薑黃素引發人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 細胞凋亡的機轉研究; The Mechanisms of Curcumin-Induced Apoptosis of NCI-H460 Human Large Cell Carcinoma of Lung
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(2) 中文摘要 已陸續有報導薑黃素在抗癌上的效果。但薑黃素對於人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 的作用機轉卻未被詳細探討過。本研究以薑黃素處理人類大細胞 肺癌細胞 NCI-H460 以評估其抗癌效果。我們以不同濃度的薑黃素對 NCI-H460 細胞作用不同的時間，其後再評估後續的細胞形態、存活率、蛋 白質表現與 mRNA 轉錄等的變化。結果顯示：隨著薑黃素濃度增高至 20 μM 以上， NCI-H460 細胞凋亡與死亡的比率也隨之上升。.薑黃素處理 後，抗細胞凋亡的 Bcl-2、XIAP 和 Bcl-xl 蛋白表現量下降，促細胞凋亡的 Bad 和 Bax 蛋 白 表 現 量 增 加 。 此 外 ， 活 性 氧 化 物 (reactive oxygen species,ROS) 與細胞質內鈣離子的濃度也在處理後上升。這些訊號導致粒 腺體膜電位下降，後續激發了 caspase 9 與 caspase 3 的活化，最終產生細 胞死於細胞凋亡的結果。另外，薑黃素的處理亦可導致 Fas 蛋白質表現增 加與 caspase 8 的活化，而經由所謂的外路徑 (extrinsic pathway) 引起細胞 死於 細胞凋亡。我們也分別以 ROS 與 caspase 8 抑制劑來阻礙細胞凋亡 的訊息傳遞，結果發現在前述任一種抑制劑作用下，NCI-H460 細胞的死亡 率均明顯下降。這顯示了這些訊息傳導物質確實相當程度地介入了薑黃素 所引發的細胞凋亡。薑黃素另外可導致 NCI-H460 細胞週期停滯於 G2/M 期，此舉可能是藉由降低 cyclin-depedent kinase 1 來達成的。總結來說， 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 可產生引發細胞凋亡或導致細 胞週期停滯而達到抗癌的效果。我們認為它有潛力成為治療人類大細胞肺 癌的藥物。 關鍵字：細胞凋亡、細胞週期、薑黃素、肺癌。. I.
(3) 英文摘要（Abstract） Reports about the anti-cancer activities of curcumin are accumulating. However, its effect on human large cell carcinoma NCI-H460 cells has never been scrutinized. In this study, we used curcumin to treat human non-small cell lung cancer cells (NCI-H460) to determine its anti-cancer activity. Various concentrations of curcumin were added to NCI-H460 cells for different durations in vitro and the subsequent changes in cell morphologies, viabilities, cell cycles, intracellular proteins and mRNA expressions were investigated. We found curcumin, when over 20 μM in concentration, induced NCI-H460 cell apoptosis and morphologic changes in a dose-dependent manner.. After. curcumin treatment, Bax and Bad were up-regulated, Bcl-2, Bcl-xL and XIAP were down-regulated. In addition, reactive oxygen species (ROS), cytoplasmic calcium and endoplasmic reticulum stress were increased in NCI-H460 cells after treatment with curcumin. These signals led to mitochondrial membrane potential decrease and culminated in caspase-3 activation. Apoptosis could also be induced through Fas-caspase-8 (extrinsic) pathway. The cell death induced by curcumin could be significantly reversed by adding ROS or caspase 8 inhibitors. NCI-H460 cells tended to be arrested at G2/M cell cycle stage after curcumin treatment. Down-regulation of cyclin-depedent kinase 1 by curcumin may be involved in the mechanism of such an arrest. In conclusion, curcumin exerts its anti-cancer effects on lung cancer NCI-H460 cells through apoptosis or cell cycle arrest. Curcumin is potentially an anti-cancer therapy for human large cell carcinoma of lung. Key words: apoptosis, cell cycle, curcumin, lung neoplasms.. II.
(4) 誌 謝 在碩士班這段時間，天天都沈浸在求知的喜悅中。 感謝杭良文老師慨允指導我，在我剛到這個陌生的環境時給我諸多寶 貴的建議；也體恤我臨床忙碌，未苛責我在研究工作上經常有的虧欠。鍾 景光老師是我的另一位恩師。在他的指導下，我終可一瞥基礎研究的堂奧。 鍾老師著作等身、譽滿全球，卻虛懷若谷、毫無大教授的架子。每次參加鍾 老師實驗室 seminar，總是笑聲不斷、氣氛愉悅，讓我既驚訝又佩服。 還要感謝本所藍先元所長及顧正崙、曾昱綸老師等在雜誌論文討論會 時對我論文的建議與批評。這些意見在我下台後詳加考查，竟發現可引申 出非常寶貴的資料，我把它們整理後寫入本論文中「討論」欄內，使論文 涵蓋的面向更加深廣。特別感謝顧正崙老師幾次對我的稱讚，雖多溢美， 但使我重拾信心、意義重大。 彰基林楷煌主任准許我在職進修且多方支持我的研究工作，謹申謝悃。 內人子瑜在我仍信心不足時，鼓勵我報考研究所、又在我求學期間分 攤許多家務；我在學業上若有絲毫成就，她絕對功不可沒。 聖經說：「若不是耶和華建造房屋、建造的人就枉然勞力。若不是耶 和華看守城池、看守的人就枉然儆醒。」回首前塵，歷數上帝所安排的這 一切人與事，內心充滿感恩。我何其渺小卑微，竟能得這一切我根本不配 的恩典，只能說是神恩浩瀚。願上帝厚待這些有恩於我的師長與家人。. 吳莘華 謹誌於 中國醫藥大學 臨床醫學研究所 中華民國九十八年七月. III.
(5) 目錄 中文摘要. 頁次 I. 英文摘要. II. 誌謝. III. 目錄. IV. 圖表目錄. VII. 符號與縮寫. IX. 第一章 前言. 1 1. 第一節 研究背景 一、肺癌. 1. 二、薑黃素簡介. 2. 三、薑黃素的抗癌效果. 10. 四、細胞凋亡. 13. 五、細胞週期與細胞週期調控. 14 18. 第二節 研究目的. 19. 第二章 研究方法. 19. 第一節 研究材料 一、細胞株來源. 19. 二、細胞株特性. 19. 三、藥品試劑. 19. 四、儀器設備、器材. 22 23. 第二節 研究設計. 23. 一、實驗架構 （一）探討薑黃素對NCI-H460細胞生長之影響. 23. （二）探討薑黃素對 NCI-H460 細胞週期影響及細 胞凋亡之機制. 23. IV.
(6) 24. 二、實驗方法 （一）藥品配製. 24. （二）細胞培養. 25. A. 培養條件. 25. B. 細胞冷凍保存. 25. C. 繼代培養. 26. D. 藥物處理. 26. （三）流式細胞儀分析測定. 26. A. 細胞存活率測定. 27. B. 細胞週期分析. 28. C. 粒腺體膜電位之檢測. 28. D. 活性氧化物產生之檢測. 29. E. 鈣離子釋出之檢測. 30. F. Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 活性分析. 31. G. 加入Caspase 8 與 ROS 抑制劑的效果. 32. （四）免疫螢光染色與共軛焦顯微鏡顯像. 33. （五）西方點墨法（Western blotting）. 33. （六）Real Time PCR 分析 AIF、caspase 3、8、 9 以及endo G 的mRNA 轉錄表現量 第三節 統計方法. 35 36 37. 第三章 研究結果. 37. 第一節 描述性統計分析 一、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞株NCI-H460的增 生抑制與細胞形態改變 二 、薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 細胞 週期的影響. 37. 三、薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 產生活 性氧化物量的改變 四、薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 粒腺體. 44. V. 40. 45.
(7) 膜電位的影響 五、薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460之鈣離 子釋出影響 六、利用流式細胞儀檢測薑黃素對大細胞肺癌細胞 NCI-H460 之細胞凋亡相關蛋白質 Caspase-3、 Caspase-8 及 Caspase-9 活性的影響 七、加入Caspase 8 與 ROS 抑制劑對薑黃素在 NCI-H460 細胞影響的改變 八、免疫螢光染色法偵測 endo G、AIF、 cytochrome c、GADD153 與 GRP78 在細胞質與細胞核的 表現 九、利用西方墨點法檢測薑黃素對人類 NCI-H460 細 胞之凋亡與週期調控有關蛋白表現量的影響 十、 Real Time PCR 分析 AIF、caspase 3、-8、-9 以 及 endo G 的 mRNA 轉錄表現量 第二節 推論性統計分析. 47 48. 52 56. 59 62 63 64. 第四章 討論. 64. 第一節 結果討論 一、薑黃素濃度與生體可用率相關的結果討論. 64. 二、外路徑相關的結果討論. 65. 三、內路徑相關的結果討論. 65. 四、ROS 相關的結果討論. 66. 五、內質網壓力路徑相關的結果討論. 67. 第二節 其他相關性討論. 68. 第三節 研究限制. 69. 第五章 結論與建議. 70. 第一節 結論. 70. 第二節 建議. 70 70. 參考文獻. VI.
(8) 圖表目錄. 頁次. 圖 1.1. 薑黃的外形與薑黃素的萃取. 6. 圖 1.2. 薑黃素的化學結構式. 7. 圖 1.3. 薑黃素的結構名稱. 7. 圖 1.4. 薑黃素的兩種同分異構物. 8. 圖 1.5. 類薑黃素的化學結構式. 9. 圖 1.6. 可被薑黃素抑制或預防的癌症. 11. 圖 1.7. 薑黃素對於腫瘤進展的抑制及其可能的分子機轉. 12. 圖 1.8. 細胞凋亡的顯微鏡下的變化示意圖. 14. 圖 1.9. 細胞週期示意圖. 15. 圖 1.10. 不同的 cyclin 蛋白質在細胞週期間的濃度變化. 16. 圖 2.1. 薑黃素作用於 NCI-H460 細胞的實驗架構. 24. 圖 3.1. 37. 圖 3.4. 不同濃度之薑黃素處理 NCI-H460 細胞 24 小時後 的細胞存活率 不同濃度之薑黃素處理 NCI-H460 細胞 48 小時後 的細胞存活率 薑黃素作用 24 與 48 小時對 NCI-H460 細胞的毒殺 效果重疊作圖 薑黃素處理 24 小時後細胞的形態的改變. 圖 3.5. 薑黃素處理 48 小時後細胞的形態的改變. 40. 圖 3.6. 不同濃度之薑黃素作用 24 小時對 NCI-H460 細胞 細胞週期分佈影響 不同濃度之薑黃素作用 48 小時對 NCI-H460 細胞 細胞週期分佈影響 25 μM 薑黃素作用不同作用時間所造成的 NCI-H460 細胞之 ROS 產量變化. 42. 25 μM 薑黃素作用不同作用時間所造成的 NCI-H460 細胞之粒腺體膜電位變化 NCI-H460 細胞給予濃度 25 μM 之薑黃素所造成 的胞內鈣離子濃度變化. 46. 圖 3.2 圖 3.3. 圖 3.7 圖 3.8 圖 3.9 圖 3.10. VII. 38 39 39. 44 45. 48.
(9) NCI-H460 細胞接受 25 μM 薑黃素作用後其 caspase 3 活性的變化 圖 3.12 NCI-H460 細胞接受 25 μM 薑黃素作用後其 caspase 8 活性的變化 圖 3.13 NCI-H460 細胞接受 25 μM 薑黃素作用後其 caspase 9 活性的變化 圖 3.14 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有或無 Caspase 8 抑制劑(Z-IETD-fmk)的情況下，對 Caspase 8 活性與細胞存活比率的影響 圖 3.15. 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有或無 ROS 抑制劑 (NAC) 的情況下，對 ROS 產量與細 胞存活比率的影響 圖 3.16 經過 25 μM 薑黃素作用 24 小時後，以免疫螢光法 染色、共軛焦顯微鏡偵測 NCI-H460 內 endo G、 AIF、cytochrome c、 GADD153 與 GRP78 的含量 與位置 圖 3.17 用西方墨點法檢測薑黃素對人類 NCI-H460 細胞之 凋亡與週期調控有關蛋白表現量的影響 圖 3.18 Real Time PCR 分析 AIF、caspase 3、8、9 以及 endo G 的 mRNA 轉錄表現量 圖 3.19 薑黃素引發人類 NCI-H460 細胞凋亡的可能抑癌機 轉 表 1.1 各民族語言對薑黃的稱呼. 50. 表 1.2. 調控細胞週期之 cyclins 及其配合的 CDKs. 16. 表 2.1. 不同濃度之薑黃素溶液的配製. 24. 表 2.2. PCR 所使用的引子及其核酸序列. 35. 圖 3.11. VIII. 51 52 54. 56. 59. 61 63 68 2.
(10) 符號與縮寫 AIF: apoptosis inducing factor APAF1: apoptotic peptidase activating factor 1 BAD: Bcl2-antagonist of cell death Bax: Bcl2-associated X protein Bcl2: B-cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma 2 Bcl-xL: Bcl extra long CDK: Cyclin-dependent kinase CHOP: C/EBP homologous protein ΔΨm：Mitochondrial membrane potential DioC6: 3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodide DMSO: dimethyl sulfoxide Endo G: endonuclease G GADD153: growth arrest and DNA damage-inducible gene 153 GRP78: glucose regulated protein 78 H2DCF-DA: 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis NAC：N-acetylcysteine PCR: polymerase chain reaction PI: Propidium iodine PUMA, p53-upregulated modulator of apoptosis ROS: Reactive oxygen species. IX.
(11) 第一章 前言 第一節 研究背景 一、肺癌 在西元 1900 年時，肺癌還是一個十分罕見的疾病。上個世紀的一篇 肺癌的病例報告，指陳此病只是「醫學上古怪的病例、對治療幾全無反應、 太過罕見而沒有臨床上的重要性」(Pepper 1850)。然而，肺癌的發生率在 最近這數十年來呈現戲劇性地快速增長(Jemal et al. 2008) 。且由於目前尚 欠缺有效的治療，使得因肺癌而死亡的人數，不論在美國或是全世界都名 列第一 (Parkin et al. 2005)。 肺癌依組織形態被分成小細胞肺癌(small cell lung cancer)與非小細胞 肺癌(non-small cell lung cancer)兩大類形。前者約佔百分之十，後者則包括 腺癌(adenocarcinoma)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)及大細胞癌 (large cell carcinoma) （約佔 10%）三種主要類形，共約佔百分之九十(Johnson et al. 2008) 。分成這兩大類形的主要原因是無論在生物特質、臨床表現與 對治療的敏感度方面，它們之間都有很大的差異。 小細胞肺癌的第一線治療是以化療為主 (Alberg et al. 2005)。與小細胞 肺癌相比，非小細胞肺癌的增生、擴散較慢，對化療敏感度低，根治的辦 法是趁早把腫瘤完全切除。可惜的是可以開刀完全切除的早期病患（第 一、二期及第三期早期）不到三成，而手術後的復發率也不低；第一期（肺 局部之小腫瘤）約有四分之一；第二期（肺腫瘤較大，或小腫瘤但漫延到 肺門淋巴結）可能超過一半；第三期早期（肺腫瘤雖大，但沒有侵犯到主 要血管及內臟，，並可能超越肺門漫延到同側的縱隔淋巴結）更高，達四 分之三。這些復發的病例，不論期別高低，其中八成均有遠處轉移，而這 些轉移在手術之前應已發生，卻因為太小而偵測不出來。依此看來，不管 是小細胞或是非小細胞肺癌，都應該被當作全身性的疾病來考慮病人的治 1.
(12) 療，而要改善肺癌的治療率，局部與全身性的治療一樣的重要，都不能忽 視 (紀炳銓 2008)。 抗癌藥物對非小細胞肺癌效果不夠好，再加上抗癌藥物有抑制造血功 能（引發後續的感染及出血）及損傷其他器官（如噁心、嘔吐、掉髮、食 慾不振、疲倦無力、口腔潰瘍等）的明顯副作用，嚴重時甚至會危及生命。， 因此，研發出能夠抑制肺癌細胞並使其自行細胞凋亡，且不會產生過多副 作用的藥物，是有其的必要的。. 二、薑黃素簡介 天然植物是古代人們取得藥物的主要來源。在醫藥發達的今天，它們 仍然是新藥研發的首要源頭 (Harvey 2008)。在 1988 年至 2002 年間面世的 877 種小分子藥物中，其來源百分之 61 可以追溯到天然植物 (Newman et al. 2003)。雖然現代醫學界對於天然植物的藥用並不太重視，但普羅大眾至今 仍廣泛地使用它們作為藥劑。一項世界衛生組織的調查顯示：百分之 80 的開發中國家人民仍以天然植物解決其醫療需求 (Mukherjee et al. 2006)。 另一項以美國人為對象的研究顯示：每三個美國人中就有一個每天使用天 然植物；而在罹癌的病人中，此比例更高達百分之 50 (Goel et al. 2008)。 薑黃素 (Curcumin) 是由天然植物 Curcuma longa (又叫作 turmeric) 所提煉的。此植物早為世界各方、各民族所週知，因而各以其特有的語言 稱呼此植物。在中華民族的語言稱之為「薑黃」，又稱「鬱金」；阿拉伯 語稱為”Kurkum”, “Uqdah safra”，日語稱為”Ukon”, “Tamerikku”；英語 稱 ”Indian Saffron”。 更 詳 細 的 各 國 語 言 稱 謂 可 參 閱 Ravindran 的 著 作 (Ravindran 2006)，或見「表 1.1」：. 表 1.1 各民族語言對薑黃的稱呼 語言. 名稱 2.
(13) 語言. 名稱. Arabic. Kurkum, Uqdah safra. Armenian. Toormerik, Turmerig. Assamese. Halodhi. Bengali. Halud. Bulgarian. Kurkuma. Burmese. Hsanwen, Sanwin, Sanae, Nanwin. Catalan. Cúrcuma. Chinese. Yu chin, Yu jin, Wohng geung, Geung wohng, Wat gam, Huang jiang, Jiang huang, Yu jin, Yu jin xiang gen. Croatian. Indijski šafran, Kurkuma. Czech. Kurkuma, Indický Šafrán, Žlutý kořen, Žlutý zázvor. Dhivehi. Reen’dhoo. Danish. Gurkemeje. Dutch. Geelwortel, Kurkuma Tarmeriek, Koenjit, Koenir. English. Indian saffron. Esperanto. Kurkumo. Estonian. Harilik kurkuma, Kurkum, Pikk kollajuur, Lõhnav kollajuur. Farsi. Zardchubeh. Finnish. Kurkuma, Keltajuuri. French. Curcuma, Safran des Indes, Terre-mérite, Souchet des Indes. Galician. Cúrcuma. German. Curcuma, Kurkuma, Indischer Safran, Gelbwurz. Greek. Kitrinoriza, Kourkoumi, Kourkoumas 3.
(14) 語言. 名稱. Gujarati. Halad, Haldar. Hebrew. Kurkum. Hindi. Haldi. Hungarian. Kurkuma, Sárga gyömbérgyökér. Icelandic. Túrmerik. Indonesian. Kunyit, Kunir; Daun kunyit. Italian. Curcuma. Japanese. Ukon, Tamerikku. Kannada. Arishina, Arisina. Khmer. Romiet, Lomiet, Lamiet. Korean. Kang-hwang, Keolkuma Kolkuma, Sim-hwang, Teomerik, Tomerik, Tumerik, Ulgum, Ulgumun. Laotian. Khi min khun, Khmin khün. Latvian. Kurkuma. Lithuanian. Ciberžolė, Kurkuma, Dažinė ciberžolė. Malay. Kunyit basah. Malayalam. Manjal. Marathi. Halad. Nepali. Haldi, Hardi, Besar. Norwegian. Gurkemeie. Pahlavi. Zard-choobag. Pashto. Zarchoba. Polish. Kurkuma, Ostryż długi, Szafran indyjski. Portuguese. Açafrão da Índia, Curcuma 4.
(15) 語言. 名稱. Punjabi. Haldi. Romanian. Curcumă. Russian. Koren, kurkumy, Kurkuma. Sanskrit. Ameshta, bahula, bhadra, dhirgharaja, gandaplashika, gauri, gharshani, haldi, haridra, harita, hemaragi, hemaragini, hrivilasini, jayanti, jwarantika, kanchani, kaveri, krimighana, kshamada, kshapa, lakshmi, mangalaprada, mangalya, mehagni, nisha, nishakhya, nishawa, pavitra, pinga, pinja, pita, patavaluka, pitika, rabhangavasa, ranjani, ratrimanika, shifa, shiva, shobhana, shyama, soughagouhaya, suvarna, suvarnavarna, tamasini, umavara, vauragi, varavarnini, varnadatri, varnini, vishagni, yamini, yohitapriya, yuvati. Singhalese. Kaha. Slovak. Kurkuma. Slovenian. Kurkuma. Spanish. Cúrcuma, Azafrán arabe. Swahili. Manjano. Swedish. Gurkmeja. Tagalog. Dilaw. Tamil. Manjal. Telugu. Haridra, Pasupu. Thai. Kha min chan, Kha min; Wanchakmadluk. Tibetan. Gaser, Sga ser. Turkish. Hint safranı, Sarı boya, Zerdeçal, Safran kökü, Zerdali, Zerdeçöp, Zerdecube. Ukrainian. Kurkuma. Urdu. Haldi, Zard chub 5.
(16) 語言. 名稱. Vietnamese. Bot nghe, Cu nghe, Nghe, Uat kim, Khuong hoang. Yiddish. Kurkume （修改自(Ravindran 2006)）. 薑黃是一種多年生的草本植物，屬薑科（Zingiberaceae）。主要產於中國、 印度、東南亞等地。十四世紀歐洲的探險家到達亞洲後，遂將此植物傳入 西方世界(Aggarwal et al. 2007)。薑黃植物的外形如圖 1.1：. 圖 1.1. 薑黃的外形與薑黃素的萃取。A:薑黃的葉子。B:薑黃的根莖。C:與 葉片分離後的薑黃根莖。D:乾燥後的薑黃根莖。E:薑黃根莖被研磨成粉末 狀後，以 95%乙醇萃取，可得薑黃素。（擷取自(Goel et al. 2008)）. 薑黃的根莖呈卵圓形。其根莖經乾燥磨粉後，以 95%乙醇萃取 24 小時後， 可得金黃色的粉末，其主要成分稱為「薑黃素」(Curcumin)。薑黃素首次 在 1842 年被 Vogel 分離出。其化學結構則是在 1910 年被 Lampe 和 Milobedzka 繪出 (Milobedzka 1910)。圖 1.2 顯示薑黃素(Curcumin I) 的化 學結構： 6.
(17) 圖 1.2. 薑黃素的化學結構式 。. 薑黃素的結構中有其特定的稱謂：圖 1.3 中圓形圈起結構(A)稱為 phenolic； 四 方 形 框 起 鍵 結 (B) 稱 作 alkene linker ； 四 方 形 框 起 結 構 (C) 叫 作 β-diketone，又叫作 keto-enol。. 圖 1.3. 薑黃素的結構名稱。圓形圈起結構(A)稱為 phenolic；四方形框起鍵 結(B)稱作 alkene linker；四方形框起結構(C) 叫作 β-diketone，又叫作 keto-enol。 薑黃素的 β-diketone 結構可存有兩種同分異構物：keto- 和 enol- 如圖 1.4.. 7.
(18) 圖 1.4.薑黃素的兩種同分異構物：keto- 和 enol-，兩者互動呈平衡狀態。. 人類首次合成薑黃素是在 1913 年 (Lampe 1913)。除了薑黃素以外，這黃 色粉末另含有其他與薑黃素類似的成分，統稱為「類薑黃素」 (curcuminoid)。「類薑黃素」包含了 demethoxycurcumin (curcuman II), bisdemethoxycurcumin (curcuman III) 和 cyclocurcumin (curcumin IV) (Kiuchi et al. 1993)。市售的「薑黃素」除了主成分(curcumin I) 約佔 77% 外，curcumin II 和 curcumin III 各佔約 3% 與 17%。圖 1.5.顯示類薑黃素 的化學結構式：. 8.
(19) 圖 1.5. 類薑黃素的化學結構式 。. 至於薑黃素(curcumin I）還是類薑黃素（curcuminoid III）的抗氧化、抗癌 效果較佳？目前的證據尚不一致 (Ruby et al. 1995; Ramsewak et al. 2000)。 薑黃素是加哩 (curry) 的主成分，它出現在印度人的食物中已經數千年 了，現今更深受全世界各地人民的喜愛。除此之外，薑黃素也是合法的食 品添加劑，又稱為「天然色素三號」（natural yellow 3）。 薑黃素的藥用也幾乎與它的食品用途具有一樣悠久的歷史。5000 年前 古印度的阿育吠陀 (Ayurveda) 醫學系統裡，薑黃是用在傷口復原、血液淨 化以及胃部疾病的主要藥劑。薑黃素復被製成藥膏用於醫治常見眼疾、包 敷傷口、蚊蟲叮咬、燒燙傷、剉瘡、以及其他的皮膚疾病。薑黃素藥膏另 被用於敷在產婦的會陰部治療生產過程中造成的撕裂傷。粉狀的薑黃素則 與牛奶混合以治療咳嗽等呼吸道疾病。烤過的薑黃素粉末被用於治療兒童 下痢 (Thakur 1989)。由於印度人民長久以來對薑黃素的醫療功效深信不 疑，美國嬌生公司甚至在當地推出內含薑黃素的OK繃 (Macgregor 2006)。 中國人運用薑黃素治病的歷史也相當久遠。「大明諸家本草論：薑黃 療效可治癥瘕血塊。通月經、治補損瘀血、暴風痛、冷氣下食。蘇頌嘉佑 圖經本草則謂祛邪辟惡、治氣脹、產後敗血攻心。李時珍謂能治風痺臂痛」 (黃俊銘 2002)。現代中醫對於薑黃的療效也多有推崇：「用於血瘀氣滯之 9.
(20) 胸脇脘腹疼痛，癥瘕積聚，痛經閉經，跌打損傷。薑黃辛散苦泄溫通，入 血分能活血行瘀，入氣分能行散滯氣，且歸入肝經，故多用於肝鬱氣滯之 脇肋及脘腹疼痛。至脇肋疼痛，可配枳殼、桂心，至脘腹痛可配木香、烏 藥、當歸等，以舒肝行氣活血止痛，如〈濟生續方〉推氣散、〈聖濟總錄〉 薑黃散。治婦女經閉、痛經，則與當歸、赤芍、川芎等活血散瘀同用，以 活血通經：本品亦治產後瘀血腹痛，可以配伍沒藥散瘀止痛。治跌打傷痛， 亦多配伍活血祛瘀之品當歸、桃仁、牛膝等同用，如〈傷科方書〉薑黃散。 用於風寒濕痺。薑黃辛散溫通，外散風寒，內行氣血，善通痺止痛，為治 肩背疼痛之良藥。。常與羌活、當歸、芍藥等同用。如〈婦人良方〉五痺 湯。薑黃治癰疽發背起初，紅腫熱痛，屬於陽症者，可與大黃、白芷、天 花粉、南星、黃柏等配伍，研末外敷，如〈外科正宗〉如意金黃散，亦取 其活血消腫止痛之功。」(國家中醫藥管理局〈中華本草〉編委會 1999) 薑黃素在近代醫學研究的探討下，其療效的確實性更發屹立不搖，且 擴及許多古人不知曉的領域。現在已經被證實的療效包括：抗氧化 (Sreejayan et al. 1997)、抗發炎 (Ammon et al. 1993)、抗癌 (Rao et al. 1995)、保肝 (Kiso et al. 1983)、抑制血拴 (Srivastava et al. 1985)、預防心 肌梗塞 (Nirmala et al. 1996)、降血糖 (Srinivasan 1972; Babu et al. 1995)、治 療類風濕性關節炎 (Deodhar et al. 1980) 等等。. 三、薑黃素的抗癌效果 近代對薑黃素的研究中很重要的一項發現是它的抗癌效果。已知可以 被薑黃素所抑制或預防的癌症包括消化道癌症（包括食道、胃、腸、肝、 胰、大腸直腸癌症）、頭頸腫瘤（包括口腔癌、胸腺瘤）、肺癌、泌尿道 腫瘤（包括膀胱、腎臟、攝護腺癌）、血液腫瘤（包括白血病、淋巴癌、 多發性骨髓瘤）、黑色素細胞瘤、腦瘤、乳癌、骨癌、婦癌（包括子宮癌、 子宮頸癌、卵巢癌）。請參閱圖 1.6。 10.
(21) 圖 1.6.可被薑黃素抑制或預防的癌症 （修改自(Anand et al. 2008)） 這些抗癌的效果目前也有相當堅強的分子生物證據作基礎。圖 1.7 所繪製 的是已知的薑黃素的分子生物作用及其對癌症進展的不同階段所可能達到 的抑制效果。. 11.
(22) 圖 1.7. 薑黃素對於腫瘤進展的抑制及其可能的分子機轉 （修改自(Hatcher et al. 2008)）。 不惟如此，薑黃素的抗癌成效已經有相當的動物體實驗佐證。最早的 薑黃素動物研究是以老鼠的腹水淋巴瘤作題材 (Kuttan et al. 1985)。此後陸 續有許多動物研究指出薑黃素確切的生物體內抗癌效果(Odot et al. 2004; Aggarwal et al. 2005; LoTempio et al. 2005; Lin et al. 2007)。這些動物研究所 給予的薑黃素包括口服、靜脈注射、腹膜注射或胃沖洗等不同的方式都可 以產生可見的抗癌效果(Goel et al. 2008)。 薑黃素的活體抗癌研究也已經進展到以人為對象的臨床試驗。最早的 研究是由台大醫院所發表的第一期臨床試驗。該研究顯示：連續三週以口 服方式每日攝取薑黃素 8 公克，並不會對人體產生任何治療相關的副作 用。薑黃素的劑量未再繼續調高，主要是避免藥物體積太大所造成的胃部 不適，並非藥物本身的副作用 (Cheng et al. 2001)。此外，以末期胰臟癌病 人為對象的薑黃素第二期臨床研究亦顯示部分病人服用此藥後可得到臨床 進步 (Dhillon et al. 2008)。另外，在以色列台拉維夫的Sourasky 醫學中心 有一項合併薑黃素、gencitabime （健澤）、celecoxib 治療轉移性大腸直 腸癌的第三期臨床試驗刻在進行中(Strimpakos et al. 2008)。相信隨著這些 研究的結果陸續出爐，我們對於薑黃素在人體的實際效能會有更清楚的認 識。 藥物動力學的研究顯示：給予 ICR 老鼠尾巴靜脈注射標有同位素的薑 黃素，兩分鐘後在動物的肺部可發現有相當濃度的薑黃素出現 (Ryu et al. 2006)。因此，探討薑黃素在肺癌方面的作用是有相當的可行性價值的。目 前已有部分薑黃素抗肺癌的研究報告：(1) 薑黃素可抑制 Lewis lung carcinoma 細胞的縱膈淋巴轉移，且抑制 activator protein 1 (Ichiki et al. 2000)。(2) 薑黃素可導致肺腺癌細胞 A549 產生細胞凋亡而自死 (Radhakrishna Pillai et al. 2004; Lin et al. 2008)。(3) 薑黃素藉著啟動腫瘤抑 12.
(23) 制因子：DnaJ-like heat shock protein 40 (HLJ1) 而達成抑制人類肺腺癌細胞 (CL1-5) 的侵犯與轉移 (Chen et al. 2008)。(4) 薑黃素在 BALB/c 老鼠的動 物實驗中，可抑制 N-bis(2-hydroxypropyl) nitrosamine 對肺部的致癌效果 (Huang et al. 2008)。NCI-H460 細胞是來自人類大細胞肺癌的細胞，屬於人 類肺癌的三大類之一。關於薑黃素對 NCI-H460 細胞的直接抗癌效果的研 究尚無報告，因此乃本研究之主題。 四、細胞凋亡 「細胞凋亡」(apoptosis) 一詞最早是在 1972 年由病理學家 John Kerr. 所提出。細胞凋亡又被稱為細胞計畫性的死亡(programmed cell death)， 是一種正常生理性細胞死亡，目的為除去不要的或已無用的細胞；過程中 由特定的蛋白質及酵素調控，循序漸進使細胞死亡。其特徵為細胞萎縮 （shrinkage）、細胞膜形成空泡狀（membrane blebbing）、細胞核之染色 質濃染且緻密（chromatin condensation）、DNA 斷裂成小片段（internucl eosomal fragmentation），進而細胞膜內陷將細胞分割為多個有包膜包覆之 凋亡小體（apoptotic body），最後由鄰近之吞噬細胞胞吞噬，而出現細胞 凋亡現象之細胞則分散於組織中，其細胞膜並不會破裂，故不會引起炎性 反應 (Nagata 1997) （圖 1.8）。. 13.
(24) 圖 1.8. 細胞凋亡的顯微鏡下的變化示意圖。(A)尚未開始凋亡前 (B)凋亡初 期 (C)凋亡晚期。 細胞凋亡是一個高度調控的細胞程序性自殺。其調控的過程牽涉到許許多 多的步驟。傳統上，把這些導致細胞凋亡的眾多步驟約略分作兩類：「外 路徑」(extrinsic pathway) 與「內路徑」(intrinsic pathway)。前者是由細胞 膜上的接受器 (包括：Fas, 腫瘤壞死因子接受器、death receptors) 被激發 開始，後續在路徑上被激發的還有 Fas-associated death domain, caspase 8 和 caspase 3。後者（內路徑）則可由不同的因素匯聚成粒腺體膜電位 (ΔΨm) 的降低；再經由這ΔΨm的改變引發後續的caspase 9 及caspase 3 的活化，最 終達到細胞的凋亡。 晚近的研究指出內質網 (endoplasmic reticulum, ER) 的壓力也可以成 為啟動細胞凋亡的原因。 不 被 細 胞 凋 亡 所 控 制 是 細 胞 癌 化 的 一 個 重 要 表 徵 (Hanahan et al. 2000)。薑黃素的抗癌機轉之一就是引起細胞自動凋亡。Ramachandran 等 人發現乳癌細胞 MCF-7 在被薑黃素作用後，與細胞凋亡有關的 214 個基 因中有 104 個產生了改變 (Ramachandran et al. 2005)。這樣的結果顯示了 薑黃素引起的細胞凋亡是非常複雜的。除此之外，越來越多的證據顯示： 薑黃素引起的細胞凋亡是與劑量相關 (dose dependent)，且因細胞種類而有 差異的 (cell-type specific) (Reuter et al. 2008)。本研究旨在探討薑黃素對 NCI-H460 細胞的抗癌效果。我們並研究了「外路徑」、「內路徑」與「內 質網壓力」等三個系列相關的細胞凋亡路徑，以釐清所涉及的機轉。. 五、細胞週期與細胞週期調控 從親代細胞進行細胞分裂，形成兩個子代細胞的過程稱為:細胞週期。 簡單來說就是分裂細胞從有絲分裂結束到下次有絲分裂結束的過程。細胞 週期可分為 Interphase (又細分作G0、G1、S和G2) 及Mitosis (M)期。分述 14.
(25) 如下： 1. 休止期(G0期)：細胞處於靜止的狀態，可能是暫時休眠或者是永久性休 眠，需要有適當的訊息，細胞才會進入細胞週期或 G1 期。 2. 分裂後期(G1期)：細胞開始正常代謝並且生長，並產生RNA及蛋白質， 細胞體積會增加，G1期的染色體數目是二倍數。此為合成前期。 3. DNA合成期(S期)：細胞進行DNA合成及將原本的二倍數染色體複製另 一份。此染色體數目為二至四倍數之間。 4. 分裂前期(G2期)：染色體從二倍數變成四倍數。除了繼續生長並且合成 蛋自質之外，在細胞要進入M期之前會負責檢查染色體DNA的複製是 否完整以利進行有絲分裂（mitosis）。 5. 有絲分裂期（M期）：由一個母細胞變成兩個子細胞，複製完成的染 色體會各自分配到子細胞內，使子細胞內的染色體與母細胞完全一 樣，新細胞在此期完成。 圖 1.9 將上述細胞週期的轉化以圖形表示。. 圖 1.9 細胞週期示意圖。外圈： I=Interphase, M=Mitosis；內圈： M=Mitosis, G1=Gap 1, G2=Gap 2, S=Synthesis; 不在圈內：G0=Gap 0/Resting.。 15.
(26) 前述細胞週期中能規律的進行，須要有精密的調控系統來控制。此調控系 統主要由一些特殊的蛋白質，叫做 cyclins 來主控。Cyclins 的週期性升 高、降低伴隨著細胞週期之間的循序轉換 （參圖1.10）。. 圖1.10 不同的cyclin蛋白質在細胞週期間的濃度變化。. 然而 cylcins 本身並不具有催化反應的功能。Cyclins 必須透過與它們合作 的另一群具有催化功能的催化酵素：叫做 cyclin-dependent kinases (CDKs) 來催化適當的反應，達成細胞週期的轉換。這些 CDKs 在未與 cyclins 結 合前，是完全沒有催化功能的。如此，則細胞週期的啟動或關閉的按鍵才 不至於被誤觸，而產生嚴重的後果（例如：致癌）。 真核細胞的 cyclins 與其配合的 CDKs 有一定的組合（如表1.2）：. 表1.2 調控細胞週期之cyclins 及其配合的 CDKs 細胞週期的階段. Cyclins. CDKs. G0 /G1. Cyclin D. CDK, CDK6. 16.
(27) G1 後期. Cyclin E. CDK2. S. Cyclin A. CDK2. G2/M. Cyclin A,B. CDK1. 至於 cyclins 與 CDKs 另受到一些因子的調控： (1). Rb 蛋白質：E2F 因子是一群轉錄因子的集合。被它所啟動的基 因除了一些與 DNA 合成相關的基因外，尚包括 cyclin E (G1 晚期 的 cyclin)、cyclin A (S 期的 cyclin) 與 CDK2 (G1 晚期與 S 期的 CDK)。E2F 當與 Rb 蛋白質結合時，不具有轉錄因子的功效。 但是當 cyclin D + CDK4/6 在 G1 期中間以後將 Rb 蛋白質磷酸 化後，E2F 不再被 Rb 蛋白質羈絆而可啟動前述的基因，使得細 胞週期由 G1 進展到 S 期。. (2). CDK 抑制蛋白 (CDK inhibitory protein, CIPs)：包含了p27KIP1, P57KIP2, 和 p21CIP)。這些抑制蛋白好像一把鎖把cyclin A-CDK2 鎖住，使細胞週期無法由 G1 進入S期。當cyclin E-CDK2 將 p27KIP1 磷酸化後，p27KIP1 隨後被polyubiquitination 而被分解。 細胞週期便可進入S期。至於P57KIP2和 p21CIP是藉由什麼機轉來抑 制 CDK，目前尚不清楚。. (3). Cdc25A 和 Cdc25C 去磷酸酶：Cdc25A 移除了 CDK2 上的某個關 鍵位置上的磷酸根，進而使 CDK2 有活性、細胞週期由 G1 進 到 S 期。而 Cdc25C 則是移除了 CDK1 上的某個關鍵位置上的 磷酸根，進而使 CDK1 有活性、細胞週期由 S 進到 G2/M 期。. (4). Inhibitors of kinase 4 (INK4s)：這類的蛋白質與 CDK4/6 結合，阻 止後者與 cyclin D 結合。前面提過，CDK 若不與其相對應的 cyclin 結合則全無催化功能。因此，INK4 可使細胞週期被停滯 17.
(28) 於 G1 期。INK4 中的一種叫做 p16，是有名的腫瘤抑制蛋白。 許多腫瘤的生成與細胞週期的控制失調有關 (Diehl 2002)。且已有報導： 薑黃素可改變一些腫瘤細胞的週期 (Lin et al. 2008)，所以本研究亦會探討 薑黃素的作用對 NCI-H460 細胞的影響。. 第二節 研究目的 本研究旨在探討薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 的抗癌效 果，並嘗試研究此抗癌效果的可能機轉。由於薑黃素抑制腫瘤的機轉常 透過引發癌細胞凋亡來達成(Reuter et al. 2008)，在本實驗中與細胞凋亡 有關的「內路徑」、「外路徑」與「內質網壓力路徑」都會被研究。同 時，薑黃素對 NCI-H460 的細胞週期影響也將被探討。 本研究最終目的在利用人體外細胞研究所得的成果，推及人體內抗肺 癌新藥物的研發，期能對肺癌病人的治療有所裨益。. 18.
(29) 第二章 研究方法 第一節 研究材料 一、細胞株來源 本實驗所使用之細胞株NCI-H460為人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460株 （human large cell carcinoma），由新竹食品工業研究所（Food Industry Research and Development Institute）購得。. 二、細胞株特性 NCI-H460 細胞 ‧ 組織：人類大細胞肺癌細胞，肋膜積液 ‧ 形態：上皮細胞 ‧ 描述：來自尚未接受治療的大細胞肺癌病人的肋膜積液。此細胞表 現出易偵測到的 p53 mRNA，且此 mRNA 的表現量與正常細胞相當。 無 DNA 外型上的異常。本細胞可被染出角質素(keratin)與 vimentin， 但無 neurofilament triplet protein。此細胞株呈現部分神經內分泌細胞 的特性。對化學治療相對地敏感。可在軟瓊脂上培養（無論有或無 血清）。. 三、藥品試劑 1. Dimethyl sulfoxide（DMSO）：購自Sigma Chemical Co. 2. RPMI1640 medium：購自Gibco 3. Fetal bovine serum（胎牛血清, FBS）：購自Gibco 4. L-Glutamin（麩胺酸 , LG）：購自Gibco 5. Penicilllum Streptomycin（PS）：購自Gibco 19.
(30) 6. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide （DioC6）：購自Molecular Probes (Invitrogen, Carsband, CA) 7. 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA): 購自Molecular Probes (Invitrogen, Carsband, CA) 8. Fluo-3/AM: 購自Molecular Probes (Invitrogen, Carsband, CA, USA) 9. propidium iodide（PI）：購自Sigma Chemical Co. 10. Trypsin-EDTA：購自Amersco 11. Trypan blue：購自Sigma Chemical Co. 12. Disodium hydrogen phosphate（Na2HPO4）：購自Merck 13. Sodium chloride（NaCl）：購自Merck 14. Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4）：購自Merck 15. Potassium chloride（KCl）：購自Merck 16. PhiPhiLux®-G1D1 kit：購自OncoImmunin（Gaithersburg, MD, 17. USA） 18. RNase A（Ribonuclease A）：購自Ameresco 19. Triton X-100：purchase from Sigma chemical Co. 20. Ethanol：購自TEDIA 21. Ammonium persulfate（APS）：購自Amersco 22. Acrylamide/Bis 40％ solution（ACRYL/BISTM29:1）：購自 Amresco 23. Bovine serum albumin（BSA）：購自Merck 24. Glycine：購自Amresco 25. Methanol：購自TEDIA 26. formaldehyde：購自Merck 27. ECL kit（Enhanced chemiluminescent kit）：購自Amersham. 20.
(31) 28. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自Bio-Rad 29. Protein marker：購自Femantas 30. 10X SDS buffer（Sodium dodecyl sulfate）：購自Amresco 31. TEMED（N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine）：購自 Amresco 32. Tris（Tris（hydroxymethyl）-aminomethane）：購自Amresco 33. Tween 20：購自Amresco 34. 顯影劑：購自Kodak 35. 定影劑：購自Kodak 36. BioMax Flim：購自Kodak 37. Agarose Ⅰ：購自Amresco 38. 核酸純化試劑組（DNA purification kit）：購自Gene Mark 39. 蛋白質萃取試劑（protein extraction solution）（PRO-PREP）： 購自iNtRON Biotechnology, INC. 40. 5× TBE buffer：購自Amresco 41. N-actely cysteine: 購自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 42. Z-IETD-FMK: 購自R & D Systmes (Minneapolis, MN, USA) 43. Primary antibody （1°抗體）： ‧ anti-actin：購自Oncogen；cat # cp47 ‧ anti-caspase-3：購自Upstate；cat# 05-654 ‧ anti-caspase-8：購自Calbiochem；cat# AM46 ‧ anti-caspase-9：購自Upstate ‧ anti-cdc25c：購自Upstate; c at#05-507 ‧ anti-cyclin E：購自Upstate ‧ anti-cdk2：購自Upstate cat#5-596 21.
(32) ‧ anti-cyclin D3：購自Upstate ‧ anti-cdk4：購自Upstate；cat# 06139 ‧ anti-cdk6：購自Upstate ‧ anti-Fas：購自Upstate ‧ anti-bcl-2：購自Upstate；cat# 05729 ‧ anti-bax：購自Upstate ‧ anti-cytochrome c：Calbiochem；cat#PC323 44. Secondary antibody（2°抗體）： ‧ goat anti-mouse IgG （ HRP ） horseradish peroxidase conjugated antibody：購自Chemicon；AP124P ‧ gout anti-rabbit IgG（HRP）horseradish peroxidase conjugated antibody：購自Chemicon. 四、儀器設備、器材 1. 細胞培養皿：購自FALCON 2. 細胞培養盤：購自FALCON 3. 細胞培養箱：購自Nuaire 4. 細胞計數器（Haemocytometer）：購自Boeco 5. 倒立式位像差顯微鏡（phase-contrast microscope）：購自Olympus 6. 微量天平 (TE-200; MILLTER) 7. 去離子水製造機：購自Minipore 8. 電源供應器：購自Amersham 9. 酸鹼值測定計（C831）：購自Consort 10. PVDF membrane：購自Minipore 11. Mini-3D Shaker：購自Boeco 12. SDS-PAGE 電泳槽套組：購自Bio-Rad 22.
(33) 13. Transfer Cell Blot 套組：購自Bio-Rad 14. 加熱板：購自Lab-Line 15. 流式細胞計數儀（Flow cytometry）：購自Becton Dickinson 16. 高速離心機：購自HERMLE 17. 分光光度計：from Beckman 18. 光學顯微鏡（Olympus CH2） 19. 光學顯微鏡（Nikon LABOPHOT-2） 20. 酵素免疫分析儀（anthos 2020）：購自Anthos Labtec, Australia 21. DNA 電泳槽：購自 Mupid-2. 第二節 研究設計. 一、實驗架構 本實驗以細胞模式來探討，觀察curcumin 對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460株（NCI-H460）生長之影響，並探討curcumin是否具有誘導H460 細胞凋亡作用及細胞週期的調控作用(如圖2.1)。. （一）探討薑黃素對NCI-H460細胞生長之影響 本實驗為將不同濃度之薑黃素curcumin，直接加入H460 細胞之培養液 中，於37°C、5% CO2 及充分溼度下，不等小時後，收集細胞。評估薑黃 素對H460細胞生長或是存活之影響。. （二）探討薑黃素對NCI-H460細胞週期影響及細胞凋亡之機制 經由存活率之實驗可得之薑黃素curcuminn 會抑制H460細胞株之生 長，並會誘導細胞進行細胞凋亡作用，故本實驗將以流式細胞儀檢測H460 23.
(34) 細胞之細胞週期，並探討薑黃素curcumin 誘導細胞凋亡之機制。. 圖2.1 薑黃素作用於 NCI-H460 細胞的實驗架構 二、 實驗方法. (一) 藥品配製 將購自Sigma Chemical Co.之 curcumin 純化物，秤取7.37 mg，溶於1ml DMSO，配製成20 mM stock solution，從stock solution 分別取不同濃度配 製所需濃度，配製濃度如下： 化學名：(1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1,6-heptadiene-3,5-dione 分子式： C21H20O6 分子量= 368.38 g/mol 表 2.1 不同濃度之薑黃素溶液的配製. 24.
(35) 溶液的終濃度. 20 mM 薑黃素加入的 體積. DMSO 加入的量. 0.5 mM. 25 μl. 975 μl. 1 mM. 50 μl. 950 μl. 2 mM. 100 μl. 900 μl. 2.5 mM. 125μl. 875 μl. 3 mM. 130 μl. 870 μl. 4 mM. 167 μl. 833 μl. 將配製好不同濃度之薑黃素用來進行細胞增生及細胞週期試驗以及利用西 方點墨法（Western blotting）觀察蛋白質表現等分析。. （二）細胞培養 A. 培養條件 人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460株（NCI-H460）以RPMI1640 培養基 添加10%胎牛血清、1% L-glutamine 及1% penicillin streptomycin 之培養 液，置於5% CO2 及充分溼度下的37 ℃的細胞培養箱（incubator）中培養， 約二天更換一次培養液至細胞長滿。. B. 細胞冷凍保存 NCI-H460細胞株經大量培養後，可利用液態氮冷凍保存，欲冷凍保存 之細胞應在生長旺盛且存活率高之狀態下進行。細胞冷凍保存方法為，冷 凍前應注意細胞生長情形，並在前一日更換培養基。凍細胞前需先配製冷 凍保存溶液：將 DMSO（dimethyl sulfoxide）加入新鮮培養基中，使其最 終濃度為1％，混合均勻，置於室溫下待用。取少量細胞懸浮液（約100 μl）， 25.
(36) 計數細胞濃度及凍前存活率。離心後倒掉上清液，加入事前配製好的冷凍 保存液，使其細胞數在2×106×~5×106cells/ml，混合均勻後置於以標示好名 稱、數目及冷凍日期之冷凍管中，1 ml/管。 冷凍保存方法：冷凍管置於4 °C，10 min → -20 °C，30 min → -80 °C，16~18 小時 → 液態氮槽長期保存。. C. 繼代培養 待細胞長至八分滿時，將培養液取出丟棄，先以PBS （phosphate buffer saline）清洗細胞1~2 次，再加入3 ml trypsin ，置於37℃培養箱中處理2 分 鐘後，加入乾淨培養液以中和trypsin 之作用，再將瓶中所有液體裝到離心 管中以1500 rpm 離心5 分鐘，離心後倒掉上清液，加入20 ml 新鮮培養 液，再使用電動吸量管反覆抽吸使均勻混和，取20 μl 之細胞懸浮液加入 80 μl trypan blue 溶液，以血球計數盤（Counting chamber）計算細胞數目 （死細胞會被trypan blue 染成藍色，而活細胞則不被染色）。 細胞數計算： χ(為所計數的細胞數) ×20 (20 ml 培養液)×5 (trypan blue 5倍稀釋)×104，依 實驗目的不同，計算所需細胞液置於不同培養皿中。. D. 藥物處理 重新繼代的細胞經24 小時培養後，待貼壁細胞貼覆瓶底後，依實驗所 需不同的時間長短選擇是否加藥前置換培養液，若24 小時內可不需置換培 養液，若超過48 小時則先置換培養液再加入藥物處理。microplate 每well 加入培養液體積2 ml，則加20 μl 藥物；3 ml，則加30 μl，則藥物濃度被稀 釋100 倍為最終濃度。. （三）流式細胞儀分析測定 26.
(37) 流式細胞儀廣泛的應用於癌細胞臨床樣品檢測當中，是腫瘤生物學研 究的重要工具之一，為癌細胞的早期的藥效評估提供重要資訊。流式細胞 分析技術的發展提供一快速檢測且可靠的方法定量細胞懸浮液，若配合適 當的染劑，則可以對藥物處理細胞後做不同的效果評估，具有準確及快速 的優點。. A. 細胞存活率測定 Propidium iodine（PI）是一種核酸染劑，當細胞死亡時會進行壞死或 細胞凋亡的路徑，死亡的細胞膜會失去完整性，使得PI 可進入細胞內與核 酸結合，PI 會與DNA 雙股螺旋中之A=T、C≣G鍵結的氫鍵（hydro bond） 接在一起；存活的細胞因其細胞膜完整PI 無法和細胞內的核酸結合，經PI 染色完成的細胞可由流式細胞儀於488 nm 的雷射光激發後死亡的細胞會 呈現較強紅色螢光，存活細胞會成較弱的紅色螢光以CellQuest 軟體分析細 胞存活率 (Yeh et al. 1981; Holmes et al. 2002)。也可以併入其他實驗（如: 與FITC 標記之annexin V 共同偵測，以區別存活壞死或凋亡細胞）或者與 其他染劑共同使用，評估細胞存活狀態。 【實驗步驟】 將NCI-H460 細胞依照2×105 cells /well 種植於 12-well 培養皿中，經過24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的curcumin（0, 0.5, 1 ,2, 3 and 4 mM），分別持續培養24及48 小時後，收細胞，將上層液移至離心管中， 加入PBS 清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin 處理，置於37℃培養箱中處 理2 分鐘後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中和trypsin 之作用，再將所 有液體裝到離心管中，1500 rpm 離心5 分鐘，去除上清液，再加入1 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心5 分鐘，去除上清液，加入PI 染劑350 μl（350~550 μl，可依照細胞數做調整 ），均勻混合後，transfer至FACS 管中，以流式 細胞儀進行樣品分析，固定秒數及流數，紀錄細胞增殖率gate%存活百分比。 27.
(38) B. 細胞週期分析 PI 可專一的鍵結的核酸而廣泛的應用於流式細胞儀技術中，正常情況下細 胞膜維持完整PI 無法穿透細胞之細胞膜，故若以酒精將細胞膜打洞固定 後，進入細胞內之PI 可與核酸進行鍵結，利用流式細胞儀（Flow cytometry; FACS）偵測PI 所貢獻之螢光，則可以反應細胞內之DNA 狀態或進行細胞 週期分析 (Darzynkiewicz et al. 1992)。 【實驗步驟】 將細胞依照2×105 cells /well 種植於 12-well 培養皿中，經過24 小時靜置 培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的curcumin（0, 0.5, 1, 2, 3 and 4 mM）， 分別培養24及48小時後，收細胞，將上層液移至離心管中，加入PBS 清洗 細胞一次後，再將細胞以trypsin 處理，置於37 ºC 培養箱中處理2 分鐘後， 將細胞打下來，加入1 ml PBS 以中和trypsin之作用，再將所有液體裝到離 心管中，1500 rpm 5 分鐘的離心（重複此步驟一次），去除上清液，置於 震盪器輕輕震盪再加入70% EtOH/PBS，一滴一滴滴入離心管中以固定細 胞，使細胞完全均勻分散於70% EtOH/PBS 中，靜置-20 ºC至少一小時，取 出細胞後離心（1500 rpm 5 分鐘），倒掉上清液加入PBS 3 ml清洗細胞， 離心去除上清液，加入cycle PI 染劑350 μl，將細胞團打散，避光30 分鐘， 以流式細胞儀行樣品分析，所得之結果以Modfit LT 軟體分析。. C. 粒腺體膜電位之檢測 細胞膜電位探針，DioC6（3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodide）是一種 可穿透細胞膜，可專一性的結合並累積在細胞粒腺體中，DioC6在細胞內外 的分佈可反應出細胞膜內外的電位差，其螢光強度的改變就可顯示細胞膜 電位改變的情形，可發射出綠色螢光（green-fluorescent）之陽離子（cationic dye）親脂性染劑；在不需要固定細胞或其他處理的情況下可以即時、快速 28.
(39) 的偵測活細胞內粒腺體膜電位。粒腺體膜功能不良（mitochondrial dysfuction）通常伴隨早期細胞凋亡發生，而細胞粒腺體膜電位的改變也因 此當作早期凋亡偵測上的指標 (Rottenberg et al. 1998)。. 【實驗步驟】 將細胞依照2×105 cells /well種植於 12-well 培養皿中，經過24小時靜置培 養後，待細胞貼附後加入2.5 mM curcumin，20 μl/well到12 well plate當中（最 終濃度為 25 μM），經不同時間培養（1、3、6、12及24 h）後，收細胞， 將上層液移至離心管中，加入PBS清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin處 理，置於37℃培養箱中處理2分鐘後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中和 trypsin之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm離心5分鐘，去除上 清液，再加入1 ml PBS清洗細胞，1500 rpm離心5分鐘，去除上清液，取MMP （ΔΨm）染劑（10 μl DioC6/500 μl PBS）DioC6（3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide）染劑每管加入500 μl，需有一管blank不加藥也不加染劑，於37 ºC 培養箱避光培養30 min後，transfer至FACS管中，以流式細胞儀進行樣品分 析，每樣品收集10000顆細胞以CellQuest軟體分析。將blank 調在100~101之 間，control調在101~102之間，M1 gated約75﹪peak，以上sample上機後，分 析MMP（peak往右不產生細胞凋亡，往左產生細胞凋亡）。. D. 活性氧化物產生之檢測 免疫細胞進行需氧性滅菌過程中，會在細胞內啟動一連串的氧化還原 反應，因而產生一些氧化代謝物，如H2O2，·O2-自由基。藉由 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate（H2DCF-DA）對細胞進行染色，再以產 生的螢光來測量ROS 的產生。H2DCF-DA 是一種具有螢光性質，可滲透 細胞膜特異性的追蹤評估ROS 的產生。H2DCF-DA 會被細胞內的乙醯酯 29.
(40) 酶（esterases）去乙醯化（deacetylated）成非螢光性的DCFH，DCFH 會在 細胞內被H2O2氧化成螢光性質的DCF，並聚集在粒腺體中，所發散螢光則 可反映出細胞內H2O2的濃度 (Guthrie et al. 2006)。 【實驗步驟】 將細胞依照2×105 cells /well種植於 12-well 培養皿中，經過24小時靜置培 養後，待細胞貼附後加入2.5 mM curcumin，20 μl/well到12 well plate當中（最 終濃度為 25 μM），經不同時間培養（1, 3, 6, 12, 及 24 h）後，收細胞， 將上層液移至離心管中，加入PBS清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin處 理，置於37℃培養箱中處理2分鐘後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中和 trypsin之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm離心5分鐘，去除上 清液，再加入1 ml PBS清洗細胞，1500 rpm離心5分鐘，去除上清液，取ROS 染劑H2DCF-DA染劑（1 μl H2DCF-DA /500 μl PBS）每管加入500 μl，需有 一管 blank不加藥也不加染劑，只加入500 μl PBS，在置於37 ºC培養箱避光 培養30 min後，transfer至FACS管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每樣品 收集10000顆細胞以CellQuest軟體分析。將blank 調在100~101之間，control 調在101~102之間，M1 gated約75﹪以上，sample上機後，分析ROS（peak 往右是產生自由基，往左是抗氧化）。. E. 鈣離子釋出之檢測 胞內鈣離子作為細胞信號傳遞的信差，是細胞激活過程中重要的功能參 數。螢光染劑（如Fura-Red、Fluo-3和Indo-1等）通過乙醯甲酯 （Acetatoxymethyl Ester；AE）導入細胞後，Fluo-3/AM會與鈣離子特異性 結合。這些螢光染劑的結構式，一般與EDTA相似，可螯合鈣離子，螯合 鈣離子之螢光染劑會有光學特性上的改變，在（紫外光）UV 的激發下， Fluo-3/AM 放出光（emission）的強度會隨著細胞內鈣離子濃度的改變， 30.
(41) 而發散出不同強度的螢光，故可用比例法測得或直接測得的螢光強度得到 鈣離子濃度的相對值，實際濃度需經校對後獲得 (Rijkers et al. 1990)。 【實驗步驟】 將細胞依照2×105. cells /well種植於12 well 培養皿中，經過24小時靜置培. 養後，待細胞貼附後加入 2.5 mM curcumin，20 μl/well到12 well plate當中 （最終濃度為 25 μM），經不同時間培養（ 1, 3, 6, 12, 及 24 h ）後，收 細胞，將上層液移至離心管中，加入PBS清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin 處理，置於37℃培養箱中處理2分鐘後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中 和trypsin之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm離心5分鐘，去除 上清液，再加入1 ml PBS清洗細胞，1500 rpm離心5分鐘，去除上清液，取 Fluo-3/AM 染劑每管加入1000 μl，需有一管blank不加藥也不加染劑，只加 入1000 μl PBS，在置於37ºC培養箱避光培養1h，每10 min上下混合一次， 1h後加入PBS洗2次，1500 rpm離心5 min，倒掉上清液，每管加入400 μl PBS，再transfer至FACS管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每樣品收集 10000顆細胞以CellQuest軟體分析。將blank 調在100~101之間，control 調 在100~101之間，M1 gated約0％，以上sample上機後，分析calcium release (peak往右為鈣離子釋出)。. F. Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 活性分析 利用PhiPhiLux-G1D1 kit 來檢測凋亡細胞caspase-3、caspase-8、 caspase-9 之產生，PhiPhiLux- G1D1 kit 基質是種含有螢光物質之胺基酸序 列（amino acid sequence），而活化之caspase-3、caspase-8、caspase-9. 可. 以裂解胺基酸序列之特定位置，而是螢光物質釋放出來，再經由流式細胞 儀分析，可得知若螢光產量越多則產生活性之caspase-3、caspase-8、 caspase-9. 越多(Kohler et al. 2002)。 31.
(42) 【實驗步驟】 將細胞種植於細胞依照2×105 cells /well 種植於12 well 培養皿中，經過24 小時靜置培養後，待細胞貼附後，加入2.5 mM curcumin 20 μl/well 到12 well plate 當中（最終濃度為25 μM），經不同時間培養（0, 6, 12, 及 24 h）後， 收細胞，將上層液移至離心管中，加入PBS 清洗細胞一次後，再將細胞以 trypsin 處理，置於37℃培養箱中處理2 分鐘後，將細胞打下來，加入1 ml PBS 以中和trypsin 之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm 離心5 分鐘，去除上清液，再加入1 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心5 分鐘， 去除上清液，取10 μM substrate（Phiphilux green for caspase-3）（Phiphilux red for mitochondria）每管加入25 μl，在置於37 ºC 培養箱避光培養1 h，1 h 後加入1 ml PBS 洗1 次，1500 rpm 離心5min，倒掉上清液，每管加入500 μl PBS，再transfer 至FACS 管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每樣品收 集10000 顆 細胞以CellQuest 軟體分析。將blank 調在100~101之間control調在101~102 之間，M1 gated 約75%，以上sample上機後，分析caspase-3 活性（peak 往 右為caspase-3 產生）。. G. 加入Caspase 8 與 ROS 抑制劑的效果 NCI-H460 細胞在尚未與 25 μM curcumin 作用前三小時先以 20 μM 的 caspase 8 抑制劑:z-IETD-fmk 作用。然後再比較有否 caspase 8 抑制劑對 caspase 8 活性與細胞存活率的差別（測量的方法已詳述於前）。另在 NCI-H460 細胞在尚未與 25 μM curcumin 作用前三小時先以 15 mM 的 ROS 抑制劑：N-acetyl-cysteine (NAC)作用。然後再比較有否 NAC 對 ROS 產量與細胞存活率的差別（測量的方法已詳述於前）。. 32.
(43) （四）免疫螢光染色與共軛焦顯微鏡顯像 將NCI-H460 細胞依照 5×104 cells /well種植於 4 well 培養皿中，經過 24 小 時靜置培養後，待細胞貼附後，加入最終濃度為 25 μM 的curcumin 作用 24 小時後，以 4% formaldehyde in PBS固定 15 分鐘，並以 0.3% Triton-X 100 in PBS 穿透一小時，最後再以 2% BSA 阻絕非特異的結合。接著玻片與 對抗人類endo G, 細胞凋亡 inducing factor (AIF), cytochrome c, growth arrest and DNA damage-inducible gene 153 (GADD153) 及glucose-regulated protein (GRP)-78 等抗體作用（稀釋 100 倍，Santa Cruz）到次日。再加入 稀釋 100 倍的二級抗體（接合著FITC螢光的山羊對抗老鼠IgG抗體, Santa Cruz）。細胞的DNA以PI染色。影像採用萊卡TCS SP2 共軛焦顯微鏡觀察、 攝影 (Suzuki et al. 1997)。. （五）西方點墨法（Western blotting） 【抽取細胞蛋白質】 將NCI-H460 細胞依照2×105 cells /well種植於12 well 培養皿中，經過24小 時靜置培養後，待細胞貼附後，加入 2.5 mM curcumin，20 μl/well 到 12 well plate當中（最終濃度為 25 μM），經不同時間培養（6, 12, 24 及 48 h ） 後收細胞，將上層液移至離心管中，加入PBS 清洗細胞一次後，再將細胞 以trypsin 處理，置於37℃培養箱中處理2 分鐘後，將細胞打下來，加入1 ml PBS 以中和trypsin 之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm 離心5 分鐘，去除上清液，再加入1 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心5 分鐘， 取出上清液即含細胞蛋白質 (Hayes et al. 1989)。. 【轉漬步驟】 先將PVDF membrane裁剪好，再以methanol短暫濕潤後，再浸入轉印緩衝 液（transfer buffer）中，接著將裁好的濾紙先浸泡在transfer buffer中備用， 33.
(44) 將轉漬夾打開後，黑色面朝下，將海綿墊片先以transfer buffer潤濕並鋪在 黑夾上，再將3M濾紙鋪上，接下來裁剪下層膠（separation gel）中所要轉 漬的區域後，將SDS-PAGE gel小心的鋪於3M濾紙上，可在濾紙上加入多 量的transfer buffer，再鋪上SDS-PAGE gel時勿陷入任何氣泡，再依序放上 PVDF membrane，同樣避免氣泡產生，及3M濾紙，最後再放上一片海綿墊 片，即可把整個轉漬夾裝好，形成似三明治夾層狀之構造。置入已裝有 transfer buffer的電泳槽中將黑夾朝負極，紅夾朝正極，電泳槽外圍放置足 夠冰塊，使整各系統維持低溫狀態。以400 mA、2小時的條件下進行蛋白 質轉漬步驟。轉印完成後取出轉印膜裁去多餘部分，轉印膜後以0.05% tween 20/1X PBS 清洗10分鐘共3次。緊接將轉印膜以2% FBS（溶於0.05 % tween 20/1X PBS 中）進行blocking 步驟，以室溫1小時為條件進行。取出 轉印膜後於小盒中以0.05 % tween 20/1X PBS 清洗10分鐘共3次。倒掉清洗液，加入8 ml的一級抗體（溶於新 鮮配製之blocking solution中，稀釋倍數依不同抗體有所不同），4 ℃隔夜 進行搖盪。隔天取出，回收一級抗體，以0.05% Tween 20/1X PBS 清洗轉 印膜10分鐘共3次。加入8ml稀釋10000倍的goat anti IgG（HRP） horseradish peroxidaseconjugated antibody 二級抗體（溶於含2% FBS的0.05% Tween 20/1X PBS中） ，於室溫下搖盪進行1小時，最後取出轉印膜後以0.05% Tween 20/1X PBS 洗清洗10分鐘共3次。. 【壓片步驟】（暗房中進行） 將轉印膜浸泡於ECL 試劑之混合液（每瓶各取1.5 ml等比例混合）中1分鐘 反應。以兩張投影片黏貼固定於cassette 內，轉印膜並正面朝上放置於壓 片卡匣（cassette）兩張投影片中間，以Hyperfilm 軟片置於上層投影片上， 對準轉印膜進行壓片，感光時間依轉印膜上螢光亮度決定時間長短，約5 秒 至1 小時不等。感光完成後放入顯影劑進行顯影步驟（時間依實際觀察決 34.
(45) 定），再以清水沖洗30秒後放入定影劑中，過30 秒後再以清水沖洗30 秒。. (六) Real Time PCR 分析 AIF、caspase 3、8、9 以及endo G 的mRNA 轉 錄表現量 在本次實驗，real-time PCR 用於檢測五個目的基因在不同細胞的cDNA 中 含量差別(即mRNA 含量，倍數關係)。. 表 2.2 PCR 所使用的引子及其核酸序列 引子名稱. 引子的核酸序列. homo caspase3-F. CAGTGGAGGCCGACTTCTTG. homo caspase3-R. TGGCACAAAGCGACTGGAT. homo caspase8-F. GGATGGCCACTGTGAATAACTG. homo caspase8-R. TCGAGGACATCGCTCTCTCA. homo caspase9-F. TGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTT. homo caspase9-R. GTGAGCCCACTGCTCAAAGAT. homo AIF-F. GGGAGGACTACGGCAAAGGT. homo AIF-R. CTTCCTTGCTATTGGCATTCG. homo EndoG-F. GTACCAGGTCATCGGCAAGAA. homo EndoG-R. CGTAGGTGCGGAGCTCAATT. 每一檢測都重複兩次以確定其「可重複性」. cDNA 的製備：培養細胞，裂解細胞， Trizol 法抽提RNA，反轉錄。然 後，救用Real-time PCR去檢測五個目的基因(AIF, caspase -3, -8 and -9 以及 endo G) 的量。本實驗中用薑黃素25 μM 處理NCI-H460 細胞經過24,48小 時後，以Qiagen RNeasy Mini Kit 萃取出全部RNA。RNA 反式轉錄樣品是 用高容量的 cDNA反式轉譯 kit 根據標準程式處理42℃ 溫度30分鐘後， Quantitiative PCR 緊接著執行以下的處理：50℃的溫度2分鐘、95℃的溫度 35.
(46) 10分鐘，以95℃,15秒，共40個循環。用cDNA 反式轉錄kit 1μl 60℃的溫度 1分鐘，2X SYBR Green PCR主要混合螢光染料(Applied Biosystems)，和200 nM的正向與反向引子(表2.2)，每一個分析是應用生物系統公司的7300 Real-Time PCR系統可得到三倍的表達折疊改變後可由comparative CT method處理取得所需的 mRNA 序列的資料 (Kubista et al. 2006)。. 第三節 統計方法 實驗結果以平均值標準差（mean ± SD）表示，使用Unpaired Student’s t-test 來決定實驗組與對照組之差異。*表示p＜0.05，表示統計上具顯著差 異。** 表p<0.01;***表p<0.001。. 36.
(47) 第三章 研究結果 第一節 描述性統計分析 一、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞株NCI-H460的增生抑制與細胞形態改 變 利用流式細胞計數儀(flow cytometry)評估細胞存活率，結果發現加入 不同濃度的薑黃素之後，細胞的存活率隨著藥物濃度的上升而下降。圖 3.1、3.2 分別表示薑黃素作用24 與 48 小時所呈現的細胞存活率變化圖。. 圖3.1 不同濃度之薑黃素處理 NCI-H460 細胞24小時後的細胞存活 率。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05，** p< 0.01) (n=3)。. 37.
(48) 圖3.2 不同濃度之薑黃素處理 NCI-H460 細胞48小時後的細胞存活率。數 據結果以 mean±SD 値表示 ( * p< 0.05，** p< 0.01) (n=3)。 可以發現大細胞肺癌細胞 NCI-H460 在薑黃素濃度超過 20 μM後，其 存活率乃急速下降。但若將圖3.1與圖3.2 重疊起來，二者的存活率曲線十 分相近。顯示薑黃素作用24或48小時對NCI-H460細胞的毒殺效果是類似的 （圖3.3）。利用倒立式相位差顯微鏡觀察細胞的形態，加入不同濃度的薑 黃素處理24小時後，發現隨著薑黃素的濃度增加，NCI-H460細胞數目明顯 下降，且有細胞形態不完整、細胞膜皺縮、與空泡化的現象（如圖3.4）。 當薑黃素的作用時間為48小時，NCI-H460細胞的外形也出現類似的變化 （圖3.5）。. 38.
(49) 圖3.3.薑黃素作用24與48小時對NCI-H460細胞的毒殺效果重疊作圖。二者 曲線十分相似。. 圖3.4 薑黃素處理 24 小時後細胞的形態的改變。以倒立式相位差顯微鏡 觀察發現隨著藥物濃度的上升，NCI-H460 細胞數目有明顯下降的趨勢， 且有細胞形態不完整、細胞膜皺縮與細胞空泡化的現象。放大倍率200 X。. 39.
(50) 圖3.5 薑黃素處理48小時後細胞的形態的改變。以倒立式相位差顯微鏡觀 察發現隨著藥物濃度的上升，NCI-H460 細胞數目有明顯下降的趨勢，且 有細胞形態不完整、細胞膜皺縮與細胞空泡化的現象，放大倍率200 X。 二、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460細胞週期的影響 利用流式細胞計數儀評估不同濃度的薑黃素處理24及48小時後，加入 PI，並觀察其細胞週期的改變。結果在某些濃度下，G2/M 期之細胞比例 有顯著的上升，由此可知，薑黃素可以使人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 的細胞週期在G2/M 期停滯 (G2/M arrest)。而且當薑黃素濃度高於20 μM， sub-G1 peak 所佔比例顯著升高，代表了細胞凋亡的比例增加（如圖3.6、 圖3.7）。. 圖3.6A 40.
(51) 圖3.6B. 圖3.6C 41.
(52) 圖3.6 不同濃度之薑黃素作用24小時對NCI-H460細胞細胞週期分佈影 響。數據結果以mean ± SD 値表示，A：流式細胞儀圖；B： Sub-G1 peak （代表apoptosis） 所佔的比例；C：長條圖顯示部分濃度的curcumin會 導致G2/M arrest。 ( * p< 0.05，** p< 0.01，***p<0.001) 。(n=3). 圖3.7A 42.
(53) 圖3.7B. 43.
(54) 圖3.7C. 圖3.7 不同濃度之薑黃素作用48小時對NCI-H460細胞細胞週期分佈影 響。數據結果以mean ± SD 値表示，A：流式細胞儀圖；B：Sub-G1 peak （代表細胞凋亡） 所佔的比例；C：長條圖顯示部分濃度的curcumin會導 致G2/M arrest。 ( * p< 0.05，** p< 0.01，***p<0.001) 。(n=3). 三、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 產生活性氧化物量的改變 活性氧化物（reactive oxygen species；ROS）在誘導細胞凋亡 當中扮演一個重要的角色。粒線體是ROS產生的主要位置而這又和細胞的 死亡有關。粒線體中ROS的大量產生（ROS burst）會造成粒線體的功能不 良（mitochondrial dysfunction）。為了檢測薑黃素誘導之細胞凋亡是否和 ROS的產生有關，在此利用流式細胞儀分析細胞中ROS的產生。利用流式 細胞計數儀評估濃度25 μM的薑黃素處理不同時間1、3、6、12、24小時， 再加入H2DCFDA，並觀察其產生活性氧化物的情形。結果發現因著薑黃素 的作用，流式細胞儀曲線有右移的趨勢（圖3.8），表示薑黃素作用作用導 44.
(55) 致活性氧化物 ROS產量增多。 圖3.8A. 圖3.8B. 圖3.8 25 μM薑黃素作用不同作用時間所造成的 NCI-H460 細胞之 ROS 產量變化。結果發現流式細胞計數儀曲線因著薑黃素的作用有右移 的趨勢(圖A)，表示薑黃素可導致活性氧化物 ROS 產生增多(圖B)。(n=3) 四、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 粒腺體膜電位的影響 利用流式細胞計數儀評估濃度25 μM的薑黃素分別處理1、3、6、12及 24 小時之後，加入DioC6，並觀察其產生膜電位變動的情形。結果顯示： 45.
(56) 薑黃素作用後，流式細胞儀曲線地有左移的趨勢，表示細胞粒線體膜電位 差的降低（Mitochondria depolarization），進而誘導細胞凋亡的發生（圖 3.9）。. 圖3.9A. 圖3.9B. 圖3.9 25 μM薑黃素作用不同作用時間所造成的 NCI-H460 細胞之粒腺體 膜電位（ΔΨm）變化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果 顯示：薑黃素作用後， 粒腺體膜電位差數值明顯下降。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( *** p< 0.001) 。(n=3) 46.
(57) 五、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460之鈣離子釋出影響 已知內質網中鈣離子釋出會造成粒線體膜電位（ΔΨm）之下降，前述 結果得知粒線體膜電位在24小時內即有下降之現象發生，為探討先前發現 之粒線體膜電位在短時間即下降之原因，在此以Fluo-3/AM 會特異性的和 鈣離子結合之特性，利用流式細胞儀分析鈣離子的釋出，Fluo-3/AM會與鈣 離子特異性結合，螯合鈣離子之螢光染劑會有光學特性上的改變，在（紫 外光）UV 的激發下，Fluo-3/AM 放出光（emission）的強度會隨著細胞內 鈣離子濃度的改變，而發散出不同強度的螢光，故可用比例法測得或直接 測得的螢光強度得到鈣離子濃度的相對值，實際濃度需經校對後獲得。 利用流式細胞計數儀評估濃度25 μM的薑黃素分別處理1、3、6、12及24 小 時之後，加入Fluo-3/AM，並觀察其產生鈣離子的情形。結果發現薑黃素作 用後，流式細胞儀圖曲線向右偏移，表示薑黃素會促使細胞內鈣離子濃度 增加（如圖3.10）。. 圖3.10A. 47.
(58) 圖3.10B. 圖3.10 NCI-H460 細胞給予濃度25 μM之薑黃素所造成的胞內鈣離子濃 度變化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後， 胞內鈣離子濃度明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05)。 (n=3) 六、利用流式細胞儀檢測薑黃素對大細胞肺癌細胞 NCI-H460之細胞凋亡 相關蛋白質Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 活性的影響 48.
(59) 由前述實驗結果顯示，以薑黃素處理 NCI-H460 細胞，會造成細胞 週期的停滯，並誘導細胞走向細胞凋亡途徑。Caspase-3、Caspase-8及 Caspase-9為cysteine protease family之成員，是參與細胞凋亡之主要作用蛋 白。Caspase-3 的活化會促使 PARP（poly（ADP-ribose）polymerase）分 解，進而造成DNA fagmentation 之產生，造成細胞凋亡之現象。 本實驗利用PhiPhiLux-G1D1 kit（OncoImmunin, Inc., Maryland, USA） 檢測casapse-3、Caspase-8及Caspase-9之活性。以25 μM 濃度之薑黃素投予 NCI-H460細胞經6~72小時後收集細胞，加入PhiPhiLux-G1D1 kit 中之基質 反應，以探討薑黃素是否誘導Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9活性產生。 實驗結果顯示，以薑黃素處理之人類大細胞肺癌NCI-H460細胞可見流式細 胞儀圖形的 caspae-3 、Caspase-8 及capsase 9曲線都有向右偏移的趨勢， 由此可推知：薑黃素可誘導人類大細胞肺癌NCI-H460細胞之caspase-3、 Caspase-8及Caspase-9 活性增加，進而促使細胞凋亡發生（如圖3.11、3.12、 3.13）。 圖3.11A. 圖3.11B. 49.
(60) 圖3.11. NCI-H460 細胞接受25 μM薑黃素作用後其 caspase 3 活性的變 化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，caspase 3 活性明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05)。(n=3). 圖3.12A. 圖3.12B 50.
(61) 圖3.12 NCI-H460 細胞接受25 μM薑黃素作用後其 caspase 8 活性的變 化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，caspase 8 活性明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05; ***p<0.001)。(n=3) 圖3.13A. 圖3.13B 51.
(62) 圖3.13 NCI-H460 細胞接受25 μM薑黃素作用後其 caspase 9 活性的變 化。A： 流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，caspase 9 活性明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05; **p<0.01)。 (n=3). 七、加入Caspase 8 與 ROS 抑制劑對薑黃素在 NCI-H460 細胞影響的改 變 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有Caspase 8 抑制劑 (Z-IETD-fmk) 的情況下，其caspase 8 活性曲線在流式細胞儀圖右移的程度較小，表示其 caspase 8活性增加較不明顯；且細胞存活率較沒有抑制劑時明顯變高（圖 3.14）。 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有ROS 抑制劑 (NAC) 的情況 下，其ROS產量曲線在流式細胞儀圖右移的程度較小，表示其ROS產量增 加較不明顯；且細胞存活率較沒有抑制劑時明顯變高（圖3.15）。. 圖3.14A. 52.
(63) 圖3.14B. 圖3.14C. 53.
(64) 圖3.14 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有或無 Caspase 8 抑制劑 (Z-IETD-fmk)的情況下，對 Caspase 8 活性與細胞存活比率的影響。A： 流式細胞儀顯示加入caspase 8 抑制劑的細胞其caspase 8活性曲線右移的 程度較小；B：長條圖顯示加入抑制劑的細胞其caspase 8活性增加較不明 顯；C： 有同時加入 caspase 8 抑制劑的NCI-H460 細胞存活比例較高。 (n=3). 圖3.15A 54.
(65) 圖3.15B. 圖3.15C. 55.
(66) 圖3.15. 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有或無 ROS 抑制劑 (NAC) 的情況下，對ROS 產量與細胞存活比率的影響。A： 流式細胞儀 顯示加入NAC的細胞其ROS 產量曲線右移的程度較小；B：長條圖顯示加 入抑制劑的細胞其ROS產量增加較不明顯；C：有同時加入NAC的NCI-H460 細胞存活比例較高。(n=3). 八、免疫螢光染色法偵測 endo G、AIF、 cytochrome c、GADD153 與 GRP78 在細胞質與細胞核的表現 經過25 μM 薑黃素作用24小時後，以免疫螢光法可偵得NCI-H460 細胞質 內的endo G, AIF, cytochrome c, GADD153 與 GRP78 都有增加，且其中 endo G, cytochrome c 與 GADD153 亦呈現 nuclear translocation 現象（圖 3.16）。. 圖3.16A 56.
(67) 圖3.16B. 圖3.16C 57.
(68) 圖3.16D. 58.
(69) 圖3.16E. 圖3.16. 經過25 μM 薑黃素作用24小時後，以免疫螢光法染色、共軛焦顯 微鏡偵測 NCI-H460 內endo G (A)、AIF (B)、 cytochrome c (C)、 GADD153 (D) 與 GRP78 (E)的含量與位置。圖形顯示：前述五種物質在 細胞質內都有增加，且其中endo G, cytochrome c 與 GADD153 亦呈現 nuclear translocation 現象。 九、 利用西方墨點法檢測薑黃素對人類 NCI-H460 細胞之凋亡與週期調控 有關蛋白表現量的影響 先前的實驗結果顯示，薑黃素會導致大細胞肺癌細胞 NCI-H460 凋 亡，為探究其機制，故接著以西方墨點法偵測參與調控細胞凋亡相關蛋白 的表現，以 α-tubulin 作為 internal control。結果分項敘述於後（圖 3.17）： 一、細胞膜死亡受體凋亡路徑的相關蛋白表現 以濃度 25 μM 薑黃素處理人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 株 NCI-H460 不同時間後，利用西方墨點法觀察發現，隨著時間的延長， Fas 蛋白表現量增加。. 59.
(70) 圖3.17A. 60.
(71) 圖3.17B. 圖3.17 用西方墨點法檢測薑黃素對人類NCI-H460細胞之凋亡與週期調控 有關蛋白表現量的影響。經薑黃素25 μ M作用不同時間後，測定NCI-H460 細胞內蛋白質含量的改變。A圖：與細胞凋亡相關蛋白；B圖：調控細胞週 期相關蛋白。. 61.
(72) 二、調控細胞凋亡的 Bcl-2 family 蛋白表現 以濃度 25 μM 薑黃素處理人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 株 NCI-H460 不 同時間後，利用西方墨點法觀察 Bcl-2 family 蛋白的表現量，結果發現隨 著時間的延長，抗細胞凋亡的 Bcl-2 和 Bcl-xl 蛋白表現量下降，促細胞凋 亡的 Bad 和 Bax 蛋白表現量增加。. 三、與細胞週期調控有關蛋白表現 以濃度 25 μM 薑黃素處理人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 株 NCI-H460 不 同時間後，Cyclin A 與 CDK-1, -2, -4, -6 蛋白的總量均呈現漸次下降，而 Cyclin D 與 Cyclin E 則是在作用 6 與 12 小時後先上升，隨後再漸漸降下。. 十、Real Time PCR 分析 AIF、caspase 3、-8、-9 以及 endo G 的 mRNA 轉錄表現量 以濃度 25 μM 薑黃素處理人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 株 NCI-H460 24 與 48 小時後，caspase 8 的 mRNA 轉錄水平隨作用時間增長而漸漸上升； 而 endo G 的 mRNA 轉錄水平則僅在作用 24 小時有明顯上升。其他諸如： AIF, caspase-3 and -9 並無明顯的的 m RNA 轉錄水平改變（圖 3.18）。. 62.
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