行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
兒童過敏性紫斑症血管內皮細胞自體抗原之探討(1/2)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2314-B-002-223- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院小兒科 計畫主持人： 楊曜旭 共同主持人： 江伯倫 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 5 月 25 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
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成 果 報 告■
期中進度報告（計畫名稱）
兒童過敏性紫斑症血管內皮細胞自體抗原之探討
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 92－2314－B－002－223－
執行期間：2003 年 08 月 01 日至 2004 年 07 月 31 日
計畫主持人：楊曜旭
共同主持人：江伯倫
計畫參與人員：
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：▓精簡報告 □完整報告 本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 □出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份 處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫 及下列情形者外，得立即公開查詢 □涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢執行單位：國立台灣大學醫學院小兒科
中 華 民 國 93 年 05 月 25 日
中文摘要 關鍵字：過敏性紫斑症，內皮細胞，自體抗體，自體抗原 過敏性紫斑症是一種好發於兒童的全身性小血管炎。臨床表現上，常於下肢及 臀部出現典型的紫斑，病童也常伴隨關節發炎、關節痛、四肢水腫、腹部疼痛、 血便等症狀。更甚者，會侵犯腎臟造成腎絲球腎炎或是侵犯腸胃道造成腸胃穿恐 等嚴重之併發症。病理切片上可發現多型性白血球浸潤在小血管週邊，血液中 IgA 抗體會明顯升高，同時亦發現含 IgA 的免疫複合體會沉積於血管基底膜。治 療上，以支持性療法為主，類固醇或是免疫抑制劑通常只使用於嚴重的病例。 過敏性紫斑症的致病機轉到目前為止仍不清楚，只知道是因為一些免疫系統不 正常的活化所造成。臨床上的研究觀察發現：在病發之前，大部份的病童都有上 呼吸道感染的症狀。而且大多於秋冬季節發作。因此推論過敏性紫斑症可能跟某 種病原體的感染有關：在病原體進入體內之後，啟動了免疫系統，造成細胞激素 的分泌，進而誘發抗體的產生，尤其是IgA 抗體，而抗體與血管內皮細胞的交互 作用導致血管的發炎與破壞。 本研究的主要目的是希望藉由各種實驗設計以確定過敏性紫斑症的致病機 轉。首先建立人類血管內皮細胞的培養，並收集患病兒童急性期及緩解期之血 清。接著以螢光染色法及以內皮細胞為基底之酵素免疫法，確定病童抗內皮細胞 抗體的存在，並探討抗體與血管內皮細胞交互作用的機轉。之後將進一步建立病 童抗體資料庫。用所建立的病童抗體資料庫或含自體抗體之病人血清篩選內皮細 胞 為 抗 原 蛋 白 ， 純 化 自 體 抗 體 ， 配 合 西 方 印 漬 法 （SDS-PAGE and 2-D immunoblotting）進一步找出內皮細胞之抗原決定部位。完成此研究，將可進一 步釐清過敏性紫斑症的致病機轉。對於疾病的預防與治療將有實質的助益。 先前九個月的時間，我們分別完成（1）分離並維持人類內皮細胞的培養，（2） 收集二十位病童不同時期的血清，（3）確定病童急性期血清中含有 IgA 抗血管內 皮細胞抗體，（4）釐清抗體（病童急性期血清）與內皮細胞作用關係（Yang YH,
et al. Ann Rheum Dis 2004），（5）分離內皮細胞各層之蛋白質。未來將按照進度
建立病童抗體資料庫。用所建立的病童抗體資料庫或含自體抗體之病人血清篩選 內皮細胞為抗原蛋白，配合西方印漬法進一步找出內皮細胞之抗原決定部位。
Abstract
Key words: Henoch-Schönlein purpura, endothelial cell, autoantibody, autoantigen Henoch-Schönlein purpura (HSP) is one of the most common types of vasculitis in childhood. Histologically, it reveals the change of leukocytoclastic vasculitis, and has been well regarded as a specific clinicopathological entity by the vascular deposition of immunoglobulin (Ig) A-dominant immune complexes and elevated serum IgA level. The pathogenesis of HSP remains undetermined. Clinical observations have found striking seasonal variations in HSP, with most cases occurring in the winter and autumn. HSP has also been associated with a history of preceding infections, especially upper respiratory tract infection. These results raise the possibility of infection as a direct cause or a potential trigger of this disease. It is speculated that some microorganisms with specific antigenic structures, which mimic some components of blood vessel enters the respiratory or gastrointestinal tract and stimulates the T cells residing in the mucosa. Inflammatory responses are elicited with the participation of various immunocompetent cells and their humoral counterparts. The antibodies, and other immune cells against the microorganisms may cross-react with the specific component of the vessel and lead to the inflammation of vessels. The aims of this project are to design experiments to determine the pathogenesis of childhood HSP. In the previous 9 months, we have completed the following works: (1) we have set up and maintain the culture of human endothelial cells. (2) The serum samples of 20 HSP children were collected at different stages. (3) By means of immunofluorescence assay and cell-based ELISA, we have confirmed that IgA anti-endothelial cell antibodies developed during the acute stage of HSP. (4) The interactions of antibodies (acute sera of patients) and endothelial cells have been investigated (Yang YH, et al. Ann Rheum Dis 2004). (5) The membrane protein/cytoplasmic protein have been separated and collected. In the future, we will further establish the antibodies library of children with HSP. Then, the autoantibodies against EC will be determined by the screen of the HUVEC cDNA library or EC membrane and cytoplasmic proteins. Using the screened antibodies or sera of patients at the acute stage, the disease-specific antigen will be determined by Western blotting (SDS-PAGE and 2-D immunoblotting). If this study can be performed and completed smoothly, the pathogenesis of this common childhood vasculitis will be much clear, and that are very important in the prevention and the treatment of this disease.
報告內容 前言 過敏性紫斑症是一種好發於兒童的全身性小血管炎，侵犯的部位以表皮為 主，臨床上可觸摸的紫斑及瘀青大多出現於下肢，並且常常會伴隨關節發炎腫 痛。因為血管的發炎造成其通透性的增加，因此也常常伴隨四肢水腫及其他軟組 織的水腫（如陰囊、頭皮的水腫）。有部分患者會合併有腸胃道、腎臟等內臟器 官的侵犯，而造成腸道穿恐及腎衰竭等嚴重併發症。國外臨床統計顯示高達百分 之四十的紫斑症病童會併發腎絲球腎炎，並有少數病童會進展到腎衰竭而需要洗 腎。診斷方面，主要是根據臨床症狀 (如年齡，下肢出現紫斑，腹痛，關節腫痛)。 組織切片顯示此為一種 “leukoclastic vasculitis”，即血管壁周邊發現有多型性白 血球的浸潤。螢光染色後發現含 IgA 的免疫複合體 (immune complex) 沉積於 血管壁；實驗室檢查則發現，血清中的 IgA 抗體在急性期會明顯上升 的情況。 與大多數其他全身性的血管炎一樣，過敏性紫斑症的致病機轉至今仍不清 楚。由於它的發作有季節性，又常在病發之前先有一上呼吸道感染。所以，目前 認為此疾病與感染有著密不可分的關係。感染可能是一個重要的誘發因子。但 是，透過何種機轉造成最後全身小血管的發炎乃是有趣也是值得去探究的問題。 根據之前的研究顯示，病人血液中IgA 抗體在急性期會有上升的現象，這與一般 病菌感染之後血液中 IgM 與 IgG 抗體上升的情形不同，可說是此疾病的一個重 要 的 特 點 。 組 織 切 片 上 顯 示 ： 在 血 管 基 底 膜 亦 會 有 含 有 IgA 免疫複合體 （immune-complexes）的沉積。除此之外，一些研究；包括我們自己的研究發現： 有一些細胞激素在過敏性紫斑症的生成上也扮演著相當重要的角色，TNF-α的上 升可能會誘發血管內皮細胞上沾粘因子（adhesion molecules）的表現，進而導致 多型性白血球的聚集。TGF-β則與IgA 抗體的上升有著相當密切的關係。根據此 疾病的臨床特點與目前實驗室上的發現，再加上「分子相似說」“molecule mimicry”的理論假說，針對過敏性紫斑症我們提出一個可能的致病機轉：當病 童經由呼吸道或腸胃道感染了某種病原體。此病原體經過呼吸道或腸胃道黏膜而 進入體內。在人類黏膜中存有特殊結構的淋巴系統統稱為「Mucoid associated lymphoid tissue」，此淋巴系統中有一類的 T 淋巴球具有分泌 TGF-β的功能（TH3 cells）。我們的實驗發現在病童急性期時，周邊血液中亦可找到此類 T 細胞，而 隨著疾病的緩解此細胞也慢慢消失不見。因此推論病原體進入體內的過程中會活 化TH3 cells，而 TGF-β的分泌則可以解釋血中IgA 抗體的升高。當外來的病原 體進入體內後，經過抗原呈現細胞的吞噬與處理，與 T 淋巴球作用。部份抗原 則與B 淋巴球結合，藉由 T 淋巴球的及細胞激素的幫忙進行”class switch”，分泌 大量IgA 抗體。在身體內，特別是血管壁內層，其中部分的組織結構可能與病原 體抗原結構相似，因此 IgA 抗體及其他免疫細胞如 T 淋巴球，除了會攻擊病原 體外，亦會與該血管結構反應，一方面形成免疫複合體；一方面可能造成細胞的 直接攻擊。此含有 IgA 的免疫複合體將引發非典型的補體系統活化或是透過細
胞表面沾粘因子與受體的作用，吸引發炎細胞的聚集，造成血管的發炎。另一個 可能的機轉是病原體進入病童體內後，引起一連串反應，最後將血管壁上隱藏的 抗原（cryptic antigen）揭露，引發體液性與細胞性的免疫活化，終而造成血管的 發炎。 為了探討國內兒童過敏性紫斑症疾病流行病學、臨床表現以及疾病病程，我 們已於先前的研究收集近幾年的病例，記錄疾病病徵、追蹤病程及其預後。此外， 為了證實上述致病機轉假設，最重要的事即是找出可能與IgA 抗體結合或與免液 細胞作用的血管抗原結構。內皮細胞是血管最內層的結構，也是血管直接接觸血 液的組織。於是我們推論與過敏性紫斑症相關的血管特殊抗原結構或許就存在於 內皮細胞上。若病童於發病的同時，血液中存在大量的抗內皮細胞抗體，則我們 的推論初步可成立。很多結締組織疾病或者是全身性血管炎（如紅斑性狼瘡，硬 皮症，風溼性關節炎，皮肌炎，川崎氏症，Takayasu’s 動脈炎）都已經被證實存 在有不同型（IgG，IgM）的抗內皮細胞抗體，而這些抗體在致病的過程中也都 扮演著重要的角色，In vitro 實驗發現：若將病人血液中的抗內皮細胞抗體與人 類內皮細胞一起培養，並加上補體，結果發現內皮細胞會被破壞。測試抗內皮細 胞抗體的方法很多：immunofluorescence assay，enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) ， fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis ， immunoblotting。而目前最常使用的方法是 cell-based ELISA。內皮細胞可經由不 同的組織血管或是cell line 取得，但最經濟最方便的方法乃是以 collagenase 將人 類臍帶靜脈中的內皮細胞取出，再進行培養。但是因為過敏性紫斑症是一小血管 血管炎，且實驗發現不同來源的血管內皮細胞其生理特性可能不同。所以，必須 再取得一人類小血管內皮細胞以為實驗所需。 目的： 本研究的主要目的是希望藉由各種實驗設計以確定過敏性紫斑症的自體抗原，進 一步釐清此病的致病機轉。這一個計畫將為期兩年。首先我們將收集病童急性期 與對照組的血清，維持人類血管內皮細胞的培養。接著以螢光染色法及以內皮細 胞為基底之酵素免疫法，再次確定病童抗內皮細胞抗體的存在，並利用含抗體之 病童血清釐清抗體與內皮細胞之間的作用關係。之後，利用病童急性期的周邊單 核球進一步建立病童抗體資料庫，以所建立的病童抗體資料庫或病童急性期血清 篩選人類內皮細胞之cDNA library；或是以內皮細胞之 membrane and cytoplasmic protei 為抗原蛋白來源，並配合西方印漬法（SDS-PAGE and 2-D immunoblotting） 找出內皮細胞之抗原決定部位及純化之自體抗體。完成此研究，將可進一步釐清 過敏性紫斑症的致病機轉。除了對於疾病的預防與治療將有實質的助益，對於其 它機轉不明的immune-mediated 疾病也提供一個研究的模式。
文獻探討：
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（研究方法，實驗步驟，及結果僅包含目前完成部分2003/08/01-2004/05/31） 研究方法： 1. 收集二十名過敏性紫斑症病童急性期及十名健康對照組之血清與周邊單核細 胞。 2. 培養及維持人類血管內皮細胞。 3. 以免疫螢光及酵素免疫法確定病童急性期血中含有抗內皮細胞抗體。 4. 利用病童急性期血清（含抗內皮細胞抗體）與內皮細胞作用，決定內皮細胞 是 否 會 因 此 而 活 化 ： 產 生 各 種 細 胞 激 素 及 大 量 表 現 黏 附 因 子(adhesion molecules)。 實驗步驟： （一）人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的培養
取得人類臍帶後將collagenase (GIBCO BRL Life Technologies)灌注進入臍靜脈，
經過十分鐘水浴即可將 HUVEC 分離出來。分離下來的 HUVEC 種入先以 1%
gelatin 處理過的 75 ml flasks。培養液的成份包括：medium 199 (GIBCO BRL, Life Technologies)，15% heat inactivated fetal calf serum，heparin sulfate，L-glutamine， 內 皮 細 胞 生 長 激 素 (final concentration, 20 µg/mL) ， 以 及 100 µg/ml penicillin/streptomycin。我們將取第二代至第六代的細胞以為之後的實驗的材料。 （二）內皮細胞的螢光染色
將內皮細胞附著於12-well Teflon-printed slides,並以acetone (10 min at –20℃)加以 固定，接著將其與blocking buffer (50% fetal calf serum in phosphate buffered saline (PBS)) 在37℃下作用30 min。細胞再與病人急性期的血清及控制組兒童的血清(1: 50 in PBS)作用一小時。經過沖洗的步驟，沾附細胞的玻片再與FITC-conjugated antihuman immunoglobulins (CHEMICON, Australia)作用一小時。最後經過沖洗後 以glycerol覆蓋並以螢光顯微鏡觀測其實驗結果。
（三）以cell-based ELISA偵測抗內皮細胞抗體
將HUVEC 與 人 類 表 皮 小 血 管 內 皮 細 胞 (HMVEC-d) (Clonetics, USA) 種 於 gelatin-coated 96-well microtitre plates (NuncTM, Demark) （ 細 胞 濃 度 為 1×105 cells/well）。經過三至四天細胞長滿後以0.2% glutaraldehyde in PBS於室溫下固定 十分鐘。接著與blocking buffer (1% bovine serum albumin (BSA)/0.05% Azide/0.1 M Tris in dd H2O) 37℃下作用60分鐘以防止非特異性的結合。沖洗後與病童急性
期的血清及控制組兒童的血清（the serum samples, diluted in dd H2O with 1% BSA,
0.05% Azide, 0.1 M Tris, and 0.05% Tween 20 at 1: 100 for IgG/IgM detection; 1:50 for IgA detection）37℃下作用兩小時。之後再與100 µl of peroxidase-conjugated rabbit anti-human IgG, IgA, and IgM immunoglobulins37℃下作用兩小時。沖洗後以 tetramethyl benzidine (TMB) (KPL, USA) solution作用15分鐘，加入stop solution (1 M hydrochloric acid) 5分鐘後，最後以ELISA reader在450 nm波長判讀結果。結果 將以ELISA ratio來表示【(ER)= 100×(S-A)/(B-A), where S is absorbance of sample, A is absorbance of negative control, and B is positive control】。若ER大於『mean + 3 SD of healthy controls』即代表病童的抗內皮細胞抗體是positive。
（四）過敏性紫斑症內皮細胞之活化
將血管內皮細胞與病童急性期、緩解期、及健康對照組的血清一起於37℃下作用 2小時，接著將血清倒掉加入不含血清的medium再作用24小時。之後收集上清液 並以ELISA kits偵測各種細胞激素(eg: IL-8)。另外，收集經過不同血清刺激的內 皮細胞以流式細胞儀分析細胞表面各種黏附因子的表現(eg: ICAM-1)。 （五）分離內皮細胞各層之蛋白質 從之前的研究，我們推測跟過敏性紫斑症相關的抗原蛋白結構應該是位於內皮細 胞之細胞膜上或是位於細胞質中。而且 TNF-α可能有加強抗原表現的傾向。所 以，先以TNF-α刺激人類血管內皮細胞，再取該細胞與Dnase I 及 MgCl2 一起作 用 37℃下作用一小時，沖洗後 1000xg 離心十分鐘，再與 homogenization buffer 作用。經2000xg 離心一分鐘細胞核的部份即可被分離出來。接著加入 1M CaCl2 作用十分鐘，3000xg 離心十五分鐘，可將細胞質部份的組成分離出。48,000xg 離心三十分鐘後可取得細胞膜上的組成結構。將細胞質的組成及細胞膜上的組成 結構加入solubilization buffer 十六小時，經過 15,000xg 離心三十分鐘後，可取得 細胞質中的蛋白質及細胞膜上的蛋白質。 結果： (1) 建立並維持人類臍靜脈內皮細胞的培養。 (2) 收集二十位過敏性紫斑症病童急性期及緩解期之血清。
(3) 抗血管內皮細胞抗體 (螢光染色)
The binding of serum IgA antibodies to HUVEC was confirmed by fluorescence microscopy in patients with acute HSP, but not in normal healthy controls (Figure 1 A, B).
(4) 抗血管內皮細胞抗體 (cell-based ELISA)
The level of IgA AECA between HSP patients (acute stage) and healthy controls were statistically different (53.7 ± 6.1 vs 19.7 ± 4.6 p = 0.001). Nine of patients (45%) revealed positive result for IgA AECA (> mean + 3 SD of healthy controls, i.e. > 62.9) (Figure 2 A), and the values of IgA AECA returned to normal range during the convalescent stage (p = 0.24, compared with healthy controls). For IgG and IgM AECA, by contrast, there was no difference between patients and controls (IgG 28.1 ± 5.8 vs 32.8 ± 7.9, p = 0.51; IgM 14.2 ± 3.3 vs 16.9 ± 6.3, p = 0.91) (Figure 2 B, C).
(5) 過敏性紫斑症血管內皮細胞之活化
Patients’ sera induced IL-8 release
HUVEC are primary human endothelial cells, which in vitro, without any stimulation would spontaneously release IL-8 when cultured in serum-free medium (Figure 1). The IL-8 levels in supernatants of HUVEC incubated with serum-free medium and sera from children with active HSP were statistically higher than the levels in supernatants of HUVEC in serum-free medium alone (1060.5 ± 69.3 pg/ml vs 854.7 ± 18.1 pg/ml, p = 0.001), HUVEC incubated with serum-free medium and sera from patients at the convalescent stage (1060.5 ± 69.3 pg/ml vs 851.6 ± 21.3 pg/ml, p = 0.004), and HUVEC incubated with serum-free medium and sera from normal healthy controls (1060.5 ± 69.3 pg/ml vs 735.2 ± 52.4 pg/ml, p = 0.004) (Figure 3).
ICAM-1 expression
The mean fluorescence intensity of ICAM-1 expression on HUVEC without any stimuli was around 50 (arbitrary units with a range: 0-100) (Figure 4a, 4e). TNF-α at a concentration of 10 ng/ml that highly activate the HUVEC to express ICAM-1 (97.3 ± 0.1 vs 48 ± 0.8, p < 0.001) was a positive control (Figure 4d, 4e). Incubation of HUVEC with either sera from patients with active HSP or those from normal healthy controls had negligible effect on the expression of ICAM-1 at 4 hours (data not shown), and 24 hours (Figure 4b, 4c, 4e).
結論、討論與自評：
從目前已完成的工作我們可確定：罹患過敏性紫斑症病童的急性期血清中，存在 一些可與血管內皮細胞結合的IgA自體抗體，我們稱之為IgA AECA。而這些抗體 究竟在致病過程中扮演何種角色？則須要更進一步去探討。於上述實驗中，我們 選取含高量IgA AECA的病童血清與內皮細胞一起作用。結果顯示含IgA AECA的 血清雖然無法誘使內皮細胞表現大量的黏附因子(ICAM-1)，但是，卻可刺激內 皮細胞產生大量的IL-8。而IL-8可促使骨髓釋放大量中性球，吸引中性球到發炎 部位，並活化中性球。如此，或許可解釋過敏性紫斑症切片的發現；血管壁周邊 發現有多型性白血球的浸潤。接下來一年多的時間我們將進行計劃未完成部分， 純化自體抗體及確定疾病特定的抗原。 整個為期兩年的計劃到目前為止仍照著既定的進度進行。並且已有一篇論文即將 付梓(Yang YH, Lai HJ, Huang CM, Wang LC, Lin YT, Chiang BL. Sera from
children with active Henoch-Schönlein purpura can enhance the production of interleukin (IL)-8 by human umbilical venous endothelial cells. Ann Rheum Dis 2004 (in press))。未來的工作將致力建立病童抗體資料庫。用所建立的病童抗體
資料庫或含自體抗體之病人血清篩選內皮細胞為抗原蛋白，配合西方印漬法進一 步找出內皮細胞之抗原決定部位。完成此計劃對於兒童長過敏性紫斑症之致病機 轉將有更進一步的了解。除了對疾病的預防與治療將有實質的助益，對於其它機 轉不明的immune-mediated 疾病也提供一個研究的模式。
Figure 1.
Figure 3.
