I-Shou University Institutional Repository:Item 987654321/11145

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(1)義守大學生物技術與化學工程研究所碩士論文. 銅離子 (II)與鄰苯二酚氧化反應的取代基效應探討 The Substituent Effect for the Oxidation of Catechol with Aqueous Copper(II) Ion. 研究生：黃國泰指導教授：李少榕博士. 中華民國九十九年七月.

(2) 銅離子 (II)與鄰苯二酚氧化反應的取代基效應探討 The Substituent Effect for the Oxidation of Catechol with Aqueous Copper(II) Ion 研究生：黃國泰. Student：Huang, Kuo-Tai. 指導教授：李少榕. Advisor：Lee, Shao-Yung. 義守大學生物技術與化學工程研究所碩士論文 A Thesis Submitted to Graduate Institute of Biotechnology and Chemical Engineering I-Shou University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Master degree in Biotechnology and Chemical Engineering July , 2010 Kaohsiung, Taiwan, Republic of China. 中華民國九十九年七月.

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(4) 摘要近年來許多研究對於與鄰苯二酚氧化的反應都很感興趣：含有金屬離子的氧化酶能有效催化鄰苯二酚氧化的反應，產生不同的產物；有些會促使鄰苯二酚開環裂解，有些會導致鄰苯二酮的生成，因而相關的反應機制引發討論。不同金屬的氧化酶合成物也陸續的問世，其與鄰苯二酚氧化的相關反應更被廣泛的探討；然而在這些研究當中，對於探討氧化酶與鄰苯二酚氧化反應的動力學相當缺乏。本研究藉由觀察 CoIII(NRS)錯合物在反應系統中的吸收度變化，測定二價銅離子與各種不同取代基的鄰苯二酚氧化反應的反應速率。在相同溫度、離子強度下進行一系列的相關實驗，探討反應物的濃度、pH 值對本反應系統的影響。本研究結果顯現二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的反應速率與二價銅離子的濃度成正比，卻與鄰苯二酚的濃度幾乎沒有影響，因此反應速率方程式如下式所示：.   . d Cu   k Cu 2 dt. . 在反應系統中，相關鄰苯二酚的濃度皆設定為定值，所獲得的一級反應速率常數 k 隨取代基不同而有明顯的差異。反應速率常數的對數值 log k 與取代基常數 σ 的線性關係符合 Hammett equation 的規範；同時 ρ 為負值，顯. I.

(5) 現反應速率決定步驟中芳香族傾向失去電子，因此反應速率決定步驟可推測如下式所示：. Cu 2  Cat 2  Cu   Cat . 關鍵字：鄰苯二酚；二價銅離子；取代基效應. II.

(6) Abstract The study for the oxidation reaction of catechol has been interested for many years.. A. number of metal-containing enzymes are known to act as oxidases toward catechol and its derivatives to form o-quinone or ring-cleaved products.. Therefore, various metal-containing. enzymes have been synthesized and the reaction mechanism has been investigated extensively. However, the kinetic study for this reaction is still rare. In this study, the reaction rate for the oxidation of various substituted catechol with copper(II) ion was determined by monitoring the absorption change of CoIII(NRS) in aqueous solution.. The effect of the concentration of the reactants as well as the pH of the solution. was studied at constant temperature and ionic strength. The reaction rate of catechol with copper(II) ion shows first-order dependence Cu(II) ion, but little dependence on the concentration of catechol.. The reaction rate law may be. expressed as :.   . d Cu   k Cu 2 dt. . In this reaction system the first-order rate constant k which determined at constant concentration of catechol shows strong dependence on the substitute of the catechol.. The. good linear relation between log k and  is consistent with Hammett equation. The negative value of  suggests that electron-losing from aromatic ring was occurred in the transition state. The rate-determining step was proposed as the follow:. Cu 2  Cat 2  Cu   Cat . Key words：copper(II) ion、catechol、substituent effect III.

(7) 致謝非常感謝我的指導教授李少榕老師，讓我有機會在他的教導下學習。他總是把我們當作他自己的小孩，對我們無微不至的照顧。當我面臨問題求助於他時，他不會直接把方法告訴我，而是提供我思考的方式，藉由思考之後所得到的結果才是自己想要的答案。老師曾經說過一句話：我不奢求你從我身上拿走很多知識，但是你一定要從我身上明白一些做人處事的道理。能夠完成這篇論文，老師扮演一個很關鍵的角色，老師設身處地的替我著想，他明白要完成一篇論文不是一件那麼容易的事情，所以他願意花時間陪伴在我身邊，幫助我完成這篇論文。我真誠的在這裡致上我最大的敬意。在此也感謝楊志馮老師，讓我有機會擔任他所任教的實驗課程的助教，重新溫習一些基本的實驗操作技巧以及觀念，學習如何去與學弟妹溝通。楊老師總是秉持著：不要把我當作一個老師看待，把我當作朋友來相處。老師又說過一句話：在這個世界上，誰都有可能忘掉你，唯一不可能把你忘掉的人就是你的父母。非常感謝我的父母願意支持我完成學業，當我面臨窘境的時候，縱然對我些許不諒解，但是還是願意無怨無悔的付出，支持我所決定的選擇。人生有好幾個階段，我非常感謝陪我一起走這個階段的朋友們，在一起的時光真的很快樂，但是天下沒有不散的筵席，願你我能常聯繫，大家遇到難題能迎刃而解。最後對這個系上我所認識的每一個人，獻上最大的祝福，有緣認識你們是我上輩子修來的福氣。即使我們沒有最頂尖的技術，但是我們擁有最濃厚的人情味。. IV.

(8) 目錄中文摘要……………………………………………………………………………………………………………………I 英文摘要…………………………………………………………………………………………………………………III 致謝…………………………………………………………………………………………………………………………IV 目錄………………………………………………………………………………………………………………………….V 表目錄……………………………………………………………………………………………………………………XIV 圖目錄……………………………………………………………………………………………………………………XV 壹、緒論……………………………………………………………………………………………………………….1 貳、實驗………………………………………………………………………………………………………………18 一、藥品……………………………………………………………………………………………………18 二、製備……………………………………………………………………………………………………18 [Co(NH3)5N3](NO3)2 的製備……………………………………………………………….18 三、二價銅離子與鄰苯二酚的反應動力學……………………………………………..19 四、分析……………………………………………………………………………………………………20 參、結果………………………………………………………………………………………………………………21 UV-vis 光譜測定…………………………………………………………………………………………..21 定量分析………………………………………………………………………………………………………24 肆、討論………………………………………………………………………………………………………………30 二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的動力學反應系統………………………………...30 各種不同取代基的鄰苯二酚的反應速率常數……………………………………………32 反應機制……………………………………………………………………………………..………………36 伍、參考文獻………………………………………………………………………………………………………38 附圖 1-1. 在 Cu2+(0.992 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係…………..………….…………41. V.

(9) 附圖 1-2. 在 Cu2+(1.03 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7.4)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係…………………………………41. 附圖 1-3. 在 Cu2+(0.523 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………..………42. 附圖 1-4. 在 Cu2+(0.495 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………..………42. 附圖 1-5. 在 Cu2+(2.94 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係…………..……43. 附圖 1-6. 在 Cu2+(3.09 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..43. 附圖 1-7. 在 Cu2+(11.02 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..44. 附圖 1-8. 在 Cu2+(11.15 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..44. 附圖 1-9. 在 Cu2+(0.493 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..45. 附圖 1-10. 在 Cu2+(0.502 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..45. 附圖 1-11. 在 Cu2+(0.528 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..46. 附圖 1-12. 在 Cu2+(0.535 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..46. 附圖 1-13. 在 Cu2+(0.543 mM)與 3-Methoxycatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………..47. 附圖 2-1-1. 在 Cu2+(0.207 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….48 VI.

(10) 附圖 2-1-2. 在 Cu2+(0.374 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….48. 附圖 2-1-3. 在 Cu2+(0.601 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….49. 附圖 2-1-4. 在 Cu2+(0.785 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….49. 附圖 2-1-5. 在 Cu2+(0.992 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….50. 附圖 2-1-6. 在 Cu2+與 Catechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與 [Cu2+aq]的關係………………………………………………………………………………….50. 附圖 2-2-1. 在 Cu2+(0.204 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7.4)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….51. 附圖 2-2-2. 在 Cu2+(0.406 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7.4)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係…………………………….…51. 附圖 2-2-3. 在 Cu2+(0.609 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7.4)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….52. 附圖 2-2-4. 在 Cu2+(0.854 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7.4)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….52. 附圖 2-2-5. 在 Cu2+(1.03 mM)與 Catechol 的反應系統中(pH = 7.4)，CoIII(NRS) 錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係……………………………….53. 附圖 2-2-6. 在 Cu2+與 Catechol 的反應中(pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係…………………….……………………………………………………….53. 附圖 3-1-1. 在 Cu2+(0.109 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………54. 附圖 3-1-2. 在 Cu2+(0.209 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………54 VII.

(11) 附圖 3-1-3. 在 Cu2+(0.346 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………55. 附圖 3-1-4. 在 Cu2+(0.399 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………55. 附圖 3-1-5. 在 Cu2+(0.523 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………56. 附圖 3-1-6. 在 Cu2+與 4-Methylcatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………56. 附圖 3-2-1. 在 Cu2+(0.104 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………57. 附圖 3-2-2. 在 Cu2+(0.197 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………57. 附圖 3-2-3. 在 Cu2+(0.318 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………58. 附圖 3-2-4. 在 Cu2+(0.407 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………58. 附圖 3-2-5. 在 Cu2+(0.495 mM)與 4-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………59. 附圖 3-2-6. 在 Cu2+與 4-Methylcatechol 的反應中(pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………….…………………………………………………..59. 附圖 4-1-1. 在 Cu2+(1.34 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………60. 附圖 4-1-2. 在 Cu2+(1.62 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………60. 附圖 4-1-3. 在 Cu2+(2.15 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………61 VIII.

(12) 附圖 4-1-4. 在 Cu2+(2.36 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………61. 附圖 4-1-5. 在 Cu2+(2.76 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………62. 附圖 4-1-6. 在 Cu2+(2.94 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………62. 附圖 4-1-7. 在 Cu2+與 4-Chlorocatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………63. 附圖 4-2-1. 在 Cu2+(0.508 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………63. 附圖 4-2-2. 在 Cu2+(0.97 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………64. 附圖 4-2-3. 在 Cu2+(1.38 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………64. 附圖 4-2-4. 在 Cu2+(1.98 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………65. 附圖 4-2-5. 在 Cu2+(2.59 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………65. 附圖 4-2-6. 在 Cu2+(3.09 mM)與 4-Chlorocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………66. 附圖 4-2-7. 在 Cu2+與 4-Chlorocatechol 的反應中(pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………66. 附圖 5-1-1. 在 Cu2+(2.7 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………67. 附圖 5-1-2. 在 Cu2+(2.91 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………67 IX.

(13) 附圖 5-1-3. 在 Cu2+(5.35 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………68. 附圖 5-1-4. 在 Cu2+(6.99 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………68. 附圖 5-1-5. 在 Cu2+(9 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………69. 附圖 5-1-6. 在 Cu2+(10.5 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………69. 附圖 5-1-7. 在 Cu2+(11.02 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………70. 附圖 5-1-8. 在 Cu2+與 4-Nitrocatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………70. 附圖 5-2-1. 在 Cu2+(2.87 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………71. 附圖 5-2-2. 在 Cu2+(5.17 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………71. 附圖 5-2-3. 在 Cu2+(6.82 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………72. 附圖 5-2-4. 在 Cu2+(8.96 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………72. 附圖 5-2-5. 在 Cu2+(11.15 mM)與 4-Nitrocatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………73. 附圖 5-2-6. 在 Cu2+與 4-Nitrocatechol 的反應中(pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………73. 附圖 6-1-1. 在 Cu2+(0.118 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………74 X.

(14) 附圖 6-1-2. 在 Cu2+(0.214 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………74. 附圖 6-1-3. 在 Cu2+(0.344 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………75. 附圖 6-1-4. 在 Cu2+(0.422 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………75. 附圖 6-1-5. 在 Cu2+(0.493 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………76. 附圖 6-1-6. 在 Cu2+與 4-tert-Butylcatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………76. 附圖 6-2-1. 在 Cu2+(0.096 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………77. 附圖 6-2-2. 在 Cu2+(0.209 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………77. 附圖 6-2-3. 在 Cu2+(0.29 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………78. 附圖 6-2-4. 在 Cu2+(0.439 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………78. 附圖 6-2-5. 在 Cu2+(0.502 mM)與 4-tert-Butylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………79. 附圖 6-2-6. 在 Cu2+與 4-tert-Butylcatechol 的反應中(pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係………………………………………………………………..79. 附圖 7-1-1. 在 Cu2+(0.114 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………80. 附圖 7-1-2. 在 Cu2+(0.209 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………80 XI.

(15) 附圖 7-1-3. 在 Cu2+(0.316 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………81. 附圖 7-1-4. 在 Cu2+(0.414 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………81. 附圖 7-1-5. 在 Cu2+(0.528 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………82. 附圖 7-1-6. 在 Cu2+與 3-Methylcatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………….…………………………………………..82. 附圖 7-2-1. 在 Cu2+(0.101 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………83. 附圖 7-2-2. 在 Cu2+(0.217 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………83. 附圖 7-2-3. 在 Cu2+(0.328 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………84. 附圖 7-2-4. 在 Cu2+(0.409 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………84. 附圖 7-2-5. 在 Cu2+(0.535 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7.4)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………85. 附圖 7-2-6. 在 Cu2+與 3-Methylcatechol 的反應中(pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………85. 附圖 8-1-1. 在 Cu2+(0.101 mM)與 3-Methoxycatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………86. 附圖 8-1-2. 在 Cu2+(0.195 mM)與 3-Methoxycatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………86. 附圖 8-1-3. 在 Cu2+(0.303 mM)與 3-Methoxycatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………87 XII.

(16) 附圖 8-1-4. 在 Cu2+(0.401 mM)與 3-Methoxycatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………87. 附圖 8-1-5. 在 Cu2+(0.543 mM)與 3-Methoxycatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係………………88. 附圖 8-1-6. 在 Cu2+與 3-Methoxycatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………………………………………………………88. XIII.

(17) 表目錄表 1-1. 銅離子錯合物 Cu(O2Ncat)(tbeda)與 Cu(O2Ncat)(tmeda)的一些熱力學相關數據………………………………………………………………………………………….15. 表 3-1. 在二價銅離子與不同取代基的鄰苯二酚氧化反應系統中， CoIII(NRS)錯合物的吸收度與時間的關係，附圖對照表………………….…25. 表 3-2. 在二價銅離子與不同取代基的鄰苯二酚氧化反應系統中，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係，附圖對照表…………………………………..26. 表 3-3. 二價銅離子與各種不同取代基的鄰苯二酚氧化反應的一級反應速率常數 k…………………………………………………………………………………………….…29. 表 4-1. 二價銅離子與各種不同取代基的鄰苯二酚氧化反應的一級反應速率常數 k 與 Hammett equation 的 σm 及 σp 值…………………………………………33. XIV.

(18) 圖目錄圖 1-1. 硫胺素焦磷酸的結構圖…………………………………………………………………………1. 圖 1-2. 吡哆醛-5-磷酸的結構圖…………………………………………………………………………2. 圖 1-3. 菸鹼醯胺輔酶（NAD+ or NADP+）的結構圖…………………………………………2. 圖 1-4. 鄰苯二酚與氧分子受不同催化酶催化的路徑…………………......………………4. 圖 1-5. 雙核銅金屬中心的結構圖………….………………………………………………………….5. 圖 1-6. 鄰苯二酚的結構……………………………………………….……………………………………6. 圖 1-7. (CuII)2(O22-)衍生物的結構圖，L 為其配位基……….………………….……………..6. 圖 1-8. 雙核銅金屬中心與鄰苯二酚的反應機制(假設性)………………………………..8. 圖 1-9. 雙核銅金屬中心與鄰苯二酚的反應機制(證實)……………………………………9. 圖 1-10. 雙核銅金屬中心與鄰苯二酚反應的能階圖………………………………….….…10. 圖 1-11. 一些結構相似的配位基……………………………………………………………..………..13. 圖 1-12. 化合物 Cu(O2Ncat)(tbeda) 和 Cu(O2Ncat)(tmeda)的結構圖…………..……14. 圖 1-13. 單螯化合物在酸性溶液中變成雙螯化合物再經由氧化裂解………..……15. 圖 1-14. 亞硝基苯甲酸與 R-salt 反應後產生的產物結構圖……..…………..……….…16. 圖 3-1. 合成物[Co(NH3)5N3](NO3)2 的 UV-vis 光譜圖…………..………………..…….…21. 圖 3-2. CoIII(NRS)錯合物在波長 500~550 nm 的吸收度變化……………..………..…22. 圖 3-3. 在 Cu2+(0.236 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係…………..…..…23. 圖 3-4. 在 Cu2+與 Catechol、3-Methylcatechol 以及 3-Methoxycatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係……………………..26. 圖 3-5. 在 Cu2+與 Catechol、4-Chlorocatechol 以及 4-Nitrocatechol 的反應中 (pH = 7.4)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係…………………………..27. 圖 3-6. 在 Cu2+與 4-Chlorocatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[4-Chlorocatechol]的關係…………………………………………………………..28 XV.

(19) 圖 4-1. 在 pH = 7 時，4-取代基的鄰苯二酚與二價銅離子氧化反應的 log k 與 σm 的關係圖……..………………….………………………………………………….34. 圖 4-2. 在 pH = 7 時，4-取代基的鄰苯二酚與二價銅離子氧化反應的 log k 與 σP 的關係圖…………………….…………………………………………………….…34. 圖 4-3. 在 pH = 7.4 時，4-取代基的鄰苯二酚與二價銅離子氧化反應的 log k 與 σm 的關係圖………………….…………………………………………………………35. 圖 4-4. 在 pH = 7.4 時，4-取代基的鄰苯二酚與二價銅離子氧化反應的 log k 與 σP 的關係圖……………….………………………………………………………….…35. XVI.

(20) 壹、緒論在人體中存在著許多種類的酵素；在化學上，酵素為蛋白質的一種；就功能而言，酵素是一種加速化學反應速度的生物催化劑。酵素可以在溫和的環境下進行快速的催化反應，因為它可以降低反應所必需的活化能，而且酵素對於它所催化的對象是非常專一性的。一般而言催化劑具備：一、影響反應速率，二、催化劑於反應結束後，並不會改變本身的結構，三、催化劑不會改變整體反應和其最終產物的自然特性。人體中的酵素主要有六大種類： (1) 氧化還原酶 (oxidoreductases)、(2) 轉移酶(transferases)、(3) 水解酶(hydrolases)、(4) 裂解酶 (lyases)、(5) 異構酶(isomerases)及(6) 連接酶(ligases)。氧化還原酶催化氧化還原反應；轉移酶催化將一個分子上的官能基轉移至另一個分子上的化學反應，水解酶催化經由水分子的加入使得連接的鍵斷掉，裂解酶將一個基團移去而形成雙鍵或將雙鍵破壞而加入一個基團的反應，異構酶催化分子間重新排列的反應，連接酶催化兩個分子連結的反應。許多酵素經過分離純化後通常是完全沒有活性的，因為在其純化過程中，所除去的離子和些許的有機物，對於酵素的活性而言是十分的重要。酵素活性所需要的這些離子和有機物質即稱為輔助因子或輔酶。輔酶是水溶性維生素所衍生出來的有機分子，為特定的酵素作用時所必頇的，譬如硫胺素焦磷酸(thiamine pyrophosphate)、吡哆醛-5-磷酸、菸鹼醯胺。硫胺素焦磷酸參與了 C-C 及 C-X 鍵結的斷裂反應，化學鍵被酵素催化斷裂時，硫胺素焦磷酸是必頇具備的輔酶，其結構如圖 1-1 所示。吡哆醛-5-磷酸是許多與 α-胺基酸 NH2. H S. N. N+ CH3. O -. O P O. -. O P O. O O-. 圖 1-1. 硫胺素焦磷酸的結構圖 1. N. CH3.

(21) 有關的反應所需要的輔酶，包括轉胺作用、α-脫羧作用、消旋作用、α，β 脫去反應、縮醛反應(aldolization)以及天冬胺酸的 β-脫羧反應，其結構如圖 1-2 所示。. O. H C. OPO32-. OH N+. CH3. H. 圖 1-2 吡哆醛-5-磷酸的結構圖. 菸鹼醯胺輔酶參與了含有氫化物轉移的反應，菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD+) 是菸鹼醯胺二種輔酶型式中的一種，另一個型式稱為菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷磷酸 (NADP+)，菸鹼醯胺輔酶的生理作用為還原當量(電子)的攜帶者。菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸最常見的功能是接受來自受質的兩個電子及一個質子，而進行代謝性氧化作用並且產生還原態的輔酶菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷磷酸，其結構如圖 1-3 所. H. O C NH2. O O P O-. N+. O. NH2. O O P OO. N O. N. N. OH(PO32-). OH. 圖 1-3. N. OH. OH. 菸鹼醯胺輔酶 (NAD+或 NADP+)的結構圖. 示；輔助因子可能是簡單的無機離子包括微量的金屬離子，如鈣、鎂、錳、鐵、銅、鋅、硒。這些金屬最重要的特徵就是它們具有高濃度的正電荷，能與二個或多個配位子作用的原子價態，以及能夠以二價或多價形式存在的能力。有些酵素 2.

(22) 需要輔助因子的幫助才能形成正確形狀的活化中心。輔助因子通常與酵素的特定區域作緊密的結合，酵素如果缺乏必需的輔助因子，則稱為脫輔基酶，而與輔助因子結合的完整酵素稱為全酶。含有鐵離子的輔酶常常會參與氧化還原反應，以鐵離子為輔助因子而進行的催化作用逐漸地被人們所重視，鐵離子最常見的氧化態為二價及三價，在生物系統中最常見的鐵的形式為血基質(heme)。1 金屬離子在生物體內擁有很重要的功能，主要的原因來自於很多化學反應必頇要金屬離子的參與才能夠進行，文獻中歸納出這些金屬離子或是無機化合物在進行生物化學反應時所扮演的角色有：一、利用金屬離子可以形成不同的配位環境(八面體、四面體、平面四方等)的特性，提供一個恰當的幾何環境或者是空配位(Vacant Site)，降低反應的活化能，促使小分子鍵的打斷或者是小分子與另一小分子鍵的形成。二、改變酸鹼的環境，當水分子鍵結到金屬離子時所形成的錯合物(Complex ion)的酸性會大於未與金屬鍵結的水分子。三、改變氧化還原的電位，金屬化合物的氧化還原電位會隨著不同的配位基(Ligand)而有所差異，這樣的改變會造成有些化學反應變得較為容易，相反地，也有機會讓有些化學反應變得較難進行。四、本身變為特殊電荷攜帶者，鈉離子、鉀離子和鈣離子的濃度可以作為電荷的調控，這些金屬離子濃度梯度的瞬間改變也許與神經系統訊息的傳遞有關係。五、本身變為骨幹或是較難結構的建構小單位，譬如細胞膜和去氧核醣核酸的結構維持都必頇要有金屬離子的參與。2 社會架構從以前的農業社會演化到工業社會，科技也日新月異的蓬勃發展，伴隨著科技的創新，一些汙染問題也慢慢浮出檯面，現今人們最不可或缺的產業為石化工業，石化工業的汙染問題就是會產生一些具有穩定的苯環結構的汙染物。許多文獻證明，某些微生物可以分解石化工業所產生的汙染物，好氧微生物在氧化芳香族化合物過程中，扮演著一個極為重要的角色。3 基本上，這些微生物分解芳香族化合物可以大致分為三類 4：(1) 礦化作用：微生物利用氧化酵素將氧分子插入芳香族化合物中，形成帶有氫氧基的中間產物，之後再進行裂解作用，某些土壤中的微生物，會藉由分解芳香環，來取得其生存所需要的碳。(2) 共 3.

(23) 代謝降解作用：微生物主要不是以裂解芳香族化合物為取得碳的來源，而是將芳香族化合物轉變為酚類、酸類等最終產物。(3) 非專一性自由基氧化作用：微生物利用過氧化酵素(胞外酵素)將難溶於水以及吸附在土壤中的芳香族化合物氧化，行成很多代謝物。芳香環無論是經由連續的步驟或雙烴化都會先變成鄰苯二酮，這個關鍵的化合物是藉由鄰苯二酚氧化酶(catechol oxidases)催化而成，5-8 如圖 1-4 所示，或者鄰苯二酚加氧化酶(catechol dioxygenases)將氧分子加氧化破. O. a. O. OH b + O2. CO2H CO2H. OH c. OH CO2H CHO. 圖 1-4. 鄰苯二酚與氧分子受不同催化酶催化的路徑. 壞環打開形成斷環產物。酵素鄰苯二酚氧化酶在活化部位含有兩個銅離子。根據文獻顯示，血藍蛋白(hemocyanin), 酪胺酸酶(tyrosinase；monophenol monooxygenase)及鄰苯二酚氧化酶含有雙核銅金屬中心(coupled dinuclear metal center)，5-6 雙核銅金屬中心的結構如圖 1-5 所示。鄰苯二酚經由此類型的酵素. 4.

(24) 圖 1-5. 雙核銅金屬中心的結構圖. 催化而開環裂解的產物，氧分子會從兩個氫氧基之間裂解而進去結合。9-10 一般而言，鄰苯二酚加氧化酶分為內部開環 (intradiol-cleaving) 和外部開環 (extradiol-cleaving)這兩種類型。這兩種類型的差異性主要是根據裂解的位置而定義，從兩個相鄰的氫氧基中間裂解進去的為內部開環類型(圖 1-4 的 b 反應步驟)，此種類型的氧化酶酵素的活化部位含有三價鐵離子. 11. 或二價銅離子。12 不在兩. 個相鄰的氫氧基中間裂解進去的為外部開環類型(圖 1-4 的 c 反應步驟)，這種類型的氧化酶酵素的活化部位含有二價鐵離子 13-15 、二價錳離子 16 或二價鎂離子。加氧化酶催化氧分子的兩個原子進入有機受質中，並且在新陳代謝的化學變化中扮演一個重要的角色。活性部位含有不同的二價鐵離子和三價鐵離子的作用機制被廣泛的討論。2,3-鄰苯二酚加氧化酶(catechol 2,3-dioxygenase；2,3-CTD) 從許多的土壤細菌中分離出來，一直以來被當作研究含有二價鐵離子氧化酶的基本原型。 2,3-CTD 催化鄰苯二酚經由外部環裂解變成 α -hydroxymuconic semialdehyde，如圖 1-4 的 c 反應步驟所示。經由一連串的實驗，最後得到活性部位含有不同的二價鐵離子及三價鐵離子的加氧化酶，會選擇開環的位置。 Catechol(pyrocatechol)，中文名稱鄰苯二酚，俗稱兒茶酚，分子式 C6H4(OH)2，結構如圖 1-6 所示，固體為無色結晶，接觸到光線或曝露在空氣中會變色、昇華。. 5.

(25) OH OH. 圖 1-6. 鄰苯二酚的結構. 溶於水、易溶於乙醇、乙醚。主要用於照相、染料、抗氧化劑、光穩定劑，並且為重要的醫藥中間體。存在於植物吉納(樹膠)、山毛櫸木材(焦油)，在 1839 年首次由 H. Reinsch 萃取的 catechin 中分離出來。銅在人體生命系統中，是一個很重要的輔助因子，人體內至少有二十多種蛋白質和酵素含有銅離子。銅離子是肌腱、骨骼、腎上腺、荷爾蒙、神經系統等重要的輔助金屬離子，血漿中含有血漿銅蛋白，能促進鐵的利用與活性，銅離子並能促進膠原蛋白的生長，有助於皮膚和毛髮的生長以及黑色素形成。許多文獻指出，某些含有銅的酵素可以扮演成氧化酵素，並且氧化鄰苯二酚(Catechol)及其衍生物。 17-18 此種氧化酶可以促使氧分子與一價銅離子錯合物進行反應，生成 (CuII)2(O22-)衍生物，19-24 如圖 1-7 所示；相關的反應式則如 Scheme 1-1 所示。. N N N N. L 圖 1-7. (CuII)2(O22-)衍生物的結構圖，L 為其配位基. Scheme 1-1. LCuRCN   O2  LCuO2   RCN LCuRCN   LCuO2   LCuO2 CuL2  RCN 6. (1-1). (1-2).

(26) LCuO2 CuL2  irreversible decay. (1-3). Scheme 1-1 中，一個一價銅離子錯合物先與氧分子反應形成帶有氧分子的二價銅離子錯合物，接著再與另一個一價銅離子錯合物反應形成如圖 1-7 所示的結構。銅胺氧化酶(The copper amine oxidases，CAOs)是在生物體內發現的一種酵素，從細菌和真菌類到植物還有動物都可發現此種氧化酶。 Dooley 證明了 CuI-semiquinone 的存在，確定二價銅離子與鄰苯二酚反應後會產生 CuI-semiquinone，這種互變異構在好幾個模仿模型中都曾經出現。 25-27 Klinman 發現氧分子被酵素綁在非金屬的位置上，提出 CuI-semiquinone 並不是酶反應的主要反應路徑。28-30 根據 metal-replacement 實驗，31 發現含有二價鋅離子及二價鎳離子的酵素不具有活性，但是含有二價鈷離子的酵素具有相當於天然酵素(去氧化甲基胺)約 19%的催化效率。然而，整體反應速率跟活性部位的金屬沒有很顯著的影響，Klinman 認為金屬對於整個氧化作用的影響在於活化部位的活性大小。早先的研究中，好幾種功能模型被合成去參與鄰苯二酚裂解的反應機制，這些研究當中，含有銅的功能模型比較受到重視，這些功能模型顯示出，雙加氧酶的活性大小來自於配位基的性質以及鄰苯二酚配位基的螯合模式。4-Nitrocatechol 與鐵、錳模型系統的鍵結研究顯示出，外部開環鄰苯二酚加氧化酶選擇趨向於單溶離子狀態的鄰苯二酚，相反地內部開環鄰苯二酚加氧化酶趨向於雙溶離子狀態的鄰苯二酚。其中雙核銅金屬中心與鄰苯二酚的反應機制分別如圖 1-8 及圖 1-9. 7.

(27) 圖 1-8. 雙核銅金屬中心與鄰苯二酚的反應機制(假設性). 8.

(28) 圖 1-9. 雙核銅金屬中心與鄰苯二酚的反應機制(證實). 9.

(29) 圖 1-10. 雙核銅金屬中心與鄰苯二酚反應的能階圖. 所示。32 反應過程中的能階變化如圖 1-10 所示。圖 1-8 為假設雙核銅金屬中心與鄰苯二酚會呈現一個循環的機制。圖 1-9 利用圖 1-10 的能階圖正確的描繪出雙核銅金屬中心與鄰苯二酚的反應機制，從圖中可以明顯的發現，鄰苯二酚會先出一個氫氧基與雙核銅金屬中心結合。接著再出另一個氫氧基與雙核銅金屬中心鍵結，最後斷掉形成鄰苯二酮。過去幾十年，過渡金屬類型的配位基與鄰苯二酚及鄰苯二酮之間的配位基化學一直深受討論，特別是它們強烈的氧化還原特性以及所生成的化合物電位，可以存在大量的電子組態來自於金屬離子與一個或多個的鄰苯二酮配位基結合的 10.

(30) 電化學活性。電子組態的自由度來自於 catecholate (cat2-)、ο-semiquinonate (SQ‧ -. )以及ο-benzoquinone (BQ)這三者之間的氧化還原。之前的研究顯示，電荷分佈. 微妙的平衡以及分子的旋轉源自於“valence tautomerism”(VT)。利用“valence tautomerism”來觀察錳和鈷的化合物，有一項吸引人的地方就是，錳和鈷的化合物的物理性質相似於某些金屬化合物呈現出 spin-crossover，這些可逆轉換有助於創造可追尋的回憶。有鑑於此，一系列的混合價層 semiquinone-catecholate 過渡金屬混合物被準備來進行晶體 X-ray 的研究。這些化合物利用了鉻、錳、鈷以及其他過渡金屬，取代了鄰苯二酮上的中立金屬碳基。一些 FeIII(SQ)3 化合物與四種 semiquinone 配位基：Cl4SQ、PhenSQ、3,5-DBSQ 以及 3,6-DBSQ 中的金屬離子有一個共同特點在任何溫度下，金屬離子為高自旋三價鐵。混合價層 semiquinone-catecholate iron 化合物，譬如：[Fe(3,5-DBSQ)(3,5-DBCat)(bpy)]、 [Fe(DBSQ)(DBCat)(phen)] 以及 [Fe(phenSQ)(phenCat)(phen)] ‧ THF ，製備作為 Fe(SQ)3 化合物的還原劑，要小心處理防止這些 semiquinone 自由基螯合化合物自行裂解。對於這些化合物，除了晶體 X-ray 之外，在光譜方面也相對應在固態以及溶液中進行一些相關研究。其中，semiquinone 以及 catecholate 螯合鈷和錳的化合物受到相當大的關注，因為“valence tautomerism”受到溫度影響導致配位基上的電子轉移到金屬上或者金屬上的電子轉移至配位基上。透過觀測磁場和光譜的變化，可以得到位移方向從低自旋三價鈷到高自旋二價鈷，平衡三價鈷和二價鈷的氧化還原異構物如下式(1-4)所示。. Co III N  N SQCat   Co II N  N SQ2. (1-4). 對於錳而言，三個氧化還原異構物是可能發生的，其平衡由兩個式子所呈現出來，如下式(1-5)及式(1-6)所示。不僅如此，在其他配位基所形成的錳化合物，不. 11.

(31) Mn IV N  N Cat 2  Mn III N  N SQCat . (1-5). Mn III N  N SQCat   Mn II N  N SQ2. (1-6). 論是在固態或者溶液中也都可以觀察到相似的平衡轉換。鐵，在第一過渡金屬元素中，介於錳跟鈷之間，所以應該也會呈現出氧化還原的異構物，所以平衡三價鐵和二價鐵寫成如下式(1-7)所示。然而，到目前為止，沒有任何固態或在溶液中. Fe III N  N SQCat   Fe II N  N SQ2. (1-7). 可以證明三價鐵和二價鐵會有異構化平衡。在 2004 年，Banerjee31 合成了 FeIII(bispicen)(Cl4Cat)(Cl4SQ)，利用各種物理分析方法，譬如：單晶 X-ray 鑑定其結構、UV-vis-NIR 光譜、循環伏安法、EPR 以及磁性分析探討其電子結構，透過電子吸收光譜證實了不論在固態或者溶液中，低溫中會以 FeIII(bispicen)(Cl4Cat)(Cl4SQ) 呈現，反之在高溫中會出現異構物 FeII(bispicen)(Cl4SQ)2 。觀察化合物 FeIII(bispicen)(Cl4Cat)(Cl4SQ) 的 “ valence tautomerism”是第一次使用混合價層 semiquinone-catecholate ironIII 化合物，這個化合物之間的電子轉移相似於錳和鈷的化合物。大量種類的單核無血紅素鐵酵素，被發現參與氧分子的氧化還原過程。例如：內部開環鄰苯二酚加氧酶催化氧分子進入鄰苯二酚中，伴隨著氧化反應，受質轉變成非環 cis,cis-muconic acid 衍生物。過去 10 年中，模仿的結構模型和酵素的功能在生物有機化學是重要的研究目標。化合物 3,4-甲酸基鄰苯二酚加氧化酶 (protocatechuate 3,4-dioxygenase；3,4-PCD)的晶體結構來自於細菌 Pseudomonas putida 的 His2 Tyr2 的提供電子部位，參照 3,4-PCD 的結構，模型化合物被製備出來，其中包含酚類(phenolate)提供電子族群的官能基。雖然 3,4-PCD 的活性部位 12.

(32) 對於結構與光譜模型是最好的模型，但是對於氧化鄰苯二酚的能力卻是很弱，一個參照 3,4-PCD 最好的結構與光譜模型數據的模型化合物，由 Fujii 和 Funahashi 所製備出來。33 第一個用來探討鄰苯二酚加氧化酶的功能模型是由 Funabiki 所製備的，用來觀察鄰苯二酚裂解存在於鐵鹽類、吡啶與雙吡啶，然而在反應中的活性種類的性質卻是未知。在 1991 年，對於內部開環鄰苯二酚雙加氧酶最有效的模仿模型是由 Que 所製備的三價鐵離子錯合物含有配位基 tris[(2-pyridyl)methyl]amine (簡稱 tmpa)，34 如圖 1-11 所示。這個結果是藉由針對. N. N. N. N. N N N. N. pmea. tmpa N. N. N N N. N N N. pmap. 圖 1-11. tepa. 一些結構相似的配位基. 配位基系統性的變化得到的結論，官能基由酚類替換成羧酸類(carboxylate)以及吡啶 (pyridine)，官能基的改變會影響電子在配位基中傳遞的快慢。以三價鐵離子為中心所形成的化合物的路易士酸性的變化，可以藉由 UV-vis-NIR 光譜觀察這個化合物，觀察到鄰苯二酚類(catecholate)化合物的電荷轉移帶發生紅位移與極高的鄰苯二酚加氧化酶活性的關係。在以往的研究中，除了電子效應，配位基之中的空間效應也明顯的影響了 ironIII-catecholate 錯合物與雙氧之間的反應。35 在之前的研究中，得到一項結論，環的大小形狀強烈影響錳和銅的化合物的性能。36-39 在重要的生物電子轉移反應以及氧分子的氧化還原過程中的大多數金屬蛋 13.

(33) 白質的活性部位上可以發現銅離子，譬如：血藍蛋白、酪胺酸酶以及其他氧化酶。前者(生物電子轉移反應)在電子轉移蛋白質以及多分子銅氧化酶中含有藍銅(type 1)，後者(氧分子的氧化還原反應)含有血藍銅(type 2)，氧化酶將氧原子插入受質中，氧化酶與受質結合透過銅中間體進行還原反應，將氧還原成過氧化氫或水。蛋白質活性部位化學性質受到封閉環境中蛋白質氨基酸所提供的金屬離子。經過許多數據顯示，配位基的配體架構些許的改變；不論對於所有種類的一價銅與二價銅，都會強烈影響化學性質。因此，進一步的研究配位基所造成的影響，生物配位化學可以提供相關方面的見解。如圖 1-11 所示，配位基作了些許的改變，探討一價銅與氧分子以及二價銅離子錯合物所造成的影響，其中 tmpa 這個配位基對於內部開環鄰苯二酚加氧化酶與一價銅離子的氧化反應是最迅速的。 Cu(O2Ncat)(tbeda) (1) and Cu(O2Ncat)(tmeda) (2) 這兩種銅離子錯合物 ((tbeda)N,N,N’,N’-tetrabenzylethylenediamine, tmeda ) N,N,N’,N’-tetramethylethylenenediamine, O2NcatH2 = 4-nitrocatechol) 來自於過氯酸銅和 4-nitrocatechol 在三乙胺與選擇的配位基中，反應所產生的產物，這些化合物的結構和功能模型可以充分顯示出結合銅的鄰苯二酚系統，經由 X-ray 可以觀察到化合物的結構特點，結構式如圖 1-12 所示。. N. O Cu N O. O N O. N. O. N. O N O. Cu H3C. 圖 1-12. CH3. H3C. O CH3. 化合物 Cu(O2Ncat)(tbeda) 和 Cu(O2Ncat)(tmeda)的結構圖. 這些化合物經由 UV-vis, IR and EPR 光譜觀察，在過氯酸下會由原本的雙螯 14.

(34) O2Ncat 轉換成單螯 O2NcatH，如圖 1-13 所示。化合物在 DMF 溶液中，透過 UV-vis. O. NO2. OH. 圖 1-13. CuII. K2. O. -H+. II. Cu. CO2. O2. CO2. O. NO2. CuII. NO2. 單螯化合物在酸性溶液中變成雙螯化合物再經由氧化裂解. 觀測可以得到 Cu(O2Ncat)(tbeda) 和 Cu(O2Ncat)(tmeda)氧化反應的平衡常數分別為 4200 和 3500，這些化合物的氧化反應顯示出為二級反應動力學，二級反應速率常數 K 與一些相關的熱力學數據 (365.16 K) 如下表 1-1 所示。. 表 1-1. 銅離子錯合物 Cu(O2Ncat)(tbeda)與 Cu(O2Ncat)(tmeda)的一些熱力學相關數據. complex. K98℃ (102s-1 mol-1 dm3). ΔH≠(kJ mol-1). ΔS≠(J mol-1 K-1). Cu(O2Ncat)(tbeda). 4.63±0.23. 51±6. -137±16. Cu(O2Ncat)(tmeda). 0.89±0.16. 88±7. -57±19. 室溫條件下，將這些化合物與 [Cu(O2NcatH)(L)]ClO4 (L = tbeda, tmeda) 在 DMF 溶液中進行氧化反應，可以得到內部開環二價銅離子錯合物(2-nitro-muconato)。這些數據支持這項假設：不同的螯合配位基鄰苯二酚類與加氧化酶進行反應，只有 1,2-加氧化酶具有反應活性。40 Hoffmann 提到製備 Schaeffer 鹽類 (sodium 2,6-β-naphtholsulfonate)的亞硝基化合物，為一種綠色的化合物，但是跟鈷結合後，會變成一種紅棕色的染料。鐵染料又稱作 naphthol green B，其化學式為(C10H5NO5SNa)2Fe。Knecht 發現鈷的鹽類呈現褐色，鎳的鹽類則是呈現黃色。利用類似亞硝酸的亞硝基苯甲酸來處理 R-salt (sodium 2,3,6-β- naphtholsulfonate)會形成如圖 1-14 所示的結構。 15.

(35) O. NOH. N. O. OH. or SO3Na. 圖 1-14. SO3Na. SO3Na. SO3Na. 亞硝基苯甲酸與 R-salt 反應後產生的產物結構圖. Schaeffer 鹽類,nitroso-R-salt (NRS)與鐵鹽類結合會形成一種綠色的物質、鎳鹽類呈現褐黃色、鈷鹽類則形成艷麗的紅色染料。考慮其中的穩定性，選擇鈷與 α-nitroso-β-naphthol 的化合物，化學式為(C10H5NO8S2Na2)3Co。藉由 X-ray 繞射去鑑定其晶體結構失敗，但是此化合物固體為閃亮的黑色片或者紅色粉末。將其化合物溶於水、甲醇、乙醇會形成深紅色。羊毛與絲綢利用酸浴的方法去染色，會呈現非常漂亮乾淨的紅色，而且上色之後非常穩定，加熱和置於酸中並不會破壞顏色使其褪色。在酸性溶液中，鐵、鎳、銅等金屬的鹽類，會被破壞導致顏色改變，鈷的金屬鹽類，反倒不會被破壞，維持鮮豔的紅色。探討含水銅離子與鄰苯二酚反應的簡單絕氧氧化作用動力學，結果顯示二價銅離子內部開環鄰苯二酚類型為氧化還原反應，經由再分析驗證這是自動氧化反應。譬如：二價銅離子與鄰苯二酚在氧氣下作用。基本上有兩個原因為什麼簡單的鄰苯二酚氧化反應以前從來未被探討： 1、在絕氧情形下，因為反應速率太慢，使用光譜儀長時間連續追蹤較為困難。 2、鄰苯二酚氧化後的產物會在澄清的水溶液中沉澱，正常的光譜分析無法進行。有鑑於以上種種的資料顯示，發現對於探討氧化酶與鄰苯二酚氧化反應的動力學相當缺乏。大部分的研究都著重在替換催化酶上的金屬離子；或者改變催化酶連接的配位基，也許鄰苯二酚上的取代基，對於整體反應會有影響。在 2002 年，Kamau, P.與 Jordan, R. B.作了對於二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的相關研究。41 觀測分析方法為利用間接的方法觀測，觀察 CoIII(NRS)錯合物的吸收度變 16.

(36) 化得知二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的速率。本研究將利用相同的方法，探討各種不同取代基的鄰苯二酚與二價銅離子氧化反應。利用動力學來探討取代基對於鄰苯二酚與二價銅離子的反應是否具有影響；同時藉由 Hammett equation 的協助，了解取代基在這個反應系統中的作用，更進一步的去推測出整個反應的反應機制。文獻中顯示，鄰苯二酚一開始只有一個氫氧基會與雙核銅金屬中心作用，藉由 Hammett equation 中的值與 log k 的相關係數，或許能協助了解鄰苯二酚上的氫氧基是哪一個會先與二價銅離子作用。. 17.

(37) 貳、實驗一、藥品：硝酸鈷 (Cobalt Nitrate 6-Hydrate，J.T.Baker)、硝酸銨 (Ammonium Nitrate， SIGMA-ALDRICH)、疊氮化鈉 (Sodium Azide Natriumazid，Riedel-deHaën)，氨水 (Ammonium Hydroxide Solution, 33%，SIGMA-ALDRICH)、乙醇 (Alcohol, 95% ，台糖 ) 、乙醚. (Ether, Anhydrous ， J.T.Baker) 、 HEPES Free Acid. (4-(2-Hydroxyethyl) Piperazine-1-ethanesulfonic acid，UniRegion Bio-Tech)、過氯酸鈉 (Sodium Perchlorate Monohydrate，SHOWA)、氫氧化鈉 (Sodium Hydroxide， SHOWA)、硝酸銅 (Copper(II) Nitrate-3-hydrate，日本詴藥工業株式會社)、鄰苯二酚 (Pyrocatechol ， SIGMA-ALDRICH) 、 3- 甲基鄰苯二酚 (3-Methylcatechol, 98%，ALDRICH)、4-甲基鄰苯二酚 (4-Methylcatechol, 95+%，ALDRICH)、4-氯基鄰苯二酚 (4-Chlorocatechol，TCI)、4-硝基鄰苯二酚 (4-Nitrocatechol, 97%， ACROS ORGANICS)、4-第三丁基鄰苯二酚 (4-tert-Butylcatechol, 98% ，Alfa Aesar) 、 3- 甲氧基鄰苯二酚 (3-Methoxycatechol, 98% ， Alfa Aesar) 、磷酸 (Phosphoric acid，J.T.Baker)、亞硝基紅鹽 (Nitroso-R-Salt，Fluka)、醋酸鈉 (Sodium acetate trihydrate ， SIGMA-ALDRICH) 、鹽酸 (Hydrochloric acid min, 37% ， SIGMA-ALDRICH)等藥品，皆為現貨供應，直接使用。實驗中所使用的水溶液皆為 RO 水(MILLIPORE TANKPE100)。. 二、製備： [Co(NH3)5N3](NO3)2 的製備取 7.5 g 硝酸銨以及 2.5 g 疊氮化鈉溶於 15 mL 水混合 10 mL 氨水溶液中，取 3.05 g 硝酸鈷溶於 6.25 mL 水溶液中，將上述兩個溶液混合在一起，通入氧氣，在室溫下攪拌反應 2 個小時，2 個小時後溶液會呈現黃褐色。停止通入氧氣，把 18.

(38) 溶液置於水浴中(100 ℃)加熱攪拌反應 2 個小時，2 個小時後溶液會呈現深紫色。此時，將溶液置於冰浴中冷卻，溶液溫度下降之後過濾，收集到的固體用冰水、乙醇以及乙醚依序清洗過濾。清洗完畢的固體溶於 250 mL 水溶液(45 ℃~50 ℃) 中，趁熱過濾，取 2.5 g 硝酸銨加入濾液中，完全溶解之後置入冰浴，待其冷卻固體析出後過濾，收集到的固體用冰水、乙醇以及乙醚依序清洗過濾。乾燥風乾後，即可得到[Co(NH3)5N3](NO3)2 固體約 0.5592 g。. 三、二價銅離子與鄰苯二酚的反應動力學：取 1.2018 g HEPES 以及 2.6547 g 過氯酸鈉溶於 200 mL 水溶液中，完全溶解後滴入 0.1 M 氫氧化鈉水溶液，使用 pH meter 調整其 pH 至 7，調整完畢即可得到 pH = 7、μ= 0.1 的 HEPES 緩衝溶液。取 0.0123 g 硝酸銅溶於 100 mL HEPES 緩衝溶液中，即可得到 0.000509 M 硝酸銅水溶液，取 0.006 g [Co(NH3)5N3](NO3)2 溶於 50 mL 硝酸銅水溶液中，即可得到 0.000509 M 二價銅離子、0.000387 M [Co(NH3)5N3]-2 的水溶液，通入氮氣趕走溶液中的氧氣。取 0.0104 g 鄰苯二酚加入 50 mL HEPES 緩衝溶液中，得到 0.001889 M 鄰苯二酚水溶液，通入氮氣趕走溶液中的氧氣。取 30 mL 鄰苯二酚水溶液加上 20 mL 混合二價銅離子和 [Co(NH3)5N3]-2 的水溶液，在 22 ℃的水浴下進行反應，此時鄰苯二酚為 1.13 mM、二價銅離子為 0.204 mM 以及[(NH3)5CoN3]-2 為 0.155 mM。每隔 10 分鐘取一點，取完 10 點，每隔 20 分鐘取一點，取完 5 點，實驗結束。取點時，每次取 2 mL 混合液，加入 25 mL 定量瓶中，定量瓶中事先加入 5 mL 0.175 M 的磷酸水溶液，用來中止反應繼續進行。加入 3 mL 0.1325 M 亞硝基紅鹽水溶液以及 5 mL 3.67 M 醋酸鈉水溶液，置入水浴(60 ℃~70 ℃)中加熱，讓亞硝基紅鹽與鈷結合。再加入 5 mL 9 M 鹽酸水溶液，破壞銅離子，避免銅離子與亞硝基紅鹽結合，最後加水至 25 mL，抽取 sample 進行 UV-vis 光譜測定。. 19.

(39) 四、分析：使用三價鈷離子錯合物(Co(NH3)5N32+)作為一價銅離子的還原劑並且觀察二價鈷產生的標準分析法。利用 UV-vis 光譜(Hp G1103A)觀察波長 525 nm 的位置，記錄每點的吸收度，用時間對吸收度作圖，取 CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度前 40%的斜率當作 S。將 S 除以 CoIII(NRS)錯合物的莫耳吸收度即為二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的零級反應速率常數 kobs，利用二價銅離子的濃度對零級反應速率常數 kobs 作圖，得到的斜率即為一級反應速率常數 k。. 20.

(40) 参、結果 UV-vis 光譜測定 [Co(NH3)5N3](NO3)2 化合物很順利的製備完成，其 UV-vis 光譜圖如圖 3-1 所. 圖 3-1. 合成物[Co(NH3)5N3](NO3)2 的 UV-vis 光譜圖. 示。二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的動力學研究均在定溫以及固定溶液中的酸鹼值下進行探討。同時在此系統中鄰苯二酚的用量遠大於 Co(NH3)5N32+的用量，因此鄰苯二酚的濃度可以視為一常數。隨著反應進行，定時取出反應中的溶液，並且依照實驗步驟將反應中生成的二價鈷離子轉化為 CoIII(NRS)錯合物，並且量測其吸收度(λ= 525 nm)用來作為觀測此系統反應動力學的變化，其吸收度變化的圖形如圖 3-2 所示。圖 3-2 中依序由下往上分別為二價銅離子與鄰苯二酚. 21.

(41) 圖 3-2. CoIII(NRS)錯合物在波長 500~550 nm 的吸收度變化。 ◆：10 min；■：40 min；▲：70 min；●：100 min。. 氧化反應 10 min、40min、70min 以及 100min 所得到的 CoIII(NRS)錯合物的吸收度。二價銅離子會先與鄰苯二酚氧化反應還原成一價銅離子，接著三價鈷離子會氧化一價銅離子使其變化成二價銅離子以及本身還原為二價鈷離子，取出的溶液中加入 NRS，二價鈷離子與二價銅離子會與 NRS 反應生成 CoIII(NRS)以及 CuII(NRS)的錯合物，加入鹽酸可以破壞 CuII(NRS)錯合物。從反應過程中，不同時間觀測 λ, 525 nm(CoIII(NRS)錯合物的吸收峰)的吸收度，其圖形如圖 3-3 所. 22.

(42) 圖 3-3. 在 Cu2+(0.236 mM)與 3-Methylcatechol 的反應系統中(pH = 7)， CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度與時間的關係。 [3-Methylcatechol] = 1.2 mM, [Co(NH3)5N32+] = 0.15 mM, μ = 0.1 M, T = 22 ℃。. 示，圖 3-3 為二價銅離子與 3-Methylcatechol 反應時，在不同時間下產生的二價鈷離子與 NRS 作用後所產生的 CoIII(NRS)錯合物的吸收度變化。從圖 3-3 中可以清楚的呈現出 CoIII(NRS)錯合物會隨著時間的增加而逐漸增加，到最後會成一直線。吸收度不再上升代表反應中的 Co(NH3)5N32+已經完全轉化成二價鈷離子，所以後來再抽取出的溶液中，二價鈷離子並沒有增加，因此 CoIII(NRS)錯合物的量不會再改變。Co(NH3)5N32+在完全作用完之前，CoIII(NRS)錯合物的吸收度與時間幾乎成正比的增加變化，呈現出一線性關係的變化。當反應接近終止的時候，線性關係不再存在而逐漸趨於平緩，因此本實驗中皆以 CoIII(NRS)錯合物的吸收度前 40%的線性變化計算出其斜率 S。對於各種不同取代基的鄰苯二酚，都依照同樣方式進行數據分析。在二價銅離子與鄰苯二酚的氧化反應中，鄰苯二酚的濃度在實驗設計中遠大於 Co(NH3)5N32+的濃度，所以鄰苯二酚的濃度視為常數，二價銅離子與鄰苯二酚反應還原成一價銅離子，一價銅離子又會被三價鈷離子氧化成 23.

(43) 二價銅離子，整個反應中二價銅離子與一價銅離子為可逆反應，二價銅離子與鄰苯二酚的濃度皆可視為不變。因此反應中的動力學變化與所觀測到的結果相符。二價銅離子與各種不同取代基的鄰苯二酚氧化反應系統，同樣利用時間對每點 CoIII(NRS)錯合物的吸收度(525 nm)作圖類似圖 3-2 所示，其圖示請詳見附圖 1-1 至附圖 1-13。. 定量分析改變二價銅離子的濃度，固定溫度、鄰苯二酚的濃度、Co(NH3)5N32+的濃度以及溶液中的酸鹼值，進行一系列的探討。利用時間對每點 CoIII(NRS)錯合物的吸收度作圖，取 CoIII(NRS)錯合物在波長 525 nm 的吸收度前 40%的斜率當作 S，其圖形如表 3-1 所示。. 24.

(44) 表 3-1. 在二價銅離子與不同取代基的鄰苯二酚氧化反應系統中，CoIII(NRS)錯合物的吸收度與時間的關係，附圖對照表。. R-Catechol. 附圖. pH. H. 附圖 2-1-1 至附圖 2-1-5. 7. 附圖 2-2-1 至附圖 2-2-5. 7.4. 附圖 3-1-1 至附圖 3-1-5. 7. 附圖 3-2-1 至附圖 3-2-5. 7.4. 附圖 4-1-1 至附圖 4-1-6. 7. 附圖 4-2-1 至附圖 4-2-6. 7.4. 附圖 5-1-1 至附圖 5-1-7. 7. 附圖 5-2-1 至附圖 5-2-5. 7.4. 附圖 6-1-1 至附圖 6-1-5. 7. 附圖 6-2-1 至附圖 6-2-5. 7.4. 附圖 7-1-1 至附圖 7-1-5. 7. 附圖 7-2-1 至附圖 7-2-5. 7.4. 附圖 8-1-1 至附圖 8-1-5. 7. 4-Methyl. 4-Chloro. 4-Nitro. 4-tert-Butyl. 3-Methyl. 3-Methoxy. 綜合所有的實驗結果顯示，由圖形中前 40%的吸收度變化，均為一直線，其斜率 S 除於 CoIII(NRS)錯合物的莫耳吸收度 (1.48 × 104 M-1cm-1)為二價銅離子與鄰苯二酚氧化反應的零級反應速率常數 kobs。同時，對於二價銅離子與鄰苯二酚的氧化反應而言，此零級反應速率常數 kobs 都與反應中二價銅離子的濃度成正比關係，用二價銅離子的濃度對零級反應速率常數 kobs 作圖，得到的斜率為一級反應速率常數 k，其圖形如表 3-2 所示。. 25.

(45) 表 3-2. 在二價銅離子與不同取代基的鄰苯二酚氧化反應系統中，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係，附圖對照表。. R-Catechol. 附圖. pH. 附圖. pH. H. 附圖 2-1-6. 7. 附圖 2-2-6. 7.4. 4-Methyl. 附圖 3-1-6. 7. 附圖 3-2-6. 7.4. 4-Chloro. 附圖 4-1-7. 7. 附圖 4-2-7. 7.4. 4-Nitro. 附圖 5-1-8. 7. 附圖 5-2-6. 7.4. 4-tert-Butyl. 附圖 6-1-6. 7. 附圖 6-2-6. 7.4. 3-Methyl. 附圖 7-1-6. 7. 附圖 7-2-6. 7.4. 3-Methoxy. 附圖 8-1-6. 7. 將二價銅離子與各種不同取代基的鄰苯二酚氧化反應系統中，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係圖形放在一起比較，可以得到如圖 3-4 以及圖 3-5 所示。. 圖 3-4. 在 Cu2+與 Catechol、3-Methylcatechol 以及 3-Methoxycatechol 的反應中(pH = 7)，零級反應速率常數 kobs 與[Cu2+aq]的關係。 ◆為 Catechol；■為 3-Methylcatechol；▲為 3-Methoxycatechol。 [Co(NH3)5N32+] = 0.15 mM, μ = 0.1 M, T = 22 ℃。 26.