。而我們利 用阿拉伯芥miR407 的序列當作探針亦無偵測到在甘藷植株中有 miR407 的表現。
miR828 被認為一非保留性的 miRNA，目前只在阿拉伯芥中發現，主要表現 在果莢(siliques)上，但 miRNA 電腦分析預測上，卻在其他物種上發現可能存在 著miR828 或同質性序列(orthologs)，如：葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryza sativa)、
白楊(Populus trichocarpa)、乳漿大戟(leafy spurge)、油菜(Brassica)，其中某些物 種已獲得證實(Rajagopalan et al., 2006)。而我們利用阿拉伯芥 miR828 的序列當作 探針偵測到在甘藷植株葉片中有miR828 表現，而在莖中則沒有。相同的 miRNA 在不同物種間也可能扮演不同角色，表現區域也可能不同(Combier et al.,2006)。
在阿拉伯芥中miR828 主要表現在果莢(siliques) (Rajagopalan et al., 2006)；而甘藷
miR828 則在葉中，且在機械性傷害後 miR828 表現量有被抑制情形(圖二)，所以 miR828 可能參與甘藷傷害逆境防禦調控，藉由 miR828 表現量降低而使其標的 基因表現達到參與調控傷害逆境防禦機制。 六、圖七)。傷害防禦機制相關的分子對 miR828 表現量的影響說明著抑制 miR828 進而可能調控甘藷傷害逆境防禦。
二、 miR828 的訊息傳遞過程
H2O2與NO
在植物的防禦機制，H2O2的主要來源是藉由NADPH-dependent oxidase 系統 (Lamb and Dixon, 1997)。我們事先將葉片處理 NADPH oxidase 抑制劑 DPI 抑制 H2O2生合成，再傷害葉片，發現 DPI 會影響傷害後 miR828 的表現量，傷害後 miR828 被抑制的效果減低(圖四)。甘薯葉片遭受機械性傷害後是藉由 NADPH oxidase 產生 H2O2達到抑制miR828 表現量。但 DPI 影響傷害後的 miR828 表現 量並非完全抑制傷害後 miR828 降低的效果，所以可能是因 H2O2的生成來源透 過多樣的途徑而NADPH-dependent oxidase 系統只是其中之一，或者另有其他訊 息分子也參與在其中。
NO 產生方式主要藉由兩種酵素的作用方式產生(Wendehenne et al., 2004)，
一為NO synthase (NOS)，另一為 Nitrat reductase (NR)。而目前在植物中只有兩
個NOS 被確認，且皆防禦反應相關，一為 pathogen inducible NOS (iNOS)，另一
外加 MeJA 亦可抑制 miR828 表現量。而 MeJA 與 H2O2兩者之間關係，由實驗 結果得知，DPI 會影響 MeJA 處理後 miR828 的表現量(圖五、圖七)。在 DPI 存 在時與僅處理MeJA 比較，miR828 表現量有減少被抑制的情形。藉此我們推測，
MeJA 誘導活化 NADPH oxidase 產生 H2O2，進而影響miR828 的表現量。前人研 究 指 出 ， 提 供 番 茄 葉 片 MeJA 或 是 傷 害 可 以 偵 測 到 H2O2 大 量 產 生 (Orozco-Cárdenas and Ryan, 1999)；DPI 完全抑制 MeJA 引起的 ipomoelin (IPO) 基因表現。所以植物遭受到傷害後誘導 MeJA 產生進而活化細胞膜上 NADPH oxidase 產生 H2O2及透過其他訊息分子，而調控防禦基因表現。
此外，我們結果知MeJA 和 NO 皆會誘導 H2O2產生，且前人研究也指出，
JA 也會誘導 NO 生合成(Wendehenne et al., 2004)。推測植物遭受到傷害後誘導 MeJA 產生進而活化 NOS 產生 NO 再活化 NADPH oxidase 產生 H2O2或者MeJA miR828 表現量。在番茄受傷必須透過 ethylene 產生，進而誘導 JA 生成 (O'Donnell et al., 1996)；但在冬南瓜則呈現相反的傳遞路徑，JA 活化 ACC synthase 基因，
進而生合成ethylene (Watanabe and Sakai, 1998)。而 ethylene 與 JA 兩者之間對 miR828 的關係，由我們實驗結果得知，JA 生合成抑制劑 DIECA 會影響 ethylene 處理後 miR828 的表現量，而 ethylene 生成抑制劑 AVG 不會影響 MeJA 處理後 miR828 的表現量(圖七)。這說明著 ethylene 會透過 JA 的生成調控 miR828 的表
現量。
此外，MeJA 會誘導活化 NADPH oxidase 產生 H2O2，進而影響miR828 的表 現量。我們另用處理NADPH oxidase 抑制劑 DPI 後，再外加 ethylene，分析甘薯 葉片中DPI 對 ethylene 抑制 miR828 的影響，在 DPI 存在時與僅處理 ethylene 比 較，miR828 表現量有減少被抑制的情形(圖七)，這說明著 ethylene 也透過 H2O2
調控miR828。
綜合來說在植物防禦中，ethylene 會透過 JA 產生再促使活化 NADPH oxidase 產生H2O2生成，進而調控下游防禦相關基因(圖十五)。
CO
CO 是近年來研究知其在植物體內也扮演生物訊息傳遞分子之一。除了參與 生長發育外，在氧化逆境防禦調控上也是重要的，藉由活化氧化逆境防禦機制的 酵素，如：superoxide dismutase (SOD)、catalase (CAT)、peroxidase…等，消除氧 化造成的傷害(Han et al., 2008)。而我們實驗結果中，CO 會影響傷害後 miR828 的表現量，使得傷害後降低miR828 表現量的情形被抑制(圖八)。CO 可能藉由清 響傷害後miR828 表現量，抑制傷害後降低 pre-miR828 表現量的情形。這說明著 傷害防禦機制中 Ca2+對於訊息傳遞的重要性。此外，植物傷害後細胞內 Ca2+的
增加會促使 MeJA 生合成(Memelink et al., 2001)。而且我們外加 MeJA 降低
藉此參與傷害防禦機制。此外，ethylene 也會透過 MeJA 抑制 miR828 表現，而 CO 會在之中清除 H2O2進而抑制傳遞過程。
三、 miR828 標的基因表現情形
RPK (receptor protein kinase)
RPK利用NCBI蛋白質功能區搜尋比對主要有LRRNT (leucine-rich repeats)與 PTKc (protein tyrosine kinase family catalytic domain)兩區域(圖十一)。LRR-RPKs 具有參與植物生長發育與調控防禦相關機制的功能。而在我們實驗結果中，甘藷
白質轉譯(Mallory et al., 2004)。而miR828與RPK表現互補情形較不同，且RPK與 miR828的5端互補性高，推測miR828調控RPK的機制可能為抑制蛋白質轉譯層 面。由於此類型的調控機制多為動物miRNA，且植物miRNA對於此類型的調控 機制尚不明確，只有Mallory等人研究推測植物某些miRNA調控標的基因亦與動 物的調控機制相似。所以我們也著手進行植物體內實驗(in vivo miRNA-directed cleavage)進一步證實miR828調控RPK的機制為抑制蛋白質轉譯層面。
RPK在傷害後短時間有大量表現的情形，且為一種receptor protein kinase，推
測其可能為傷害早期反應基因，扮演接收訊息分子放大傷害反應訊號。與傷害反 應相關基因systemin receptor SR160也屬於LRR-RPKs之一，感受到systemin會活化 MAPKs、Ca2+-dependence protein kinasem與誘導產生ethylene、ROS和JA…等相 關訊息傳導，放大傷害反應訊號。我們在外加H2O2、NO與MeJA等傷害相關誘導 的OXR1 區域(Oxidation resistance protein)。TLD 功能現今未知，其可能具有酵 素功能。而在我們實驗結果中，甘藷 TLD 在傷害後短時間內些微下降，而於 3 小時表現量上升(圖十二)，與 miR828 傷害後表現被抑制情形呈現相似互補情 形。且 TLD 與 miR828 序列互補性中有三個錯配，G:U 視為配對的，符合可能為
miRNA 標的基因的條件，調控降解 mRNA。所以我們也著手進行植物體內實驗 (in vivo miRNA-directed cleavage 或 modified RNA ligase-mediated 5’ RACE)進一 步證實miR828 能調控 TLD 基因。
但在外加H2O2、NO與MeJA中TLD表現量些微上升(圖十二)，與miR828傷害 後表現被抑制情形呈現較不相似互補情形，TLD上升的量與miR828抑制量不相 對。推測我們直接外加甘薯葉片H2O2、NO與MeJA可能造成其負回饋作用，抑制 TLD基因的表現。或者推測為miR828調控TLD的機制為降解mRNA與抑制蛋白質
轉譯雙層面進行，如同miR172雙層面同時調控AP2-like基因(Aukerman and Sakai, 2003; Chen, 2004)，所以TLD mRNA的表現量在傷害誘導劑處理下無改變，直接 藉由miR828的量減少進而增加TLD蛋白質的累積增加。 們也著手進行植物體內實驗(in vivo miRNA-directed cleavage 或 modified RNA ligase-mediated 5’ RACE)進一步證實 miR828 能調控 MYB 基因。
但甘藷MYB在前段約100 bps處後面多出一段與牽牛花MYB和棉花MYB2完 全不相似的68 bps序列，且在這68 bps中含有一終止密碼子，造成蛋白轉譯提早 停止。因此我們推測此MYB可能為假基因，不具有功能性表現。假基因現今研究 功能尚不清楚，目前已知研究的有假基因藉由產生small interfering RNAs (siRNA) 影響基因的表達(Tam et al., 2008)，及假基因轉錄出假RNA進而調控同源基因 RNA的穩定性(Hirotsune et al., 2003)。在阿拉伯芥中miR828調控MYB113與TAS4
基因。而miR828與TAS4的兩者關係是miR828調控TAS4基因產生更多的siRNA，
進而調控其他MYB基因的表現。推測此MYB可能受miR828調控產生siRNA進而影 響其他基因的表現。
四、 結論
植物遭受傷害後，促使NO 與 MeJA 生合成，MeJA 進而活化 NOS 產生 NO，
NO 再活化 NADPH oxidase 產生 H2O2，或者MeJA 本身也會透過過其他分子，
而抑制miR828 表現進而調控 miR828 標的基因 RPK、TLD、MYB 的表現，藉由 標的基因的表現進而可能參與傷害防禦機制。而miR828 標的基因被 miR828 調 控機制分別推測為RPK 蛋白質轉譯可能受到 miR828 抑制；TLD 則受到 miR828 調控機制的雙層面進行：TLD mRNA 降解與 TLD 蛋白轉譯抑制；而 MYB 則是 mRNA 受到 miR828 降解。此外，ethylene 也會透過 MeJA 抑制 miR828 表現，
而CO 會在之中清除 H2O2進而抑制此傳遞過程。
圖表
表一、本論使用的引子與miRNA 序列 miRNA clone
3-adapter GTCAACGGGATCCCGACTGCTCAGGCGGTTCGCCGCCTGAGC 3-adapter primer AGTCGGGATCCCGTTGAC
5-adapter rCrArGUrCrArGUrGUrArCrGrGrArAUUrCrCrAUrG 5-adapter primer CATGGAATTCCGTACACTGACTG
In Vitro transcription T3 Top strand ATGAATTAACCCTCACTAAAG
In Vitro transcription T3 Top strand ATGAATTAACCCTCACTAAAG