行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
台灣—捷克衛生害蟲生殖調控機制合作計劃：德國蜚蠊雄性
生殖副腺對雌成蟲繁殖及活動行為日週律動的影響(1/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2313-B-002-069- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學昆蟲學系暨研究所 計畫主持人： 李後晶 報告類型： 精簡報告 報告附件： 國際合作計畫研究心得報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 5 月 31 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫進度報告
台灣－捷克衛生害重生殖調控機制合作計畫：德國蜚蠊雄性生殖副腺對
雌成蟲繁殖及活動行為日週律動的影響 (1/3)
Taiwan － Czech Republic Cooperation Project on the Regulation
Mechanism of Reproduction for Medical Important Pest: The Role of Male
Accessory Glands on the Reproduction and Locomotor Circadian rhythm in
Female Adults of German
Cockroach
計畫編號：NSC 92-2313-B-002-069
執行期限：92 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日
主持人：李後晶 國立台灣大學昆蟲系
一、 中文摘要 德國蜚蠊（Blattella germanica）為世界性分布之衛生害蟲，目前仍困擾著世界 各地人類的生活。一般認為昆蟲之雄性生殖副腺分泌物與精包的合成有關，而雌性 副腺則可能與卵鞘的形成及抗菌蛋白之分泌等有關。因此，如能對德國蜚蠊之副腺 進行深入研究，則有利於對生殖系統之掌控，而有助於防治研究工作之進展。本計 畫先針對雌雄副腺之外部形態做觀察及描述，並進行蛋白質分析。性成熟雄蟲副腺 之外部形態可分為Uricose glands（UG）；Utricles（U）及 Conglobate gland（C）三 部分，UG 為具有五個分支的管狀構造，末端匯集成同一開口與 Ejaculatory pouch （EP）相連，內含有白色不透明分泌物。U 分為 12 種透明管狀構造，開口位於 EP， CG 則為一長管折疊成球狀構造，開口於 Ejaculatory duct。蛋白質分析發現雄成蟲除 Testis 外，UG；U；CG；EP 及 Seminal vesicles（SV）內的分泌物隨日齡逐漸累積增多，約至第5 日齡時達到最高量。雌蟲副腺的發育速度則與卵巢之發育一致。關
於德國蜚蠊之副腺蛋白研究，目前發現雄成蟲的睪丸內含有與Acp70A 相似之蛋白
質。
關鍵字：德國蜚蠊、家蚊、副腺蛋白、活動行為、日週律動
Abstract
The German cockroach is a cosmopolitan household species, which is closely associated with our daily life. In this project, we investigate the function of accessory glands on reproductive performances and locomotor circadian rhythm of the German
cockroach. The basic function of the accessory glands of male insects is to provide materials for the production of the spermatophore. In females, the accessory glands are important in the formation of ootheca and secretion of antibacterial proteins. Therefore, it is of great importance to study the accessory glands for understanding the mating system of the pest and consequently making contribution to further development of pest control. Firstly, we will observe and describe the morphology of the accessory glands for both sexes of the German cockroach. The relationships between accessory gland secretion and ootheca formation, egg number, survivorship of offspring and endocrine secretion (e.g. JH, ecdysone) for females, and spermatophore formation, time of copulation and survivorship of offspring for males will be examined. The daily secretion rhythm of the accessory glands will be investigated to reveal its circadian rhythm. In addition, the effects of male accessory gland secretion on female reproductive performances (e.g. re-mating rate, egg number, survivorship of offspring) and competition with other males’ sperms will be our focal point of research. In the last year of this project, we will conduct the bioassay for specific proteins of the accessory glands, including antibacterial analysis, reproductive performances and the effects on locomotor circadian rhythm of females. We will also purify the proteins and then, analyze and sequence the amino acids. Using the antibody of specific protein, we will be able to trace the localization of the specific protein during and after the process of copulation. We expect to understand more about the mating system of the German cockroach through the proposed studies. Furthermore, the effects of accessory glands from both male and female on reproductive performances and locomotor circadian rhythm will be elucidated.
Key-words: Blattella germanica, Culex pipiens, accessory gland protein, locomotion, circadian rhythm 二、 緣由與目的 什麼要合作研究衛生害蟲的生殖生理 國際間的合作不但可加速共同開發防治的新技術，也可互相提昇研究水準。在 91 年11 月間臺灣昆蟲學者訪問捷克科學院昆蟲所後，雙方對合作計劃的推動已有很高 的共識。目前我們與捷克科學院昆蟲所的 Dr. Ivan Gelbic 協商一個合 作計劃，將針為世界性分布的衛生害蟲家蚊及德國蜚蠊分別去探究其生殖生理的調 控機轉。希望藉此合作共同開發出合適的防治措施。 雄蚊的生殖副腺分泌物經由交尾傳送到雌蟲體內後，對雌蟲的影響分為五大類： 分別是抑制雌蟲的交尾行為 (Craig, 1967)、加速卵成熟 (Lounibous, 1994)、刺激雌 蟲產卵 (Leahy and Craig, 1965)、前產卵行為的改變 (由尋找寄主或食物轉變成尋找 產卵地點 (Klowden and Blackmer, 1987)、以及活動行為日週律動的改變。前四項與 其他昆蟲相似，這種影響可降低該雄蟲的精子的競爭壓力，以提高其適應值；最後
活動行為日週律動的改變是一個較有趣的發現。
Anopheles gambiae 的飛行活動呈現出 bimodal 的情況，一個高峰在暗期剛開始
(交尾活動期)，另一個高峰則出現在暗期結束 (取食與產卵期)。Jones and Gubbins (1977) 指出交尾後雌蟲的第一活動高峰明顯下降；Jones (1981) 與 Rowland (1989) 也有類似的結果。Jones and Gubbins (1978) 進一步發現第一活動高峰活動量的變化 與雄蚊的副腺分泌物傳送到雌蟲有關。另一方面，在家蚊的研究中也發現雄蚊的副 腺的萃取物確實會造成 Cules quinquefasciatus 與 Cx. pallens 的活動改變 (Chiba et
al, 1990, 1992; Jones and Gubbins, 1979)。
由此可知雖然雄蚊並非疾病的載體，然而由於其副腺分泌物會改變雌蟲的行為活 動，Fernandez and Klowden (1995) 指出添加青春激素可以提高雄蚊副腺蛋白質的 量，有必要對雄蚊副腺蛋白質的內分泌調控做更深入的研究，其成果可以落實在實 際的防治工作上。這個部份我們打算跟捷克科學院合作，借助他們在蚊子內分泌學 多年的研究心得與成果必定可以將雄蚊副腺蛋白質與雌蟲活動行為日週律動的改變 的關係釐清。 此外，本研究室常期針對德國蜚蠊的生殖行為與活動行為的日週律動進行一系列 的實驗，初步結果發現德國蜚蠊雌蟲交尾後的行為活動的日週律動會消失，我們稱 此現象為掩蓋效應 (masking effect)。從蚊子的例子中我們聯想到是否德國蜚蠊雄蟲 副腺蛋白質會影響雌蟲活動行為日週律動的表現？因此在本次的計劃中我們打算探 討副腺蛋白質對德國蜚蠊行為的影響，包括生殖、與活動行為的日週律動兩方面。 什麼是生殖副腺蛋白質？ 副腺是昆蟲生殖系統的一部份。雌性副腺分泌物會進入輸卵總管 (oviduct)，這 種分泌物在美洲蜚蠊 American cockroach Periplaneta Americana 與雌蟲卵鞘的形成 有關 (Koeppe et al., 1985)；膜翅目針刺類 Aculeata 的副腺已特化成毒腺 (venom glands) (Adiyodi and Adiyodi, 1975)；胎生雙翅目副腺稱特化成乳腺(milk gland)； Leopold and Degrugillier (1973) 將家蠅 Musca domestica 的雌性副腺移除後並不影 響產卵與 fecundity，但 Fertility 卻下降至平常的百分之一不到，因為精子無法進入 卵中受精。Degrugillier and Leopold (1976) 進一步指出 Musca domestica 雌蠅的副腺 分泌物可能具有改變受精孔 (micropyle，精子進入卵的通道) 結構與參與 acrosomal reaction 的功能。最近的研究在地中海果實蠅 Ceratitis capitata 的雌性副腺分泌物 中含有抗菌的蛋白質 (ceratotoxins) ，這種物質會在產卵時進入卵中。Lung et al (2001) 指出黃果蠅的雄蟲在交尾時也會傳送抗菌蛋白進入雌蟲體內，推測其功能為 保護精子。 雄蟲副腺分泌物的生化功能主要有二：第一是供給卵產生的營養來源並提供精子 以便受精，藉此提高該雄蟲的適存值。第二則是保護儲精囊 (spermatheca) 中的精 子 。雄蟲副腺分泌物的生理功能是具有潤滑的功能以加速精包的運送與排出，例如
M. sanguinipes 雄蟲副腺分泌的一種醣蛋白 LHPI (Cheeseman and Gillott, 1988;
1989)。另一個生理功能是使精子去活化 (incapacitation)，Harshman and Prout, (1994) 指出果蠅的雄蟲副腺分泌物會使雌蟲生殖道中另一隻雄蟲的精子活性被抑制，藉此
提高該雄蟲的適應值。另外 Passen and Happ (1995) 研究發現 mealworm beetle
Tenebrio molitor 雄蟲副腺分泌物中的一種 B-protein 在氨基酸序列比上跟果蠅及蛾
類的費落蒙鍵結蛋白質 (pheromone binding protein) 很相似，推測可能與費落蒙的傳 送有關。
雄蟲副腺分泌物與精子競爭的關係
研究顯示包括雙翅目 (Diptera)、鱗翅目、鞘翅目 (Coleoptera)、直翅目 (Orthoptera) 的昆蟲在交尾過程中傳遞的雄蟲副腺分泌物會明顯地改變雌蟲的行為，Gillott and Friedel (1977) 將其分為提高雌蟲生殖力 (fecundity enhancing substances, FES) 與抑 制雌蟲交尾 (receptivity-inhibiting substances, RIS) 兩類，提高雌蟲生殖力的物質會 加快雌蟲排卵與產卵的速度，而抑制雌蟲交尾物質則是降低雌蟲再交尾的意願，兩 者都是減少該雄蟲與另一雄蟲的精子競爭 (sperm competition) 壓力，藉以確保雌蟲 所產的卵都可以被自身的精子受精。在蚊子的研究中發現雌蚊交尾後行為會產生改 變，交尾前常出現在雄蚊出沒的地方，交尾後則傾向尋找食物與產卵的地點。
Lefevre and Jonsson (1962) 發現黃果蠅的雄性副腺分泌物對雄蟲的精子取代 (sperm displacement) 能力的表現 (即與該雄蟲交尾的雌蟲之前曾與其它雄蟲交尾 時，該雄蟲之精子的競爭力) 是必需的 。然而 Gilchrist and Partridge (2000) 比較無 法產生精子之雄蟲 (即該雄蟲交尾時只傳遞副腺分泌物到雌蟲體內) 與正常雄蟲的 精子取代 (sperm displacement) 的能力時 (即與該雄蟲交尾的雌蟲之前曾與其它雄 蟲交尾時，該雄蟲之精子的競爭力) ，發現無法產生精子之雄蟲的精子取代力較差， 顯示精子的存在對雄蟲的精子取代力有一定的影響力。到目前為止雄性副腺分泌物 對交尾時傳遞精包的昆蟲在精子傳遞上扮演何種角色仍不清楚，而在果蠅的研究中 顯示雄性副腺分泌物會提高雌蟲的產卵率及降低雌蟲的性接受度 (receptivity)
(Herndon and Wolfner, 1995)。其它昆蟲的研究指出雄性副腺分泌物可能具有抑制雌 蟲性慾 (antiaphrodisiac) 的功用 (Mann, 1984)。在鱗翅
目 的 研 究 中 則 發 現 雌 蟲 的 交 尾 囊 (bursa copulatrix) 上 帶 有 張 力 受 器 (stretch receptors) ，該張力受器在雌蟲交尾時，當精包通過會傳遞訊號抑制雌蟲費洛蒙 (pheromone) 的產生 (Giebultowicz et al., 1991)，他們推測藉此可以避免雌蟲再產生 費 洛 蒙 去 吸 引 其 它 雄 蟲 前 來 交 尾 ；Kingan et al (1993) 指 出 corn earworm
Helicoverpa zea 交尾雌蟲停止合成費洛蒙，可能與雄蛾的副腺分泌物有關。
副腺蛋白質合成的調控因子
Herndon et al. (1997) 指出交尾時只有當雄蟲副腺分泌物被傳送到雌蟲時，該交 尾雄蟲才會再合成副腺蛋白質，而以青春激素或蛻皮激素處理也可刺激副腺蛋白質 的合成。
Wigglesworth (1936) 指出雄蟲副腺活性的內分泌受咽喉側腺 (corpora allata, CA) 調控，進而推測青春激素 (Juvenile hormone, JH) 會影響雄蟲副腺的發育。然而早期 的研究有兩個問題，一是將雄蟲的咽喉側腺切除後，再加以青春激素處理，這並不
能證明青春激素直接作用在雄蟲副腺。其次是蟲體的重量、不同蛋白質含量的變異、 以及放射性標定的使用，青春激素到底作用在雄蟲副腺分泌物的那個成分上很難確 定。利用體外 (in vitro) 培養雄蟲副腺的技術發現雄蟲副腺中特定蛋白質的產生受青 春激素調控 (Gillott and Venkatesh, 1985; Gillot and Gaines, 1992; Ismail and Gillott, 1995) 。
有些研究則指出蛻皮激素 (20-hydroxyecdysone 也會影響雄蟲副腺的活性， Koolman et al (1979) 首先在 blowfly Calliphora vicina 雄蟲的精巢 (testes) 上測到蛻 皮激素；Loeb et al. (1984) 也在 tobacoo budworm 雄蟲的精巢中測到蛻皮激素。其 它研究則發現雄蟲副腺可以合成蛻皮激素，例如蟋蟀 Gryllus bimaculatus (Bressel et al., 1990; Hoffmann and Wagemann, 1994; Weidner et al., 1992) 。在蝗蟲 M .
sanguinipes 的研究中發現雄蟲副腺中蛻皮激素的量以及合成速率在性成熟的不同時
期有所不同，而且剛交尾後的雄蟲比尚未交尾的雄蟲來的高。Sridevi et al (1988) 與 Ismail and Dutta-Gupta (1990) 分別指出 Spodoptera litura 及 Chilo partellus 雄成蟲中
的蛻皮激素會刺激雄蟲副腺中總蛋白質的合成，然而Gillott (1996) 發現蛻皮激素會
刺激或抑制 M . sanguinipes 雄蟲副腺中特定蛋白質的合成，高濃度有刺激作用而低
濃度卻有相反的效果。此外Gillott (1996) 也發現以青春激素處理時雄蟲副腺中特定
蛋白質的合成表現剛好相反。
雌蟲生殖狀態 (reproductive status) 與荷爾蒙量 (titers) 的關係
Hodgetts et al (1977) 發現黃果蠅 (Drosophila melanogaster)全蟲體 (whole-body) 的蛻皮激素的量在羽化後有上升的趨勢，而此趨勢與卵成熟的過程相符合 。在交尾 的過程中雄果蠅的副腺分泌物傳遞到雌蟲體內 (Chen, 1984; 1991) ，而分泌物中的 一種 sex-peptides 會刺激產卵、降低雌蟲再交尾的意願、以及刺激青春激素的生合 成 (Kubli, 1996; Moshitzky et al., 1996) 。Harshman et
al.(1999) 研究指出雌蟲交尾過後 12-24 小時之全蟲體蛻皮激素的量比剛交尾後明
顯上升，但是如果與不產生副腺蛋白質的雄蟲交尾時雌蟲之蛻皮激素的量則沒有上 升。進一步調查發現雌蟲交尾過後血液中蛻皮激素的量下降，推測可能是雄蟲副腺 蛋白質刺激卵成熟及卵黃蛋白的合成，而卵黃蛋白攝取血液中的蛻皮激素並釋入卵 黃生成期 (vitellogenesis) 中的卵細胞 (oocytes) 中。
蜚蠊的生殖狀態 (reproductive status) 與荷爾蒙量 (titers) 的關係
研究指出蜚蠊雌蟲的卵巢對於青春激素的生成有顯著且動態的影響 (Schal et al., 1997; Tobe and Stay, 1985)。例如 Rankin and Stay (1984) 發現一種胎生的蜚蠊
Diploptera punctata 成長中的卵巢會刺激咽喉側腺產生更多青春激素，但成熟的卵
巢卻出現抑制咽喉側腺活性的效應 (Rankin and Stay, 1985; Stay et al., 1980)。這種情 況也出現在另一種卵胎生的蜚蠊 Nauphoeta cinerea (Lanzrein et al., 1981) ；當這兩 種蜚蠊雌蟲的卵巢被切除時，無論該雌蟲交尾與否，其青春激素的量都顯著下降。 然而 Holbrook et al (2000) 指出德國蜚蠊處女雌蟲的卵巢被切除時，其青春激素的
表現與未切除卵巢的處女雌蟲相似，而且切除卵巢的處女雌蟲的 colleterial glands (即雌蟲的副腺)中累積了豐富的蛋白質，因為這些蛋白質的產生是由青春激素調 控，佐證了切除卵巢並不會使青春激素的量下降
蜚蠊雌蟲的卵巢會合成與累積大量的蛻皮激素 (Stay et al., 1984; and Pascual et
al. 1992) ，而卵巢中的濾泡細胞是蛻皮激素合成的位置 (Zhu and Lanzrein, 1984) 。
德國蜚蠊為卵胎生，其 gonadotrophic cycle 主要由青春激素調控 (Gadot et al., 1989)，其特殊處是雌蟲無論交尾與否其青春激素都表現出週期性的變化，也都有卵 細 胞 成 熟 與 產 出 卵 鞘 的 現 象 。 Pascual et al (1992) 指 出 德 國 蜚 蠊 雌 蟲 在 gonadotrophic cycle 期間卵巢中的蛻皮激素的量會有變動。
德 國 蜚 蠊 雌 蟲 青 春 激 素 的 產 生 受 交 尾 、 高 品 質 飲 食 、 社 會 互 動 (social interaction) 、與成長中的卵巢等因素而增加 (Schal et al., 1997)。以青春激素類似物 處理提高雌蟲體內青春激素的量，進而促使雌蟲加速取食，可使雌蟲吃進帶有殺蟲 劑的毒餌。Piulachs et al (1992) 認為青春激素在雄性副腺成熟的內分泌調控上扮演 重要的角色。Lluísaet al.(1996) 指出德國蜚蠊的青春激素會刺激副腺蛋白的分泌與 累積，而這些物質與精包的形成有關。德國蟑螂之生殖副腺在形態上，則包含有射 精囊（ejaculatory pouch）、射精管(ejaculatory duct)、uricose gland、蕈狀體之小囊 （utricles of the mushroom-shape body）和球狀腺（conglobate gland）。其中蕈狀體之 小囊是由12 種不同型態之小管所組成(Feliubadalό et al., 1996)。而這 12 種小管可藉
由其外部型態、在浸泡Ring’s solution 後所呈現出之透明感、及其分泌物在被亞甲基
藍（methylene blue）染色後之狀態，來加以區分。
德國蜚蠊活動行為的日週律動 (locomotor circadian rhythm) 的表現：
德國蜚蠊 [Blattella germanica (L.)] 的活動行為依照各個齡期、性別和 生殖狀況而不同 (Lin and Lee, 1996)。在固定溫度並固定光週期的環境下，雄 性 的 成 蟲 會 表 現 出 日 週 律 動 的 活 動 行 為 (Sommer, 1975)， 但 雌 性 成 蟲 則 不 然。在 28 ℃，光週期 (LD cycles) 24 小時 (16 小時亮 8 小時暗，16L:8D)
的情況下，雄性德國蜚蠊成蟲表達週期為 24 小時的週期性活動行為；然後
將 這 些 雄 性 成 蟲 移 至 缺 乏 環 境 時 間 訊 息 的 全 暗 環 境 下 [28 , DD (constant ℃ darkness)]， 這 些 雄 性 成 蟲 會 表 現 出 週 期 略 短 於 24 小 時 的 自 由 律 動 (約 為 23.6 小時) (Lin and Lee, 1996)。 相對地，在同樣的環境下，德國蜚蠊雌性成 蟲的活動行為和雄性成蟲完全不同：處女成蟲不表現日週律動的活動行為， 日活動量呈現與生殖週期相配合的週期性 (Lin and Lee, 1996)。然而，經過切 除卵巢手術之後，雌蟲便可表現出與雄蟲完全相同的活動模式：在亮暗週期 (LD) 下表現出 24 小時週期的日週律動，在全暗 (DD) 環境下表現出自由 律動，日週期長度與雄蟲的沒有顯著差異，活動高峰也與雄蟲相同。由此可 知，雌蟲的活動行為仍然受到節律器的控制，但卵巢會對日週律動活動行為 產生掩蓋效應 (masking effect) (Lin and Lee, 1996)。
綜合來說，本計劃的目的是研究德國蜚蠊生殖副腺對雌蟲生殖表現與行為活 動日週律動的關係。
三、 結果討論
德國蜚蠊雄成蟲精巢與生殖副腺之形態：
德國蜚蠊雄成蟲的生殖系統包括Testis（T）、Seminal vesicles (SV)、及副腺三 大部分，副腺分為Uricose glands（UG）；Utricles（U）及 Conglobate gland（C）三
部分（圖一）。在形態上，雄成蟲的UG 為具有五個分支的管狀構造，末端匯集成同 一開口與Ejaculatory pouch（EP）相連，內含有白色不透明分泌物（圖二）。U 為透 明管狀構造，開口位於 EP（圖一），根據文獻指出根據其形狀、管徑大小及長度可 分為12 種（Feliubadalo, et al., 1996）。CG 則為一長管折疊成球狀構造（圖三），開 口於Ejaculatory duct。於形態觀察上發現，雄成蟲羽化後副腺（UG、U、CG）會隨 日齡增加而增大，約至第7 天其副腺組織達到最終大小。羽化第 0 天 SV 不易觀察 且呈半透明狀，至第2∼3 天之後 SV 之大小已達原來之三倍，其顏色呈現銀白色不 透明狀；羽化第0 天 UG 呈透明管狀，內部沒有任何白色分泌物，第 1∼3 天其分泌 細胞開始製造白色分泌物填充於管內，至第 5 天其管內以充滿白色分泌物並於 7∼ 10 天可達到最高量；U 及 CG 之大小則隨日齡逐漸增大，至第 7∼10 天可達到最終 大小。 德國蜚蠊雄成蟲精巢與生殖副腺之蛋白質分析：
蛋白質分析發現雄成蟲除Testis 外，UG；U；CG；EP 及 Seminal vesicles（SV）
內的分泌物隨日齡逐漸累積增多，約至第 5 日齡時達到最高量。UG 有一條主要的 band，其大小約為 40KD，第 0 天含量極低，第 1 天∼第 5 天逐漸累積到達最高量 （圖四 A）。U 有四條主要的 bands，其大小約為 60KD、21KD、20 KD 及 19 KD， 第0 天∼第 2 天累積量極低，第 3 天後累積量明顯增加。第 5 天可累積到達最高量 （圖四 B）。EP 含有兩條主要的 bands，其大小均小於 15KD，第 0 天不含此分泌物， 第1 天∼第 5 天逐漸累積到達最高量（圖四 C）。CG 含有六條主要的 bands，60、 40、19、15、13、6KD，第 0 天不含此分泌物，第 1 天∼第 2 天逐漸累積，第 3 天 後累積量明顯增加，到第7 天達最高量（圖四 D）。Testis 內所含有的蛋白質並無累 積現象（圖四 E）；SV 第 1 天沒有任何蛋白質存在，雖然第 2 天∼第 10 天可見蛋 白質累積，但因其含量過少而無法比較其與日齡之關係（圖四 F）。 由德國蜚蠊雄成蟲精巢與生殖副腺之蛋白質分析可知，在第5 天即可累積足夠 的蛋白質分泌物於各腺體內，但就形態上而言，約至第7 天∼第 10 天可發育至最終 大小。根據初步的交尾試驗可知，少數第2 天∼第 3 天的雄成蟲可與雌蟲成功交尾， 但交尾率遠低於第10 天以後的雄成蟲（確定性成熟之雄成蟲），關於其副腺內所含 有的副腺蛋白量與成功交尾之關係仍待探討。 德國蜚蠊雌成蟲卵巢與生殖副腺之形態及蛋白質分析： 德國蜚蠊雌蟲有一對卵巢，左右對稱，於羽化後第6 天發育成熟；其生殖副腺 位於卵巢下方，其發育速度與卵巢之發育相同，羽化第0 天時其為透明管狀不含白 色蛋白分泌物，第1 天∼第 6 天管內逐漸累積白色蛋白質分泌物。當卵鞘形成後， 卵巢因排除成熟卵而變小，副腺內的蛋白可能用於製造卵鞘而減少，所以此時副腺
再度呈透明管狀。以甲基藍染色後觀察其副腺形態，其呈樹枝狀，並以二岔分支的 方式生長，共有32 個分支（圖五）。 雌蟲副腺蛋白的分析並無見主要的蛋白質bands，以 SDS-PAGE 無法觀察總蛋 白質含量與日齡之關係。關於雌蟲副腺蛋白的研究可能必須改用光度計來計算蛋白 質的含量，以便進一步研究雌蟲副腺蛋白與其生殖或生物時鐘之關係。 分析比較雄成蟲之 Testis、SV、ARG（UG＋U＋EP）、UG、U、CG 及雌蟲 Spermatheca 的蛋白質發現，雄蟲主要的副腺蛋白質會經由交尾傳送到雌蟲的 Spermatheca（圖六），也許這些副腺蛋白有影響雌蟲的活動、再交尾率、壽命以及 抑制交尾的功能。 德國蜚蠊雄成蟲 Acp70A-like protein 之研究： 選取數種於 Drosophila melanogaster 已知的副腺蛋白來比對德國蜚蠊睪丸或生 殖副腺中是否含有相似之物質。結果發現德國蜚蠊及雙紋姬蜚蠊的睪丸中可以偵測 到類似 Acp70A 之蛋白質。由圖七可見德國蜚蠊、雙紋姬蜚蠊、熱帶家蚊、D.
melanogaster、及 D. virihis 副腺蛋白質分析的比較，由 total protein 的可知德國蜚蠊
及雙紋姬蜚蠊之睪丸和副腺可能含有相同的蛋白質分佈。與三種 Drosophila 屬的果 蠅相比較相距勝遠。熱帶家蚊可能抽取量過低而無法看到蛋白質分佈。
利用Western blotting 的方法分析 Acp70A-like protein 的結果顯示，德國蜚蠊、
雙紋姬蜚蠊在約 50KD 處可偵測到類似 Acp70A 之蛋白質，故稱其為 Acp70A-like
protein。D. nasuta 在約 45KD 處可偵測到兩種大小之 Acp70A-like protein，且其偵測 訊號較德國蜚蠊、雙紋姬蜚蠊強，可能是因為蜚蠊與 D. melanogaster 親源較遠，所 以蛋白質的相似度極低造成抗體辨識能力降低（圖八）。D. melanogaster 之 Acp70A 為Sex-peptide，大小約 4KD，其功能在於抑制以交尾雌蟲的交尾接受度和促進以交 尾雌蟲的產卵速率。結果中並無看到 D. melanogaster 之 Acp70A 是因為 4KD 太小已 跑出膠體。其大小與本實驗發現之Acp70A-like protein 之大小相差很多，須待序列 鑑定後經比對使可知到期是否與 Acp70A 為相同之蛋白質。進而設計實驗分析其功 能，以瞭解其對德國蜚蠊、雙紋姬蜚蠊雌蟲之影響。
經由Western blotting 的確定後，利用 Whole mount 偵測其分佈的位置，利用
D. melanogaster 作為對照，可以明顯得知 Acp70A 分佈於 D. melanogaster 副腺之分
泌細胞內，而德國蜚蠊詞分佈於睪丸中，圖九的實驗組組與對照組比較可知，其睪 丸中可利用來自 D. melanogaster 之 Acp70A 抗體偵測到 Acp70A-like protein 之存在。
圖二、德國蜚蠊雄成蟲 之 Seminal vesicles (SV)及已 達 性 成 熟 之 Uricose glands （UG），其管內部 已出滿白色不透 明之分泌物。 UG SV U 圖三、德國蜚蠊雄成蟲之已 達 性 成 熟 之 Conglobate gland （C）。 SV EP U UG 圖一、德國蜚蠊雄成蟲 之 Seminal vesicles (SV)、及 副 腺 ， 副 腺 分 為 Uricose glands （ UG ）； Utricles （U）及 Conglobate gland（C）。
M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂UG 70 40 30 60 15 20 M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂UG M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂UG 70 40 30 60 15 20 M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day)♂U M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day)♂U M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂EP M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂EP M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂CG M 0 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂CG 25 47 19 M 0 1 2 3 4 5 7 10 M (day) ♂Testis M 0 1 2 3 4 5 7 10 M (day) ♂Testis M 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂SV M 1 2 3 4 5 7 10 (day) ♂SV （A） （B） （C） （D） （E） （F） 圖四、德國蜚蠊雄成蟲 UG、U、EP、CG、Testis 與 SV 之蛋白質分析。
Spermatheca 圖五、德國蜚蠊雄成蟲之卵巢、Spermatheca 及副腺。 ARG ARG 76 47 37 25 19 126 188 76 47 37 25 19 126 188 圖六、德國蜚蠊雄成蟲之 Testis、 SV、副腺及雌蟲 Spermatheca 之比較，。 1. ARG（UG＋U＋EP） 2. UG 3. U 4. CG 5. 1♂ Testis 6. 2 SV 7. Spermatheca
B. germanica + -4X 4X 10X 10X 10X 圖九、利用whole mount 標 定德國蜚蠊Testis 之 Acp70A-like protein。 25 37 47 76 188 126 19 Ger ma nica 8D A RG Ger ma nica 8D A RG Ger man ica 15D Tes tis Ger man ica 15D AR G bis igna ta AR G bisi gnat aTe stis Mos quito es A RG Mos quito es A RG Mel ano ga ster AR G+T estis Na suta AR G+T estis viri his AR G+T e 25 37 47 76 188 126 19 25 25 37 37 47 47 76 76 188 188 126 126 19 19 Ger ma nica 8D A RG Ger ma nica 8D A RG Ger man ica 15D Tes tis Ger man ica 15D AR G bis igna ta AR G bisi gnat aTe stis Mos quito es A RG Mos quito es A RG Mel ano ga ster AR G+T estis Na suta AR G+T estis viri his AR G+T e 圖 七 、 德 國 蜚 蠊 雄 成 蟲、熱帶家蚊腺及 三種 Drosophila 屬 果蠅之副腺比較。 Germ anica 8D A RG Germ anica 8D A RG Germ anic a15 D AR G Ger mani ca15 D Te stis bisig nata ARG bisig nata Testi s Mos quito es A RG Mos quito es A RG Mel anog aste rAR G+Te stis Nas uta ARG +Tes tis viri his ARG+ Testi s 47 47 126 188 76 47 76 Ge rman ica8D ARG Germ anica 8D A RG Germ anic a15 D AR G Ger mani ca15 D Te stis bisig nata ARG bisig nata Testi s Mos quito es A RG Mos quito es A RG Mel anog aste rAR G+Te stis Nas uta ARG +Tes tis viri his ARG+ Testi s 47 47 47 47 126 188 76 47 126 126 188 188 76 76 47 47 76 76 ?? (KD) 圖八、德國蜚蠊、雙紋姬蜚蠊雄 成 蟲 、 熱 帶 家 蚊 腺 及 三 種 Drosophila 屬果蠅之 Acp70A Western Blotting 結果。 ＊1o antibody: Acp70A (1:800) (From Swissland)
＊Acp70A antibody was made from Drosophila melanogaster.
四、 計畫成果自評 經過第一年對於德國蜚蠊副腺蛋白質的初步研究，已確定德國蜚蠊雄成蟲 及雌成蟲的生殖副腺的位置及構造，並可細分雄成副腺的各部構造。花費一年的 時間完成第一階段的實驗，以及收集累積足夠的基礎資料以作為進一步的實驗基 礎。進而瞭解德國蜚蠊雄成蟲之副腺蛋白是否對交尾後之雌蟲活動、再交尾率、 交尾意願等造成影響。 五、 參考文獻
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