中醫藥對肝再生能力之影響(I)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

中醫藥對肝再生能力之影響(1/3)

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2320-B-039-036- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥學院學士後中醫系 計畫主持人： 蔡金川 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢 中 華 民 國 92 年 6 月 2 日

中醫藥對肝再生能力之影響 (一)部分肝切除模式之建立 一.實驗材料

1.1 實驗動物

動物品系：Wistar 品系雄性大白鼠（Wistar Albino Rats） 動物來源：國科會實驗動物中心

動物週齡：4~6 週，體重約在 180~220 克間。

飼養方式：空調房間，溫度維持在 22±5℃，半日照環境，一隻一籠 分籠飼養，自由飲水及餵養標準飼料。

1.2 實驗試劑

total protein, albumin, globulin, bilirubin, GOT, GPT, γ-GT, ALP, total bile acid

(Roche diagnostic system, Inc. Branchburg, New Jersey, USA.) 5-bromo-2’-deoxy-uridine(Sigma,St,Louis,MO)

1.3 實驗器材

a.高速冷凍離心機（BACKMAN GS-6R, USA）

b.全自動生化分析儀（COBAS mira plus, Roche, New Jersey, USA） c.真空減壓濃縮機（EYELAN-1, Tokyo Rikakikai Co, LTD, Japan） d.冷凍乾燥機（Dura-Top MP, Microprocessor control bulk tra Y Dryer, FTS system）

1.4 管制藥品登記證

實驗動物於肝切除手術前以麻醉管制藥品 Sodium pentobarbital 麻醉 處理，並依規定申請管制藥品登記證；管證字號 HRR091000001 號。

二、實驗步驟

2.1 手術前不給予任何藥劑，正常供水及飲食，禁食 18hrs 後，進行 部分肝切除手術，切除 70％的肝臟組織。

2.2 所有組別在術後之第 6、12、24、36、72 及 168 小時犧牲動物（5~9

隻）。由頸動脈採血，取血清以檢測生化值（total protein, albumin,

globulin, bilirubin, GOT, GPT, γ-GT, ALP, total bile acid）。

2.3 解剖取下剩餘的肝臟，秤量肝重以計算肝重的改變率(再生肝重量 /原本起始肝重量)

2.4 採下的肝組織再分成兩部分，一部分急速以液態氮冰凍並保存於 -80℃中，此將進一步比較分析關於肝臟再生之特殊基因表現情形(包 含有 HGF, c-met, TGF-α, c-fos, cyclin D1, cyclin A; p53, prohibitin, TGF-β1 等)，以及進行肝組織自由基含量測定(glutathione, GSH)及抗 自由基酵素(GPx, GR)活性分析。

2.5 另一部分肝組織則以 10％福馬林固定以即將進行免疫組織化學染 色分析。(immunohistochemical assay)。

2.6 於動物犧牲前半小時由腹腔注入 20mg/kg 的

5-Bromo-2-deoxyuridine solution(BrdU)，由酵素抗體法以 DAB 染色觀 察 S phase 的細胞核比例(labeling index)以評估肝組織 DNA 合成的情 形。

三、實驗方法

3.1 GSH peroxidase

GSH peroxidase 活性分析是採用 Lawerence and Burk(1976)之方法。 取 25μl¤夾 x 組織均質液與 925μl 之反應液（含有 1mM EDTA、1mM NaN3、1U/ml GSH-Rd 及 1mM GSH 和 100mM potassium phosphate， pH7.4）混合，再加入 25μl，6mM β-NADPH(溶於 0.5％之 NaHCO3 中)，最後再加入 25μl，10mM H2O2起始反應，於 37℃下測定 A340nm 三分鐘內之變化情形，以β-NADPH 之下降量換算酵素活性。 （E340=6.22×10 3 M-1cm-1）。 3.2 NPSH 的測定 NPSH 的測定步驟為：取 0.2ml 組織均質液，加入 0.8ml 之 0.5％ TCA 冰欲 5 分鐘，再以 10,000g 離心 3 分鐘後，取 0.3ml 之上清液加入 0.7ml 之 Tris/EDTA 溶液(pH8.9)，均勻混合後再加入 20μl 之 10mM DTNB(in MrOH)混合均勻後置於室溫下反應 5 分鐘，並偶加以搖晃， 最後測定分光光度計 412nm 之吸光值。另需作一組以 0.3ml 之 5%TCA 溶液代替上清液者為空白組。 3.3 蛋白質含量的測定：

利用 Bio-Rad Protein Assay kits 分析。Coomassie Brilliant blue 試劑會 與蛋白質結合產生藍色反應，再以分光光度計測定 590nm 之吸光值， 並以 BSA（bovine serum albumin）作為標準品。

3.4 BrdU stain：

切片 deparaffinization and rehydration → trypsin 處理後與

formamide/trisodium citrate 70℃ incubation 45 mins → rinse with PBS → 5﹪BSA 25 mins→ 切片 incubated with 3﹪hydrogen peroxide for 5 mins → rinse with PBS → 切片 incubated with anti-BrdU 1hr → rinse with PBS → incubation with biotinylated anti-mouse antiserum 20 mins → rinse with PBS →incubation avidin

dehydrogenase-biotinylated horseradish peroxidase complex 20 mins → rinse with PBS → incubation with DAB 5 mins → rinse with distilled water → hematoxylin 2 mins → rinse with distilled water 10 mins → dehydration → mounting → Mitotic Indicer.

3.5 PCNA stain：

切片 deparaffinization and rehydration → trypsin 處理後與

formamide/trisodium citrate 70℃ incubation 45 mins → rinse with PBS → 5﹪BSA 25 mins→ 切片 incubated with 3﹪hydrogen peroxide for 5

mins → rinse with PBS → 切片 incubated with anti-PCNA 1hr → rinse with PBS → incubation with biotinylated anti-mouse antiserum 20 mins → rinse with PBS →incubation avidin

dehydrogenase-biotinylated horseradish peroxidase complex 20 mins → rinse with PBS → incubation with DAB 5 mins → rinse with distilled water → hematoxylin 2 mins → rinse with distilled water 10 mins → dehydration → mounting → PCNA Labeling

3.6 Hematoxylin ＆Eosin stain：

1. 融解臘：（xylene: 3min, 3 times  100% alcohol: 3 min, 3 times

95% alcohol: 3 min, 2 times  70% alcohol: 3min. 2times）。

2. Haematoxylin 染色（細胞核）：3 min。

3. 水洗：10 min。

4. Eosin 染色（細胞質）：1 min。

5. 70% alcohol: 3 sec, 1 time  95% alcohol: 3 sea, 2 times  100% alcohol: 3 sed, 2 times  xylene: 3 sec, 3 times。 6. 蓋片、陰乾，並以顯微鏡觀察。

3.7 水抽出物之製備（鑑定後的中藥材包括：高氏柴胡；丁豎杇；

丹參；黨參）

減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液進行冷凍乾燥得乾燥粉末，秤重，計算 產濾（yield）。 『中藥材』 加 H2O，soaked for 30' 加 H2O，boiling for 1hr 過濾 ┌────────────┐   濾液 殘渣  加 H2O，boiling for 1hr  過濾  ┌────┐  濾液 殘渣（棄之）   濾液合併，減壓濃縮，冷凍乾燥， 得乾燥粉末，以備實驗使用 （產率：丁豎杇 11.84%；丹參 16.95％；黨參 21.34％；高氏柴胡 23.24％） 3.8 肝均質液之製備 肝臟秤重，以九倍的 0.02M EDTA 溶液磨碎即為均質液。

3.9 統計學的分析

在本研究中，實驗數值以平均值 ±標準誤差（mean ±S.E.M.）表示。 實驗組與正常組間活性差異的比較，是採用 Student’s t-test。P 值小於 0.05，達統計學差異。

四、結果 A 組(7 天) rat weight liver weight postoperati ve 2/3 hepatectom y Estimated liver weight Estimated remnant liver weight Liver regeneratio n index(%) 1 200 11.168 4.820 9 4.18 144.979 2 210 11.110 5.743 9.45 3.71 128.905 3 220 11.479 5.512 9.9 4.39 128.647 4 230 10.520 6.515 10.35 3.84 102.609 *5 225 6.474 10.125 3.65 6 205 9.600 5.020 9.225 4.21 107.470 7 210 10.710 5.283 9.45 4.17 123.850 8 235 9.976 5.894 10.575 4.68 89.837 9 210 11.120 6.453 9.45 3.00 125.879 10 215 11.076 5.893 9.675 3.78 123.774 119.550 B 組(3 天) 1 250 8.944 7.846 11.25 3.40 70.609 2 200 11.120 7.087 9 1.91 129.914 3 240 8.820 6.916 10.8 3.88 71.371 4 240 7.743 7.536 10.8 3.26 59.435 5 250 9.028 8.770 11.25 2.48 74.664 6 255 10.894 8.358 11.475 3.12 93.049 7 220 6.940 7.358 9.9 2.54 59.772 8 220 6.318 7.430 9.9 2.47 51.790 76.325 C 組(1 天) 1 260 4.843 7.051 11.7 4.65 2.751 2 240 5.189 6.800 10.8 4.00 17.485 *3 265 6.625 11.925 5.30 4 265 5.515 7.460 11.925 4.47 14.075 5 255 5.807 6.400 11.475 5.08 11.438

6 270 5.203 7.500 12.15 4.65 7.373 10.625 D 組(6 小 時) 1 255 4.418 5.627 11.475 5.85 -25.413 2 270 4.235 6.564 12.15 5.59 -20.582 3 240 3.651 7.375 10.8 3.43 3.064 *4 220 6.625 5 230 3.320 6.153 10.35 4.20 -14.253 6 205 2.768 4.648 9.225 4.58 -38.920 -19.221 E 組(sham) 1 225 7.571 10.125 10.13 【* 手術後沒有存活】 1. 大鼠肝臟再生率* 肝再生率 -19.221 10.625 76.325 119.55 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 6 24 72 168 時間(hour) 再生率( % ) *肝再生率的計算公式：屍檢時的肝重量-手術時預計的殘肝重量 ×100% 切除的肝重量

2. 肝功能生化指數

GOT(u/l) GPT(u/l) ALP(u/l) α-GT(u/l)

Normal 104.0 ±4.45 48.5 ±2.72 272.8 ±20.91 45.5 ±8.95 6 hours 433.1 ±34.09 267.1 ±63.79 326.6 ±38.80 5.9 ±0.86 24 hours 339.5 ±57.90 249.7 ±37.87 664.1 ±96.31 5.4 ±1.30 72 hours 200.3 ±13.36 90.6 ±4.56 553.0 ±26.29 6.2 ±0.74 168 hours 209.2 ±6.59 88.5 ±3.17 374.9 ±39.30 7.0 ±1.03 Albumin(g/dl) Total-bilirbin (mg/dl) Totel Protei（g/dl） Normal 3.45 ±0.111 0.15 ±0.022 6.34 ±0.090 6 hours 3.38 ±0.131 0.46 ±0.060 6.50 ±0.210 24 hours 3.56 ±0.075 0.35 ±0.050 6.46 ±0.225 72 hours 3.58 ±0.083 0.27 ±0.024 6.34 ±0.130 168 hours 3.89 ±0.073 0.22 ±0.015 6.24 ±0.089 GOT 變化圖 104 433.1 339.5 200.3 209.2 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Normal 6 24 72 168 時間(hr) G OT

GPT

48.5 88.5 90.6 249.7 267.1 0 50 100 150 200 250 300

Normal 168 hours 72 hours 24 hours 6 hours

濃度

ALP 變化圖 272.8 326.6 664.1 553 374.9 0 100 200 300 400 500 600 700 Normal 6 24 72 168 時間(hr) A L P α-GT 變化圖 45.5 5.9 5.4 6.2 7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Normal 6 24 72 168 時間(hr) α-G T

Albumin變化圖 3.45 3.38 3.56 3.58 3.89 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 Normal 6 24 72 168 時間(hr) Al bu mi n Total-bilirubin 變化圖 0.15 0.46 0.35 0.27 0.22 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 Normal 6 24 72 168 時間(hr) Tot al bil iru bin Total protein變化圖 6.34 6.5 6.46 6.34 6.24 6.1 6.15 6.2 6.25 6.3 6.35 6.4 6.45 6.5 6.55 Normal 6 24 72 168 時間(hr) T ota l p ro te in

4.NPSH 、GSH-Px c NPSH (μmole/g) GSH-Px (μmole/min/mg protein) 168 hours 4.42 ±0.204 1.58×10-4 ± 5.855×10-6 72 hours 5.66 ±0.417 1.64×10-4 ±1.083×10-5 24 hours 6.96 ±0.404 1.92×10-4 ±2.442×10-5 6 hours 3.34 ±0.446 1.71×10-4 ±8.893×10-5 NPSH (μmole/g) 3.34 6.96 5.66 4.42 0 1 2 3 4 5 6 7 8

6 hours 24 hours時間72 hours 168 hours

濃度 GSH-Px (μmole/min/mg protein) 1.71 1.92 _1.64 1.58 0 0.5 1 1.5 2 2.5

6 hours 24 hours_時間72 hours 168 hours

活性（×1

5.病理組織染色

未進行肝切除（對照組）肝臟組織切片

A1. H&E stain (50×) A2.H&E stain (100×)

部分肝切除 6 小時候肝臟組織切片

B1. H&E stain (50×) B2.H&E stain (100×)

部分肝切除 24 小時肝臟組織切片

部分肝切除 72 小時後肝臟組織切片

D1. H&E stain (50×) D2.H&E stain (100×)

部分肝切除 168 小時後肝臟組織切片

E1. H&E stain (50×) E2.H&E stain (100×)

F1. Calibration Bar＝100μ （50×）

F2. Calibration Bar＝100μ （100×）