第一節 描述性統計分析
一、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞株NCI-H460的增生抑制與細胞形態改 變
利用流式細胞計數儀(flow cytometry)評估細胞存活率，結果發現加入 不同濃度的薑黃素之後，細胞的存活率隨著藥物濃度的上升而下降。圖 3.1、3.2 分別表示薑黃素作用24 與 48 小時所呈現的細胞存活率變化圖。
圖3.1 不同濃度之薑黃素處理 NCI-H460 細胞24小時後的細胞存活 率。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05，** p< 0.01) (n=3)。
圖3.2 不同濃度之薑黃素處理 NCI-H460 細胞48小時後的細胞存活率。數 據結果以 mean±SD 値表示 ( * p< 0.05，** p< 0.01) (n=3)。
可以發現大細胞肺癌細胞 NCI-H460 在薑黃素濃度超過 20 μM後，其 存活率乃急速下降。但若將圖3.1與圖3.2 重疊起來，二者的存活率曲線十 分相近。顯示薑黃素作用24或48小時對NCI-H460細胞的毒殺效果是類似的
（圖3.3）。利用倒立式相位差顯微鏡觀察細胞的形態，加入不同濃度的薑 黃素處理24小時後，發現隨著薑黃素的濃度增加，NCI-H460細胞數目明顯 下降，且有細胞形態不完整、細胞膜皺縮、與空泡化的現象（如圖3.4）。
當薑黃素的作用時間為48小時，NCI-H460細胞的外形也出現類似的變化
（圖3.5）。
圖3.3.薑黃素作用24與48小時對NCI-H460細胞的毒殺效果重疊作圖。二者 曲線十分相似。
圖3.4 薑黃素處理 24 小時後細胞的形態的改變。以倒立式相位差顯微鏡 觀察發現隨著藥物濃度的上升，NCI-H460 細胞數目有明顯下降的趨勢，
且有細胞形態不完整、細胞膜皺縮與細胞空泡化的現象。放大倍率200 X。
圖3.5 薑黃素處理48小時後細胞的形態的改變。以倒立式相位差顯微鏡觀 察發現隨著藥物濃度的上升，NCI-H460 細胞數目有明顯下降的趨勢，且 有細胞形態不完整、細胞膜皺縮與細胞空泡化的現象，放大倍率200 X。
二、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460細胞週期的影響
利用流式細胞計數儀評估不同濃度的薑黃素處理24及48小時後，加入 PI，並觀察其細胞週期的改變。結果在某些濃度下，G2/M 期之細胞比例 有顯著的上升，由此可知，薑黃素可以使人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 的細胞週期在G2/M 期停滯 (G2/M arrest)。而且當薑黃素濃度高於20 μM，
sub-G1 peak 所佔比例顯著升高，代表了細胞凋亡的比例增加（如圖3.6、
圖3.7）。
圖3.6A
圖3.6B
圖3.6C
圖3.6 不同濃度之薑黃素作用24小時對NCI-H460細胞細胞週期分佈影 響。數據結果以mean ± SD 値表示，A：流式細胞儀圖；B： Sub-G1 peak
（代表apoptosis） 所佔的比例；C：長條圖顯示部分濃度的curcumin會 導致G2/M arrest。 ( * p< 0.05，** p< 0.01，***p<0.001) 。(n=3)
圖3.7A
圖3.7B
圖3.7C
圖3.7 不同濃度之薑黃素作用48小時對NCI-H460細胞細胞週期分佈影 響。數據結果以mean ± SD 値表示，A：流式細胞儀圖；B：Sub-G1 peak
（代表細胞凋亡） 所佔的比例；C：長條圖顯示部分濃度的curcumin會導 致G2/M arrest。 ( * p< 0.05，** p< 0.01，***p<0.001) 。(n=3)
三、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 產生活性氧化物量的改變 活性氧化物（reactive oxygen species；ROS）在誘導細胞凋亡
當中扮演一個重要的角色。粒線體是ROS產生的主要位置而這又和細胞的 死亡有關。粒線體中ROS的大量產生（ROS burst）會造成粒線體的功能不 良（mitochondrial dysfunction）。為了檢測薑黃素誘導之細胞凋亡是否和 ROS的產生有關，在此利用流式細胞儀分析細胞中ROS的產生。利用流式 細胞計數儀評估濃度25 μM的薑黃素處理不同時間1、3、6、12、24小時，
再加入H2DCFDA，並觀察其產生活性氧化物的情形。結果發現因著薑黃素 的作用，流式細胞儀曲線有右移的趨勢（圖3.8），表示薑黃素作用作用導
致活性氧化物 ROS產量增多。
圖3.8A
圖3.8B
圖3.8 25 μM薑黃素作用不同作用時間所造成的 NCI-H460 細胞之 ROS 產量變化。結果發現流式細胞計數儀曲線因著薑黃素的作用有右移 的趨勢(圖A)，表示薑黃素可導致活性氧化物 ROS 產生增多(圖B)。(n=3)
四、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 粒腺體膜電位的影響 利用流式細胞計數儀評估濃度25 μM的薑黃素分別處理1、3、6、12及 24 小時之後，加入DioC6，並觀察其產生膜電位變動的情形。結果顯示：
薑黃素作用後，流式細胞儀曲線地有左移的趨勢，表示細胞粒線體膜電位 差的降低（Mitochondria depolarization），進而誘導細胞凋亡的發生（圖 3.9）。
圖3.9A
圖3.9B
圖3.9 25 μM薑黃素作用不同作用時間所造成的 NCI-H460 細胞之粒腺體 膜電位（ΔΨm）變化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果 顯示：薑黃素作用後， 粒腺體膜電位差數值明顯下降。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( *** p< 0.001) 。(n=3)
五、 薑黃素對人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460之鈣離子釋出影響
已知內質網中鈣離子釋出會造成粒線體膜電位（ΔΨm）之下降，前述 結果得知粒線體膜電位在24小時內即有下降之現象發生，為探討先前發現 之粒線體膜電位在短時間即下降之原因，在此以Fluo-3/AM 會特異性的和 鈣離子結合之特性，利用流式細胞儀分析鈣離子的釋出，Fluo-3/AM會與鈣 離子特異性結合，螯合鈣離子之螢光染劑會有光學特性上的改變，在（紫 外光）UV 的激發下，Fluo-3/AM 放出光（emission）的強度會隨著細胞內 鈣離子濃度的改變，而發散出不同強度的螢光，故可用比例法測得或直接 測得的螢光強度得到鈣離子濃度的相對值，實際濃度需經校對後獲得。
利用流式細胞計數儀評估濃度25 μM的薑黃素分別處理1、3、6、12及24 小 時之後，加入Fluo-3/AM，並觀察其產生鈣離子的情形。結果發現薑黃素作 用後，流式細胞儀圖曲線向右偏移，表示薑黃素會促使細胞內鈣離子濃度 增加（如圖3.10）。
圖3.10A
圖3.10B
圖3.10 NCI-H460 細胞給予濃度25 μM之薑黃素所造成的胞內鈣離子濃 度變化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，
胞內鈣離子濃度明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05)。
(n=3)
六、利用流式細胞儀檢測薑黃素對大細胞肺癌細胞 NCI-H460之細胞凋亡 相關蛋白質Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 活性的影響
由前述實驗結果顯示，以薑黃素處理 NCI-H460 細胞，會造成細胞 週期的停滯，並誘導細胞走向細胞凋亡途徑。Caspase-3、Caspase-8及 Caspase-9為cysteine protease family之成員，是參與細胞凋亡之主要作用蛋 白。Caspase-3 的活化會促使 PARP（poly（ADP-ribose）polymerase）分 解，進而造成DNA fagmentation 之產生，造成細胞凋亡之現象。
本實驗利用PhiPhiLux-G1D1 kit（OncoImmunin, Inc., Maryland, USA）
檢測casapse-3、Caspase-8及Caspase-9之活性。以25 μM 濃度之薑黃素投予 NCI-H460細胞經6~72小時後收集細胞，加入PhiPhiLux-G1D1 kit 中之基質 反應，以探討薑黃素是否誘導Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9活性產生。
實驗結果顯示，以薑黃素處理之人類大細胞肺癌NCI-H460細胞可見流式細 胞儀圖形的 caspae-3 、Caspase-8 及capsase 9曲線都有向右偏移的趨勢，
由此可推知：薑黃素可誘導人類大細胞肺癌NCI-H460細胞之caspase-3、
Caspase-8及Caspase-9 活性增加，進而促使細胞凋亡發生（如圖3.11、3.12、
3.13）。
圖3.11A
圖3.11B
圖3.11. NCI-H460 細胞接受25 μM薑黃素作用後其 caspase 3 活性的變 化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，caspase 3 活性明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05)。(n=3)
圖3.12A
圖3.12B
圖3.12 NCI-H460 細胞接受25 μM薑黃素作用後其 caspase 8 活性的變 化。A：流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，caspase 8 活性明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05;
***p<0.001)。(n=3)
圖3.13A
圖3.13B
圖3.13 NCI-H460 細胞接受25 μM薑黃素作用後其 caspase 9 活性的變 化。A： 流式細胞儀圖。B：長條量化圖。結果顯示：薑黃素作用後，caspase 9 活性明顯升高。數據結果以 mean ± SD 値表示 ( * p< 0.05; **p<0.01)。
(n=3)
七、加入Caspase 8 與 ROS 抑制劑對薑黃素在 NCI-H460 細胞影響的改 變
接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有Caspase 8 抑制劑 (Z-IETD-fmk) 的情況下，其caspase 8 活性曲線在流式細胞儀圖右移的程度較小，表示其 caspase 8活性增加較不明顯；且細胞存活率較沒有抑制劑時明顯變高（圖 3.14）。
接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有ROS 抑制劑 (NAC) 的情況 下，其ROS產量曲線在流式細胞儀圖右移的程度較小，表示其ROS產量增 加較不明顯；且細胞存活率較沒有抑制劑時明顯變高（圖3.15）。
圖3.14A
圖3.14B
圖3.14C
圖3.14 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有或無 Caspase 8 抑制劑 (Z-IETD-fmk)的情況下，對 Caspase 8 活性與細胞存活比率的影響。A：
流式細胞儀顯示加入caspase 8 抑制劑的細胞其caspase 8活性曲線右移的 程度較小；B：長條圖顯示加入抑制劑的細胞其caspase 8活性增加較不明 顯；C： 有同時加入 caspase 8 抑制劑的NCI-H460 細胞存活比例較高。
(n=3)
圖3.15A
圖3.15B
圖3.15C
圖3.15. 接受薑黃素作用後的 NCI-H460 細胞在有或無 ROS 抑制劑 (NAC) 的情況下，對ROS 產量與細胞存活比率的影響。A： 流式細胞儀 顯示加入NAC的細胞其ROS 產量曲線右移的程度較小；B：長條圖顯示加 入抑制劑的細胞其ROS產量增加較不明顯；C：有同時加入NAC的NCI-H460 細胞存活比例較高。(n=3)
八、免疫螢光染色法偵測 endo G、AIF、 cytochrome c、GADD153 與 GRP78 在細胞質與細胞核的表現
經過25 μM 薑黃素作用24小時後，以免疫螢光法可偵得NCI-H460 細胞質 內的endo G, AIF, cytochrome c, GADD153 與 GRP78 都有增加，且其中 endo G, cytochrome c 與 GADD153 亦呈現 nuclear translocation 現象（圖 3.16）。
圖3.16A
圖3.16B
圖3.16C
圖3.16D
圖3.16E
圖3.16. 經過25 μM 薑黃素作用24小時後，以免疫螢光法染色、共軛焦顯 微鏡偵測 NCI-H460 內endo G (A)、AIF (B)、 cytochrome c (C)、
GADD153 (D) 與 GRP78 (E)的含量與位置。圖形顯示：前述五種物質在 細胞質內都有增加，且其中endo G, cytochrome c 與 GADD153 亦呈現 nuclear translocation 現象。
九、 利用西方墨點法檢測薑黃素對人類 NCI-H460 細胞之凋亡與週期調控 有關蛋白表現量的影響
先前的實驗結果顯示，薑黃素會導致大細胞肺癌細胞 NCI-H460 凋 亡，為探究其機制，故接著以西方墨點法偵測參與調控細胞凋亡相關蛋白 的表現，以α-tubulin 作為 internal control。結果分項敘述於後（圖 3.17）：
一、細胞膜死亡受體凋亡路徑的相關蛋白表現
以濃度25 μM 薑黃素處理人類大細胞肺癌細胞 NCI-H460 株
NCI-H460 不同時間後，利用西方墨點法觀察發現，隨著時間的延長， Fas 蛋白表現量增加。
圖3.17A
圖3.17B
圖3.17 用西方墨點法檢測薑黃素對人類NCI-H460細胞之凋亡與週期調控 有關蛋白表現量的影響。經薑黃素25 μ M作用不同時間後，測定NCI-H460 細胞內蛋白質含量的改變。A圖：與細胞凋亡相關蛋白；B圖：調控細胞週 期相關蛋白。
二、調控細胞凋亡的 Bcl-2 family 蛋白表現
二、調控細胞凋亡的 Bcl-2 family 蛋白表現