Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4173

台北醫學大學醫學檢驗生物技術學系

暨研究所碩士論文

Taipei Medical University School of

Medical Technology and Biotechnology

Master Thesis

指導教授： 何元順 博士 (Yuan-Soon Ho， Ph. D.)

肝癌細胞

Lysyl oxidase 表現與致癌作用機制之探討

Studies on the expression of lysyl oxidase in hepatocellular

carcinoma cells and carcinogenesis

研究生:莊千慧(Chien-Hui Chuang)

中華民國九十六年六月

致謝 在碩士生涯這二年來，最感謝的人就是我的指導教授何元順老 師，我是一名在職班的學生，白天上班晚上做實驗，何老師並不因此 而對我的教學與研究上有任何保留，反而不斷的激發我的研究精神， 讓我學到的技術不亞於一般的研究生。 在這二年的研究生涯中，一直支持著我走完這二年人是我的母 親黃麗琴女士、妹妹莊雅嵐與我的男朋友蕭睿章，因為我是在職班的 學生，每次只有下班時間到實驗室做實驗，幾乎每晚都做凌晨才回家。 我的母親都擔心我的安危，每晚都會等我回家後才睡覺。而每次為了 能多些時間做實驗，都會跟同事要七點班來上，妹妹雅嵐就是我最好 的鬧鐘，每天早上都是她叫我起床，讓我免於遲到的問題，而我的男 友為了我的學業犧牲假日的時間，來實驗室陪我做實驗，或是選擇假 日值班多賺點值班費當結婚基金。 在醫院做臨床的我完全沒有做過基礎實驗經驗，照君與雅捷他 們不吝嗇的傾囊相授，讓我了解實驗方法與觀念，也讓我了解實驗如 何進行，當然也謝謝魏柏立醫師，讓我知道肝癌在臨床給予的治療 也謝謝實驗室的利菁學姊、嘉華、易儒、自君、琮佑、志強，他們的 陪伴讓我這二年在實驗室的日子度過實驗失敗的傷心與實驗成功的 喜悅。

最後要感謝我的同事們，在我需要的換班時給我支持，謝謝他 們的幫忙。

千慧 謹致於

台北醫學大學 生物醫學技術研究所 民國九十六年七月十三日

中文摘要 論文名稱：肝癌細胞Lysyl oxidas 表現與致癌作用機制之探討 研究所名稱：台北醫學大學醫事技術系暨研究所 研究生姓名：莊千慧 畢業時間：九十六學年度 第二學期 指導老師：何元順 博士 （台北醫學大學 醫學院 醫學檢驗生物技術學系暨研究所教授） 肝癌是全世界排名第五名的惡性腫瘤，而酒精性肝炎與 B 型肝炎 病毒是造成肝癌的主要原因。B 型肝炎病毒經由垂直感染造成新生兒 為 B 型肝炎病毒帶原者，酒精性肝炎主要是因酒精取得容易，長期 酗酒所造成，二者皆會造成肝硬化，最後演變成肝癌。Lysyl oxidase 是一種氨基氧化酶，位在細胞外基質，當組織產生慢性發炎反應之 後，組織會開始修復，這時候lysyl oxidase 產生去氧化膠原蛋白與彈 性纖維，形成 cross-linking ，使組織纖維化，漸漸形成肝硬化，慢慢 演變成肝癌。因此我們希望能找出lysyl oxidase 與肝癌的相關性，經 由本次研究結果發現，在臨床的肝癌組織切片中，免疫化學組織染色 法發現 lysyl oxidase 在肝癌細胞表現量比正常肝臟細胞表現量較

多，接下來我們利用Hep 3B cell 每天加入 10mM Ethanol 培養，lysyl oxidase 隨著長期酒精培養的代數的增加表現量就越高，接著合併使

用天然的抗氧化物蓝莓的萃取物與薑黃萃取物，合併使用這二個抗氧

化物會抑制 lysyl oxidase 活化型蛋白。本次研究結果建議，lysyl

oxidase 的表現的確與惡性肝腫瘤相關，經由體外實驗發現 lysyl oxidase 會因長期使用酒精而增加，目前也找到天然的抗氧化物藍莓

萃取物與咖哩萃取物可以抑制肝癌細胞分泌活化型的lysyl oxidase，

Abstract

Title of Thesis: Studies on the expression of lysyl oxidase in hepatocellular carcinoma cells and carcinogenesis Institule : Graduate Institute of Biomedical Technology, Taipei

Medical University Author: Chien-Hui Chuang

Thesis advised by: Yuan-soon Ho,Ph.D.

(Professor, School of Medical Laboratory Science and

Biotechmology，College of Medicine, Taipei Medical University)

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers in the world with an annual incidence of more than 500000 in the year 2000.Alcohol excess is associated with a spectrum of disease ranging from simple steatosis through steatohepatitis to cirrhosis and， in some， hepatocellular carcinoma. Hepatitis B virus (HBV) infection is still the most common cause of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis world wide. Lysyl oxidase could regulated formation and repair of the extracellular matrix (ECM) by oxidizing lysine residues in elastin and collagen， thereby initiating the formation of covalent crosslinkages

which stabilize these fibrous proteins. We found and elevated expression of the lysyl oxidase (LOX) in biopsies of Hepatocellular carcinoma (HCC) as compared to normal liver tissue. And also we used nature compounds that inhibited lysyl oxidae. The result of this study suggested that lysyl oxidase maybe required for normal liver region to become cirrhotic. Our findings indicate that to inhibit LOX maybe a good therapeutic target to prevent tumor growth.

目錄

中文摘要………Ⅰ

英文摘要……….………Ⅲ

目錄………Ⅴ

圖目錄………Ⅷ

緒 論………..………1

壹、 肝癌的致病原因………..……3 貳、 肝臟纖維化過程………..……5 參、 Cirrhosis…….………..7 肆、 Lysyl oxidase………8 伍、 Lysyl oxidase 合成………9 陸、 Lysyl oxidase 活化機轉………...10 柒、 Lysyl oxidase、Cirrhosis 與肝癌相關性……….10 捌、 Pterostilbene………...………11 玖、 Curcumin、hydroxydibenzoylmethane、dibenzoylmethane、 hydroxymethyldibenzoylmethane,……….12

實驗目的………..14

實驗材料與方法………..……15

壹、 藥品試劑………..………...16 貳、 常 用 溶 液… … … 1 9 參、 實驗方法………..………22

一、冷凍切片

二、蘇木精與伊紅染色法(Hematoxylin and eosin stain) 三、Masson trichrome stain

四、免疫化學組織染色法

(Immunohistochemical staining assay) 五、細胞培養(cell culture)

六、長期加入乙醇與肝癌細胞培養:(Long-team treated ethanol in Hep 3B c3ll)

七、反轉錄聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction） 八、螢光免疫染色(Immunofluorescence assay)

九、西方墨點法 (Western blotting assay)

實驗結果……….29

壹、 Tissue microarrary 使用免疫化學組織染色法篩選 lysyl

oxidase 與肝癌的相關性

貳、 lysyl oxidase 在臨床肝癌組織切片的表現

肆、 天然抗氧化物抑制lysyl oxidase RNA 的合成 伍、 天然抗氧化物抑制lysyl oxidase 蛋白質的合成

實驗討論………..………..……37

附錄

.………71

附錄一………72 附錄二………73 附錄三………77 附錄四………78 附錄五………79 附錄六………80 附錄七………81 附錄八………82 附錄九………83

參考文獻(References)………..84

圖目錄

Figure1. TMA and lysyl oxidase protein expression………...43 Figure2. Frash hepatoma tissue for H＆E stain ……….………….49 Figure3. Frash liver tissue for masson`s trichrome stain…….………....52 Figure4. Fresh liver tissue for IHC staining assay………..…55 Figure5. Lysyl oxidase protein expressed in frash benignancy liver tumor

tissue and normal liver tissue for Immunohistochemical (IHC) staining assay………59

Figure6. Lysyl oxidase protein expressed in wild type and long term co-

treated Hep 3B cell for immunofluorescence assay...…….…..62

Figure7. Lysyl oxidase RNA expressed in different generation wild type

and long term co-treated Hep 3B cell…………..………….66

Figure8. Lysyl oxidase RNA expressed in wild type and long term co-

treated Hep 3B cell with pterostilbene、curcumin、 hydroxydibenzoylmethane、dibenzoylmethane、

hydroxymethyldibenzoylmethane………67

Figure9. Lysyl oxidase protein expressed in wild type and long term co-

緒論

(Introduction)

緒論

肝癌(hepatocellular carcinoma; HCC) 是全世界排名第五名的惡 性腫瘤，在全世界每年得到肝癌的人大約五十萬人，目前肝癌沒有有 效的治療方式，是所有癌症死亡率位居第三名(Kagan, 1994; Sun et al., 2001)。Hepatocellular carcinoma 主要流行在亞洲(Yip and Burt, 2006)， 東南亞國家與非洲，但最近發現已開發國家有大幅增加的現象。根據 行政院衛生所統計公告，依臺灣地區十大死亡原因統計資料，自民國 七十一年以來。癌症即躍居首位。民國八十一年臺灣地區共有 20,959 人死於癌症，其中肝癌對男性而言，它是所有癌症死因的第一位，而 對於女性，它也高居第二位，每年更造成四千人死亡，對國人健康造 成極大威脅。肝癌不容易診斷，從診斷確定到死亡，平均不到一年。 因此預防非常重要。台灣由於Ｂ型肝炎的流行，酗酒，所以肝癌的死 亡率很高。肝癌好發之年齡在 45～55 歲之間，正值壯年期，若靠臨 床有症狀而診斷出的肝癌，一般預後較差，平均存活率約 6～9 個月， 因此罹患肝癌之後，不論對個人、家庭、社會或國家，均造成一重大 損傷，值得個人重視與警愓。

壹、 肝癌的致病原因

HCC 主要的危險因素包括酗酒與 B 型肝炎(HBV)或 C 型肝炎 (HCV)或 cirrhosis 或是飲食中 afatoxin B1 (AFB1)(Araki et al., 2007; Cho et al., 2007)。B 型肝炎病毒在台灣是世界上有名的 B 型肝炎盛行 區，B 型肝炎帶原者約佔 15～20%；且 B 型肝炎病毒證實可崁入肝 細胞核內，可能造成細胞的變性，它的作用機轉藉由人體的免疫機轉 而導致肝細胞壞死的。人體內的免疫系統有一種細胞毒性T 細胞（淋 巴球的一種），平常並不會去攻擊體內的正常細胞，當體內的正常細 胞遭受到病菌感染時，它就會去將這已受感染的細胞殺死，其目的是 為了要除去這入侵的病菌。B 型肝炎病毒導致肝炎，就是經由這樣的 途徑。細胞毒性 T 細胞是要將 B 型肝炎病毒「驅除出境」，然而 B 型肝炎病毒是在肝細胞內，所以在細胞毒性 T 細胞欲除去 B 型肝炎 病毒的同時，肝細胞也就跟著陪葬了，而形成日後的肝癌。依據世界 衛生組織統計，全世界超過二十億人口曾被 B 型肝炎病毒感染過， 目前全世界約有三點五億人口是 B 型肝炎帶原者，其中百分之七十 為亞洲人，肝癌患者中，B 型肝炎表面抗原陽性者佔 80～90%，且其 家屬帶原率及肝癌之發生率亦比一般人高。 目前 C 型肝炎的感染也是肝癌的一項危險因子。C 型肝炎病毒

是一種 RNA 病毒，在 1989 年發現，以前稱為非 A 非 B 型肝炎 (Non-A,Non-B hepatitis)，多半由輸血引起，後來發現此病毒後，檢驗

人員在輸血前，所有血液皆事先篩檢，發生率遂大幅下降。台灣的C

型肝炎genotype 主要為 typeII(lb)約佔 70%，其次為 typeIII 及 IV，前 者預後較差。C 型肝炎的流行率，在全世界都是大約在 1-2%上下， 根據行政院衛生所的統計，在台灣地區某些縣市，如澎湖白沙，梓官， 阿蓮，馬沙溝，以及嘉義縣市人口中C 型肝炎抗體陽性率(HCV Ab+) 有些報導高達40%以上，這些高流行區的病因據推測可能是與鄉下早 年密醫較多以及盛行的打針文化所以，現在針頭皆為可拋棄式，應該 不會再有類似的密集的大規模感染。C 型肝炎患者比較不會有倦怠， 厭食的症狀，肝功能GOT(AST)/GPT(ALT) 指數不一定會升高，但並 不代表其肝臟發炎的程度較輕微。C 型肝炎抗體陽性(HCV Ab+)並不 代表病人對 C 型肝炎已經有了抵抗力，只代表病人曾經得過 C 型肝 炎，C 型肝炎的從感染到發病病程很長，之前文獻統計指出，大約在 輸血後 10 年發現有 C 型肝炎，20 年後慢慢變成肝硬化，30 年後發 生肝癌的機會就增加了，平均約30%病人會發展成肝硬化，而肝硬化 患者每年 3%產生肝癌。C 型肝炎由於是 RNA 病毒所以自身突變率 高，在複製出來後的病毒也不會跟先前的相同，使我們的免疫系統不 斷的辨認，無法一舉殲滅C 型肝炎病毒。所以大部份病人(80%)都變

成慢性肝炎。也因為同樣原因，目前還發展不出好的疫苗來預防。台 灣地區約有30 萬 C 型肝炎帶原者，肝癌患者中，高達 50～70%患者 併有C 型肝炎病毒感染。 酒精性肝臟病。對許多人, 肝臟的硬化是因為慢性酒精中毒, 但 實際上, 酒精中毒是只起因的當中一個。許多酒精肝病通常顯現出在 十年後比那些不常喝的人還多。酒精性肝臟病，是在已開發中的國家 常見的疾病，也可以說是一種文明病，酒精引起的肝損傷主因，例如 粒線體受損，氧化壓力，自由基過多，發炎反應引起的免疫細胞攻擊， 都是造成最後演變成肝癌原因之ㄧ。 貳、 肝臟纖維化過程 通常肝在急性發炎後，會啟動修補機制，經由複雜的發炎反 應與機制再修復，慢性的肝臟發炎是就如同傷口的修復，主要是不斷 進行平衡基質的再生與基質的分解。肝臟修復的過程類似創傷恢復過 程(Abou-Shady et al., 1999; Lamireau et al., 2002; Seitz and Poschl, 2000; Volk et al., 2007)。當傷害和伴隨的深度炎症反應導致細胞壞死 和細胞外基質損傷，就會發生組織修復。在這個過程中，死亡的細胞 由正常組織替換，由特定細胞的再增生，組織上面的形成顆粒狀，進 而形成傷疤(Chokshi and Marrero, 2001; Edwards and Macdonald,

2000)。當肝臟組織適度損害發生，肝臟的再生是允許它重新修復的 (Henkel et al., 2005; Poon et al., 2005; Tabor, 1997)。但是，慢性傷害讓 肝臟不能癒合，是因為高效率的基質再生和纖維變性是許多已知的慢 性肝臟病的主因(Di Sario et al., 2005; Gisbert et al., 2004; Kunz et al., 2002; Wilfredo Canchis et al., 2004; Yang et al., 2005)。各種各樣的慢性 傷害類型，由於酗酒， 病毒肝炎(特別是 HBV 與 HCV)(Baek et al., 2006; Kew, 2006; Rabe et al., 2001; Shafritz and Lieberman, 1984) 、藥 物(Peterson et al., 2004)、新陳代謝的疾病(主要由於銅過多)(Tassabehji et al., 2005)，自體免疫的疾病(Bartolozzi et al., 2007)，當肝發生損傷， 修復機制會產生，結果讓膠原蛋白、proteoglycans 與 glycoproteins 在肝臟多三到五倍的囤積。經時間的累計這樣反覆的模式，吸引大量 type I and III fibrillar collagens 沉澱在細胞外基質中，最後會有 80% Collagens type I 與 Collagens type III 在纖維化的組織中。讓分解纖 維的功能漸漸喪失，不可逆的cross-linking 就會開始產生(Belli et al., 2000; Efrati et al., 2003; Fartoux and Serfaty, 2005; Salgado et al., 2000; Sumi et al., 2003; Wu et al., 2006)。肝纖維化後會慢慢演變成慢性肝臟 失能，cirrhosis 是慢性肝臟病最後階段，最後走向肝癌(Poon et al., 2005)。

參、 Cirrhosis

Cirrhosis 是肝臟的一種慢性疾病。它意味著正常肝臟組織受損傷 而無法工作。如果損傷不被停止,肝臟逐漸丟失它的能力執行它的正 常作用。這叫做肝臟失能,也是指肝臟病的最後階段。什麼是肝臟損 壞? 就是讓結疤組織替換健康肝臟組織，許多人會將 HCC 與酗酒 (Lieber, 2000a; Seitz and Poschl, 2000)聯繫在一起,實際上, 慢性酒精 中毒是肝病的主要起美國酒精肝病通常發生在十年或更大量喝酒之 後。肝臟對於酒精這種高毒性物質是脆弱的。這些化學製品觸發最終 會毀壞肝臟細胞的。雖然酒精在肝臟造成許多影響。長期大量攝取酒 精造成肝硬化通常到最後演變成肝癌而致命。因此酒精導致肝病，大

約有17-30% 酗酒的人會有 cirrhotic。因為目前酒精消耗量激增(Brunt,

2002; Caballero et al., 2001; Fabris et al., 2004 kershenobich Stalnikowitz and Weissbrod, 2003; Lieber, 2000a; Lieber, 2004; Mendez-Sanchez et al., 2005; Moreno-Otero et al., 2006; Spahr et al., 2005; Yip and Burt, 2006)，特別影響年青人，因酗酒導致的肝病，就 是 酒 精 性 肝 病 。 造 成 在 酒 精 肝 臟 病 和 肝 癌 的 發 生 的 劇 烈 的 增 量 (Caballero et al., 2001; Kershenobich Stalnikowitz and Weissbrod, 2003; Moreno-Otero et al., 2006)酒精本身會直接或間接破壞肝細胞，導致肝 的纖維化，長久以後，甚至會變成肝硬化或併發肝癌。酒精性肝病有

三個階段，初期只是脂肪肝，再來會發展成酒精性肝炎最後可能會到 肝硬化，甚至肝癌的地步。cirrhosis 是肝纖維化的最後一個階段，也 是全世界目前針對如何減少肝癌風險的原因，cirrhosis 會導致不可逆 肝臟結疤的情況。因為傷痕組織替換正常組織，讓血液流經肝臟是受 影響的。這使它越來越難使肝臟執行根本作用，譬如解毒有害的物 質，淨化血液和製造重要營養素(Bataller and Brenner, 2005; Del Gaudio et al., 2002)。

肆、 Lysyl oxidase

Hepatocarcinogenesis 是 多 重 步 驟 造 成 的 (Cenizo et al., 2006; Marotta et al., 2004)，通常都是肝細胞內的基因突變。最近研究發現， lysyl oixdase 會去氧化細胞外基質內的蛋白，lysyl oxidase 對組織生 長、細胞增生、細胞內訊息傳遞，細胞轉移具有的影響(Erler and Giaccia, 2006)，Lysyl oxidase 是一種需銅的氨基氧化酶(Wu et al., 2006) (LOX, protein-lysine 6-oxidase, EC 1.4.3.13)，LOX 最早在 1968

年被發現，直到1980 年才被研究出，LOX 它在傷口修復時(Lucero and

Kagan, 2006; Payne et al., 2005)，在基質中會去氧化膠原蛋白與彈力纖

一開始先在小雞的軟骨，牛的肺與動脈被發現，接著在人類的胎盤、 纖維球蛋白、上皮細胞、皮膚、肺、膽道、肝、……等等都有 LOX。 LOX 的家族成員有四個 isoenzyme(Akiri et al., 2003; Cooper et al., 2000; Giampuzzi et al., 2000; Kagan, 2000; Kojima et al., 1993; Salo et al., 2006; Wu et al., 2006)，LOX-1、LOX-2、LOX-3、LOX-4，而他們

的不同在於C 端的長度，存在於不同組織中的表現也有差異。

伍、 Lysyl oxidase 合成

|Lysyl oxidase合成過程，開始在細胞核合成mRNA，送進細胞質 合成Prolysyl oxidase，而Prolysyl oxidase被運送到內質網醣化後，運 送到高基氏體加入銅離子與LTQ這二個輔酶，Prolysyl oxidase與銅離 子與LTQ結合後，再由運輸囊泡分秘到細胞外。LOX在未活化型的分 子量50KDa，(Zhang et al., 2006)，經由BMP-1( bone morphogenetic protein 1 )將 lysyl oixidase propeptidyl region切除lysyl oxidase 變成活 化型，形成30KDa活化型具有氧化能力。而lysyl oxidase氧化膠原蛋白 上的離氨酸是靠LTQ這個接觸活化位，使基質形成纖維化組織。Lysyl oxidase 在無發炎現象時，會穩定存在細胞外基質，一旦發炎反應不 斷發生，lysyl oxidase就會被大量製造出來。

陸、 Lysyl oxidase 活化機轉

Lysyl oxidase 含有銅離子與LTQ(lysyl adduct of tyrosyl quinone) 當輔酶的氨基氧化酶，銅離子扮演的角色是形成電子傳遞產生氧化作 用，LTQ為lysyl oxidase接觸位用來氧化膠原蛋白與彈力纖維上lysine. 氧化之後形成peptidyl a-aminoadipic-d-semialdehyde.。當peptidyl a-aminoadipic-d-semi aldehyde一形成就會自發性的與鄰近的 lysine或aldehydes鍵結，造成cross-linking(Kagan and Li, 2003)。

柒、 Lysyl oxidase、Cirrhosis 與肝癌相關性

Fibrosis為不能溶解的膠原纖維的廣泛的儲積累積。因此,它 應該是對這個情況的關鍵有選擇性的抑制例如：在膠原蛋白合成，也 包括由lysyl oxidases 造成的氧化的反應。抑制lysyl oxidases 的可能 會減少collagens不可逆的corss-linking(Ricard-Blum et al., 1996; Vadasz et al., 2005)。在過去十年, 幾個報告建議器官纖維變性和增加了lysyl oxidase 活性增加有關(Carter et al., 1982; Dunn et al., 1978; Konishi et al., 1985; McPhie, 1981; Risteli and Kivirikko, 1974; Shakibaei et al., 2007; Vadasz et al., 2005)。在這個模式，人的肝臟慢性纖維變性, lysyl oxidase 活性增量反射增量在LOX mRNA 的穩定 (Carrington et al., 1984; Dunn et al., 1978; Hosokawa et al., 1990; Kagan, 2000; van der

Slot et al., 2004)。在之前的研究中，從患者的肝臟與慢性肝炎人的肝 臟發現，當肝臟走到纖維化的最後一個步驟cirrhosis ， lysyl oxidase 就會出現並顯著表現較高活性。(Carrington et al., 1984; Decitre et al., 1998; Hahn et al., 1980; Inoue et al., 1991; Loverde and Strittmatter, 1968; Oie et al., 2002; Sakamoto et al., 1987; Tsuda et al., 2003; Wakasaki and Ooshima, 1990; Wu et al., 2006)。由於lysyl oxidase 活動 程度通常是微不足道的在健康人的血清中, 但顯著增加在實驗性肝 臟纖維變性, 因此它被建議, lysyl oxidase 也許擔當內部纖維變性的 指標(Akiri et al., 2003; Erler et al., 2006; Prohaska and Gybina, 2004; Siegel et al., 1978; Takahashi and Lee, 1987; Wu et al., 2006)。

捌、 Pterostilbene Pterostilbene 是藍莓的萃取物，藍莓（Blueberry）含有豐富的營 養素更是受到專家的推崇。藍莓富含強抗氧化劑(Amorati et al., 2004) ～多酚類（polyphenols）包含酚酸(phenolics acids)、單寧(tannins)、 黃酮醇（flavonols）、花青素（anthocyanins），藍莓中的花青素對於視 力維護、促進夜間視力、舒緩眼睛疲勞…等眼部健康的益處是眾所皆 知的。現在科學家還提到藍莓中含有一種稱為pterostilbene 的成份， 這是一種類似紅酒中白藜蘆醇 resveratro 的成份，最早在 1997，

pterostilbene 在動物實驗中被發現可以降低血液中高血糖的問題 (Manickam et al., 1997; Pari and Satheesh, 2006)，可以降低膽固醇、預 防動脈硬化的效果(Hougee et al., 2005)，其效果並不比藥物差，所以

藍莓也有促進心血管健康的功，而最近的研究指出pterostilbene 的成

份預防大腸癌的發生(Suh et al., 2007)，可以抑制黑色素瘤的生長 (Ferrer et al., 2005)，本實驗使用 pterostilbene 期望能抑制被酒精誘發 lysyl oxisase。 玖、 Curcumin、hydroxydibenzoylmethane、dibenzoylmethane、 hydroxymethyldibenzoylmethane Curcumin薑黃素別名又叫姜黃、黃薑、毛薑黃、寶鼎香、黃絲郁 金，多年生草本，分株繁殖。根狀莖粗短，圓柱狀，分枝塊狀；根粗 壯，從根狀莖生出，其末端膨大形成紡錘形的塊根。以此加工為薑黃 藥材。亦可以當作調味品、香料、防腐劑及著色劑，薑黃素屬於多酚 類化合物，外觀為橘黃色結晶狀。在中醫的用途上具行氣活血止痛的 作用，目前的文獻報導指出，薑黃素具有雙重對抗自由基作用，它可 以直接捉取自由基(ROS)也可以直接抑制自由基生成酵素，而且薑黃 素具有抑制金屬離子Fe2+、Cu2+誘導脂質過氧化、抑制細胞氧化修 飾低密度脂蛋白和保護DNA 免受過氧化脂質損傷等作用。薑黃素的

抗氧化能力高於維生素C 及維生素E 等日常抗氧化劑，薑黃素的抗 氧化力價，是維生素E 的1.60 倍，是黃酮類抗氧化劑的2.33 倍，更 是維生素C 的2.75 倍(Ramsewak et al., 2000)。薑黃素可降低總膽固 醇，並可提高HDL(Fan et al., 2006)，以及抑制血小板凝集等作用，有 助於預防心血管疾病的發生。近幾十年來薑黃素更是發現具抗癌功能 (Bhandarkar and Arbiser, 2007; D'Incalci et al., 2005)，它最主要被發現 的抗癌機轉是抑制化學致癌TPA(12-0-teradecanoylphorbol-13-acetate) 的活化(Weber et al., 2006)，減少癌促進作用(tumor promotion)，它也 可以抑制癌細胞的增生(Hanif et al., 1997)，主要它可以抑制NF-κB(Shakibaei et al., 2007)阻斷Ras/Raf、PKC 以及MAPK 路徑有關 (Kakar and Roy, 1994; Kapoor et al., 2002; Sowa et al., 2002)。

Hydroxydibenzoylmethane、dibenzoylmethane、 hydroxymethyl- dibenzoylmethaneru, 皆為 curcumin 的衍生物。Dibenzoylmethane 目前 被證實可以藉由AhR-dependent signaling 調控 breast cancer resistance protein (BCRP)(Ebert et al., 2007)。根據先前的研究報告指出這三種成 分 可 以 誘 發 細 胞 凋 亡 ， 可 以 調 控 c y c l i n D 3 , B a x , p 2 1 a n d Bcl-X(L)，釋放 cytochrome c，procaspase-9 被切割，活化 caspase-2 與 caspase-3，PARP 分解, 與藉由 DFF-45 活化 caspase-activated deoxyribonuclease 讓 DNA 斷裂(Pan et al., 2003) 。

實驗目的

總合以上之研究得知lysyl oxidase 是讓肝硬化走向肝癌的關鍵之

ㄧ。 本次研究先確定臨床上肝癌病人與 lysyl oxidase 的表現量是否

相關性，並使用肝癌細胞長期加入酒精培養後讓lysyl oxidase 被誘

發，觀察細胞的變化，最後加入天然抗氧化物在肝癌細胞觀察lysyl

oxidase 是否被抑制。希望藉著本次實驗可以更了解 lysyl oxidase 在 肝癌的重要性。

實驗材料與方法

實驗材料與方法

壹、藥品試劑

1. 下列產品購自Amresco， Inc.， Solon， Ohio， USA

agarose I， albumin bovine， BCIP/NBT， Coomassie brilliant blue，DTT， EDTA， glycerol， glycine， HEPES， Magnesium chloride (MgCl2)， PMSF， RNase A， sodium chloride

(NaCl)，

TEMED， Trishydrochloride (Tris-HCl)， Tris-base 2. 下列產品購自 Beckman Coulter， Inc.， USA

Ready Safe Cocktail

3. 下列產品購自BDH Laboratory Supplies， Poole， England methanol， phenol， Triton X-100

4. 下列產品購自BioLabs， Inc.， New England prestained protein marker

5. 下列產品購自Biological Industries， Co.， Israel Fetal calf serum (FCS)

6. 下列產品購自Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA， USA Protein assay dye reagent concentrate， sodium dodecyl sulfate (SDS)

7 下列產品購自Gibco， Invitrogen Co.， Grand Island， NY， USA 1X Trypsin-EDTA， Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

8 下列產品購自ICN Biomedical Inc.，Aurora，Ohio，USA ammonium persulfate (APS)

9 下列產品購自J.T Baler，Phillipsburg，NY，USA acetone，sodium bicarbonate (NaHCO3)

10 下列產品購自Kanto Chemical Co.，Inc.，Tokyo，Japan isoamyl alcohol.

11 下列產品購自Mallinckrodt， Xalostoc， Mexico sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) 12 下列產品購自Merck，KGaA，Darmstadt，Germany

acetic acid (CH3COOH)，bromophenol blue，DMSO， ethidium bromide (EtBr)，potassium hydroxide (KOH)， 37% hydrochloric acid (HCl)，sodium hydroxide (NaOH)， Tween 20

13. 下列產品購自PerkinElmer Life Sciences，Inc.，Boston，MA， USA

PVDF transfer membrane，

Western lightning-chemiluminescence reagent plus 14. 下列產品購自Pierce， Rockford， Illinois， USA albumin standardt

15. 下列產品購自Plusone， Pharmacia Biotech AB Uppsala， Sweden

acrylamide PAGE， Methylenebisacrylamide 16. 下列產品購自Riedel-de Haën， Seelze Germany

chloroform，potassium chloride (KCl)，sodium azide (NaN3)， sodium fluoride (NaF)， potassium dihydrogenphosphate

(KH2PO4)

17. 下列產品購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz， CA，USA

lysyl oxidase，GAPDH，anti-goat IgG-HRP，anti-mouse IgG-AP

18. 下列產品購自Sigma Chemical Co.，St. Louis，Mo，USA aprotinine，EDTA，EGTA，trypan blue，leupeptin，

propidium iodide，sodium orthovanadate (Na3VO4)，sodium pyrophosphate，nonident P-40 (NP-40)，β-glycerophosphate (β-gp)，N-lauroylsarcosine，100% TCA，paraformaldehyde， MG-132，cytochalasin D，PDTC，TPCK

19. 下列產品購自Wako Pure Chemical Industries， Ltd.， Japan boric acid (H3BO3)

20. 下列產品購自 ProTech Professional Technical Service， Inc. deoxynucleotide Triphosphated (dNTPs) sets

21. 下列產品購自 Yeastern Biotech Co.，Ltd.

YEA Taq DNA polymerase ，pro tag DNA polymerase. 22. 下列產品購自US Biomax , Ins.

Tissue microarray

貳、常用溶液

1. 0.5X TBE(Tris-Borate-EDTA)buffer:

8.9mM Tris-base, 8.9mM boric acid , 0.2mM EDTA(pH 8.0)， 溶於去離子水

389.6 g/L acrylamide, 10.4g/L methylenebisacrylamide 溶於 離子水

3. Agarose gel formula:

2.0% agaroseⅠ溶於 0.5X TBE buffer 4. Buffer A: 10 mM Tris-HCl(pH7.9), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1%NP-40, 0.5mM DTT, 溶於去離子水 5. Buffer B 20M Tris-HCl(pH7.9), 420mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, 25% glycerol, , 0.5mM DTT, 溶於去離 子水 6. Buffer C： 20M Tris-HCl (pH 7.9), 420 mM NaCl, 1.5mM MgCl2 , 0.2 mMEDTA, 0.5 mM PMSF, 25 % glycerol, 0.5mM DTT, 溶於去離子水

7. DNA 6X loading dye:

1mM EDTA, 25% bromophenol blue, 50% Glycerol, 溶於去離子水

8. Phosphate buffer saline(PBS):

8 g/L NaCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.2 g/L KCl, 0.24 g/L KH2PO4, 溶於去離子水

9. Protease inhibitor：

0.1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF 10. Protein 5X loading dye：

1.5M Tris-base (pH 6.8), 10% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20%glycerol, 1M DTT, 溶於去離子水

11. PVDF membrane blocking buffer for alkaline phosphatase manner：

5% skim milk, 0.2% NaN3, 溶於TBST

12. PVDF membrane blocking buffer for horseradish peroxidase manner：

5% bovine albumin, 溶於TBST 13. SDS-PAGE running buffer：

25mM Tris-base, 250mM glycine, 0.1% SDS, 溶於去離子水 ，調整pH 值至8.3

14. TBST buffer：

10mM Tris-base, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20, 溶於去離 子水，調整pH 值至7.5

15. TE buffer：

10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0), 溶於去 離子水

16. Transfer buffer for Western blotting assay：

20mM Tris-base, 150mM Glycine, 20 % Methanol, 溶於去 離子水,調整pH 值至8.3 叁、實驗方法:

一、冷凍切片:

由外科醫師取出病患肝癌組織與其周邊正常肝臟組織後，直接 使用冷凍包埋劑包埋，使用冷凍切片機將人類肝臟組織，切片厚度5 μm。

二、蘇木精與伊紅染色法(Hematoxylin and eosin stain) :

冷 凍 組 織 切 片 使 用37% 福 馬 林 溶 液 固 定 組 織 ， 直 接 放 入 maryer`shematoxylin，三到五分鐘，過水三十秒，放入025%ammonia water solution約二十秒，過水三十秒，放入eosin一分鐘，過水三十秒， 將組織切片放入75％ethanol，輕輕的浸泡上下來回約十次，組織切片 放入95％ethanol，輕輕的浸泡上下來回約十次，組織切片放入，99 ％ethanol，準備三個xylene，每一個皆輕輕的浸泡上下來回約十次，

使用封片劑封片。

三、Masson trichrome stain:

肝組織冷凍切片5 µm thick sections 置於載玻片上。Masson trichrome stain 針對膠原蛋白的沉澱與纖維化的組織染色。使用 Masson composition solution 染組織切片5 min，再放入 5% phos- photungstic acid 6 min，接下來將組織切片放在light green SF solution 5 min， 將組織切片放在 0.2% acetic acid溶液漂洗。muscle fiber染為 紅色而collagen 染成藍綠色，彈力纖維染成藍黑色，使用封片劑封片。

四、免疫化學組織染色法 (Immunohistochemical staining assay): 肝組織冷凍切片5 µm thick sections 置於載玻片上，使用過氧化 氫，將組織上內源性的干擾因子去除，使用lysyl oxidase (Senta Curz) 抗體，1:20 稀釋在PBS 溶液中.完全覆蓋在組織切片上，作用一百二 十分鐘，使用PBS清洗三次，每次五分鐘，接下來我們使用anti-goat HRP-conjugated antibody(senta curz)，以1:40稀釋在PBS 溶液中.完全 覆蓋在組織切片，作用六十分鐘，使用PBS清洗三次，每次五分鐘， 接者使用streptavidin (conjugated to horseradish peroxidase) ， 作用三 十 分 鐘 ， 使 用PBS 清 洗 三 次 ， 每 次 五 分 鐘 ， D A B C h r o m o g e n (DakoCytomation)呈色劑，作用約三到五分鐘，接著我們使用maryer`s

hematoxylin 染細胞核，作用約三到五分鐘，使用流動的自來水清洗 十分鐘後，使用75％Ethanol，上下浸泡約十次，使用85％Ethanol， 上下浸泡約十次，使用99％Ethanol，上下浸泡約十次，準備三組 xylene，上下浸泡約十次，共三次，使用封片劑封片。觀察組織中蛋 白的表現。 五、細胞培養(cell culture):

Hep 3B cells 為肝癌細胞(ATCC)，Hep 3B cells 帶有 B 型肝

炎病毒，不表現p53，Hep 3B cells 倍增時間約為 48 小時，為附著

生長型的細胞。Hep 3B cells 使用的 culture medium 為 Modified Eagle Medium（MEM）額外添加 10% Fetal calf serum（FCS）培養與 1.0 mM sodium pyruvate。細胞培養於 75T flask 中，並置於溫度 37℃，溼度 95%，含 5% CO2 的細胞培養箱中，待培養至八、九分滿時，可以 進行細胞的次培養。首先將原來 culture medium 抽乾，以 phosphate buffered saline(PBS) 清洗細胞表層後，加入 1ml 0.25% trypsin-EDTA ㄧ~二分鐘，待細胞被 trypsin 切下後，以 culture medium (MEM)將 細胞沖下收集，並將此細胞液放入離心管以 1200 rpm 離心三分鐘， 離心完後抽掉上清液，且加入細胞培養液輕輕將細胞打散。最後留約 四分之ㄧ的細胞在原培養瓶中繼續培養，其餘細胞依實驗目的不同均

勻分配到各培養皿中。實驗用的細胞待其長至七分滿後，即可進行實 驗。

六、長期加入乙醇與肝癌細胞培養:(Long-team treated ethanol in

Hep 3B c3ll)

Hep 3B cell 每日加入 10mM ethanol 在 Minimum essential medium (GIBCO) 內含 10mM sodium pyruvate， 10%fetal bovine serum. Cells 培養在 37 °C 與 5% CO2 humidified atmosphere。次培養 一次為一代。

七. 反轉錄聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction）:

將600x10³個wild Hep 3B cell與EtOH Hep3B cell 接種至六公分 培養皿中，分別加藥處理適當時間後，吸乾培養液並加入一毫升 TRIzol reagent，在加入適量的chloroform 用力搖晃完全混合後並至於 冰上五分鐘，4℃離心14000xg下離心30分鐘，取出上清夜並加入 isopropanol ，體積的比例為1:1，-80℃作用隔夜，第二天由-80℃的 冰箱取出，再4℃離心14000xg下離心20分鐘。冷凍乾燥十分鐘後，加 入適量的RNAse free water，定量後，加入RTse-buffer、dNTP、oligo dT primer、RNase，37℃下作用80分鐘，反轉成cDNA。

將粹取出的 DNA 取 1 μl 與 YEA Taq DNA polymerase、 Taq buffer、dNTP 及各別primer 混和，以 RNase Free water 補至總 體積25 μl。先以 95 ℃ 變性（denatruation）三分鐘，其後 95 ℃ 變

性三十秒、60 ℃緩冷配對（annealing）二十秒與 72 引子延伸（primer

extension）三十秒，作用 35 個循環，而後以 72 ℃引子延伸七分鐘 將反應終止，最後溫度降至 4 ℃。取 25 μl PCR 產物與 6X DNA loading buffer 混和均勻，注入 2% Agarose ge（l 內含 EtBr）well 中，以100 V 電壓下於 0.5 X TBE 緩衝液中進行瓊膠電泳，約四十 分鐘後，以紫外光線透視燈下拍照，觀察 DNA 變化情形。

八. 螢光免疫染色(Immunofluorescence assay):

將細胞養在蓋玻片上，分為 Wild 與 EtOH 二種 Hep 3B cell ， 培養8 小時後，以 PBST (PBS 含 0.05% Tween 20 )清洗，接著加入固

定 液(acetone:methanol=1:1)於-20℃作用五分鐘將細胞固定，再用

PBST (PBS 含 0.05% Tween 20 )清洗細胞三次，每次約五分鐘。在以 Lysyl oxidase antibody 1:50 作用一百二十分鐘，再用 PBST(PBS 含 0.05% Tween 20 )清洗細胞三次，每次約五分鐘。接者加入 fluorescein isothiocyanate (FITC) Conjugated goat anti-moise IgG antibody 避光作

下 作 用 五 分鐘，最後將細胞封片，使用共軛焦顯微鏡(confocal microscopy)觀察蛋白表現的情形。共軛焦顯微鏡(confocal microscopy) 以Argon Ipn Laser 488nm 與 Green Helium-Neon Laser 543nm 作為光

源，以FLUOVIEW 程式來觀察。

九.西方墨點法 (Western blotting assay):

將 8×105個細胞培養置 10 cm dish 中，加入天然抗氧化物 蓝莓與咖哩混合粹取物，收取24小時後的蛋白，將細胞以冰的PBS 清 洗兩次，加入適量的protein extraction buffer(20mM tris-HCl、p7.9、 137mM NaCl、2mM PMSF、10mMNaF、5mM EDTA、5mM DTT、 1mM EGTA、10% glycerol、1mM sodium pyrophosphate、0.1mM β-glycerophosphate、10μg/ml aprotinine、10μg/ml leupeptin、 1% triton X-100) 將細胞刮下並收集，接著 vortex 使之與細胞充分混合，置於 冰上作用三十分鐘，最後以 4℃、12000 rpm 高速離心三十分鐘，上 清液即為 whole cell lysate 之蛋白質萃取物。 收集到的蛋白萃取物 經 定 量 (quantification) 後 ， 30μg/lane 的 蛋 白 萃 取 物 進 行 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 。蛋白 萃取物與 6X protein loading dye

混合，於 95℃ 作用五分鐘後置於冰上冷卻，再將蛋白萃取物分別注 入 well中，以 80V 電壓進行電泳，待蛋白分離完全後再進行蛋白質

轉 漬 (transfer) ， 以 999mA 兩 小 時 將 蛋 白 轉 漬 到 PVDF transfer membrane 上。之後將轉漬好的 membrane 浸泡在 5% BSA 溶液中 進行blocking，然後進行免疫墨點法 (Immunoblotting assay)。加入特 異性抗體 (1:500)作用兩小時，再以 1X TBST 清洗membrane，接著 加 入 anti-mouse/rabbit IgG conjugated alkaline phosphatase(AP) 或 anti-mouse/rabbit IgG conjugated horseradish peroxidase (HRP) 作用一 小時後以 1X TBST 清洗 membrane，最後利用 BCIP/NBT 呈色法或 Enhanced ChemiLuminescence (ECL) 顯像法來表現結果。

結果

結果

壹、 Tissue microarrary 使用免疫化學組織染色法篩選 lysyl

oxidase 與肝癌的相關性:

為了證實 lysyl oxidase 與肝癌的相關性(Murawaki et al., 1991)， 因在臨床收集大量的肝腫瘤組織不易，我們利用現成的 Tissue microarrary 來篩選 lysyl oxidase 在肝癌組織是否有高度的相關性， 利用免疫化學組織染色法來觀察 lysyl oxidase 蛋白的表現(Kobayashi

et al., 1994)。

在 Tissue microarrary 玻片上分別有四十個惡性肝腫瘤組織與四 十個正常的肝臟組織之中(fig1.A,B)，我們使用的 lysyl oxidase 抗體 對 lysyl oxidase 蛋白 C 端的位子具有特異性，所以只要是活化與非 活化的蛋白都會表現，經由實驗證實其中有二十八個惡性腫瘤肝臟 組織切片，lysyl oxidase 蛋白的確與腫瘤組織表現具有高度的相關 性。其餘十二個腫瘤組織則是少量或無表現，雖然這 80 個組織的 每一組腫瘤與正常組織接不是來自同一個人身上獲得，但是在針對 lysyl oxidase 與惡性肝腫瘤的相關性，我們的確了解到 lysyl oxidase 蛋白佔有一定比例的關係。

在本次實驗中，我們取 Tissue microarrary 第二十六與第二十七號 組織切片(fig1.C)，來觀察 lysyl Oxidase 蛋白表現在惡性腫瘤與正

常肝組織的位子，因為第二十六與第二十七號的組織切片上 lysyl oxidase 蛋白具有明顯的差異，故我們使用顯微鏡放大觀察，lysyl oxidase 蛋白表現在惡性腫瘤組織第二十六號(fig1.D、F、H)中的細 胞外基質與細胞質之中，表示的確在某些因素下腫瘤細胞製造出來 的 lysyl oxidase 蛋白較多，但是哪種原因造成，我們現在仍不知道。 而在正常肝組織第二十七號(fig1.E、G、I)lysyl Oxidase 蛋白表現在 ECM 與細胞質則無明顯的增加。經由實驗知道在惡性肝腫瘤的形 成，lysyl oxidase 蛋白的表現與活化，具有一定的相關性。 貳、lysyl oxidase 在臨床肝癌組織切片的表現 Tissue microarrary 上的肝臟組織切片，因為每一對組織切片，不 是來自同一個人的組織。所以我們無法了解在同一個人身上肝癌與 周邊組織後lysyl oxidase 蛋白表現的差異。而且 lysyl oxidase 蛋白會

不會在做成石蠟組織切片時，破壞了lysyl oxidase 蛋白，讓抗體無 法辨認，我們並不清楚，於是我們請台北醫學院附設醫院病理科為 本次實驗收集一位病人具有在惡性肝腫瘤的切片。 此位病患經臨床診斷罹患嚴重的惡性肝腫瘤而且合併轉移的現 象，在切除此位病人腫瘤時，同時保留腫瘤周邊一些正常組織，接 著使用冷凍包埋劑包埋新鮮的組織，製作成冷凍切片。為了確認與

評估肝組織為惡性與癌細胞在切片上的位子，我們先使用 H＆E stain ，請專業的病理科醫師確定組織切片是否為惡性肝癌組織與肝 組織切片上腫瘤的位子(fig2)，圖片中，肝腫瘤組織在左邊，腫瘤細 胞的核質比大且排列不整齊。右邊是正常的組織正常的肝細胞型態 扁平狀，整齊平鋪在基質上。而在中間分隔正常組織與腫瘤組織為 纖維化的部分，也就是肝臟的疤痕，確定了肝臟切片中為惡性腫瘤 與其位子。根據文獻的記載，lysyl Oxidase 蛋白使組織纖維化。所 以為了更了解 lysyl Oxidase 蛋白是否因此表現在纖維化的位子 (Pinzani et al., 2005)，我們必須先確認纖維化的位子是否如同病理科 醫師確認在中間纖維化之處，並觀察腫瘤與正常組織上纖維化的程

度，我們利用Masson trichrome stain，它最主要會染在已纖維化的

膠原蛋白與彈力纖維上，經由 Mosssion trichrome 染色(fig3A,B)後， 藍色是膠原蛋白，藍黑色的是彈力纖維，棕色是細胞的位子也就是 背影染色，在肝腫瘤組織中(fig 3C)我們看到藍黑色的位子幾乎沒 有，代表腫瘤被纖維化的地方不多，反而在周邊正常的肝臟組織中 (fig 3D)，尤其是靠近中間纖維化的區域，明顯增多。

但為了確認是否纖維化的地方就是代表 lysyl oxidase 蛋白表現

較多的位子，我們使用同一組肝臟冷凍切片，利用IHC staining assay

染色法染色後，可以看到左邊肝腫瘤切片的部份染出來的顏色比右 邊正常組織深(fig.4B)，這表示腫瘤細胞分泌出來的 lysyl oxidase 蛋

白較多，而lysyl oxidase 蛋白表現在腫瘤細胞(fig4 C，E)的細胞質

與細胞外基質，與先前 Tissue microarrary 的結果相同，在正常的組

織(fig4D，F)細胞中，lysyl oxidase 蛋白表現在纖維化的位子不如期 的明顯。

但在之前研究的指出，因為 lysyl oxidase 蛋白的確會使組織纖

維化(Oleggini et al., 2007; Pischon et al., 2004)，我們另外再請台北 病理科收集一位臨床病人的患有良性的肝腫瘤組織檢體，此位病人 經專業病理科醫師鑑定後為良性腫瘤，沒有侵犯與轉移的現象，使 用 IHC staining assay 觀察 lysyl oxidase 的表現(fig 5)，圖五 A 左邊 是 正 常 的 肝 臟 組 織 ， 右 邊 為 良 性 的 纖 維 囊 腫 ， 在 良 性 的 腫 瘤 (fig.5B.C)lysyl oxidase 蛋白的表現在肝腫瘤反而沒有正常組織多。 這可能是因為良性腫瘤造成的慢性發炎反應迫使周邊的正常組織細 胞不斷分泌 lysyl oxidase 蛋白期望能消滅不正常組織的增生更或著 是因為周邊的組織不斷的纖維化，將良性腫瘤本身圍起來，使其無 法生長與增生，而lysyl oxidase 就會在週邊組織的細胞外基質不斷 的氧化膠原蛋白與彈力纖維，此時周邊組織的lysyl oxidase 表現的 比較活耀。

叁、lysyl oxidase 長期使用 10mM 酒精培養的表現

確定 lysyl oxidase 在惡性腫瘤組織表現量高，而酒精是造成成肝 癌的主要因子之ㄧ，我們期盼能了解酒精是否會誘發 lysyl Oxidase 蛋白，我們使用已經帶有 B 肝炎病毒的 Hep 3B cell 分別以 600x10³ 個細胞培養在培養皿，接下來我們每天使用 10mM 酒精加在 Hep 3B cell 長期培養，可能 EtOH Hep 3B cell 本 身因為長期餵食酒精，生 長速度高於 wild Hep 3B cell，在 wild Hep 3B cell 為三天次培養一 次，而 EtOH Hep 3B cell 需二天就次培養一次，我們選擇第三十代 EtOH Hep 3B cell 與 wild Hep 3B cell，利用免 疫螢光染色法觀察 EtOH Hep 3B cell(fig6D、E、F)是否因酒精刺激 增加 lysyl oxidase 的表現。在圖中可以看到綠色螢光主要表現在細 胞質與細胞之間，

這符合之前文獻所說的，當 lysyl oxidase 的確是 存在於細胞外基

質，並且由我們的實驗證實經酒精長期刺激使細胞 與細胞之間連結

更緊密，讓細胞更緊密貼在培養皿內，在 wild Hep 3B cell (fig6 A、

B、C)綠色螢光表現較少且細胞與細胞之間沒有緊 密結合的現象。 在 lysyl oxidase mRNA 部份，為了觀察在長期酒精的刺激下是

否有被激發，每日加10mM 酒精，每隔二天次培養為一代，每隔十

們參考2006 年 nature letter 所設計 primer，觀察酒精是否誘發 lysyl oxidase mRNA，我們分別取 10、20 、30、40 代的 EtOH Hep 3B cell

與 wild Hep 3B cell，利用反轉錄聚合酶連鎖反應，發現酒精培養的

代數越高，lysyl oxidase mRNA 表現量更多。

肆、天然抗氧化物抑制 lysyl oxidase RNA 的合成

Hydroxymethyldibenzoylmethane (1µM)，dibenzoylmethane (1µM)，hydroxydibenzoylmethane (1µM)，curcumin 1µM 與 pteros- tilbene( 1µM)是天然的抗氧化物，我們將這些天然抗氧化分別與七 十代 ETOH Hep 3B cell 一起培養二十四小時，觀察 lysyl oxidase mRNA 表現量是否因此而受到抑制(fig.8 A) ，在單一抗氧化物抑制 lysyl oxidase mRNA 的方面，經過幾次的實驗下來效果並不明顯， 雖然在圖中每一種抗氧化物都有抑制 lysyl oxidase mRNA，只有 hydroxymethyldibenzoylmethane、Hydroxydibenzoylmethane 、 Pterostilbene 有達到抑制的需求但是這結果並不符合我們的期望，我 們期望 lysyl oxidase mRNA 能夠受到抑制並原先 wild Hep 3B cell lysyl oxidase mRNA 表現量相同或是更低。

於是我們將這五種抗氧化物，將 pterostilbenem 與 curcumin 和 其衍生物混合加入 ETOH Hep 3B cell 一起培養，期望能夠因此而

加成抑制的效果(fig.8 A)，我們發現在不同組合抗氧化物 lysyl oxidase mRNA 抑制效果更明顯了，尤其是 pterostilbene 、 hydroxymethydibenzoylmethane 這二種抗氧化物的組合。成功的抑 制 lysyl oxidasemRNA。

由 fig.8 A 得知 pterostilbene 、hydroxymethydibenzoylmethane 是 目前我們發現最佳的抗氧化物，期望將來可供人體使用，為了能找 到最低的抑制濃度就可以讓 lysyl oxidase mRNA 得到最有效的抑 制，我們分別將這二種藥物單獨以 10μM、1μM、0.1μM 這三種 不同濃度，與 70 代的ETOH Hep 3B cell 一起培養二十四小時(fig.8 B)，在 lysyl oxidase mRNA 中可看到最低抑制濃度在 1μM 的抑制 效果是最好的。

伍、 天然抗氧化物抑制 lysyl oxidase 蛋白質的合成

由於上述抑制 lysyl oxidase mRNA 為 1μM，決定混合使用混合

pterostilbene 1μM 與 hydroxymethyldibenzoylmethane 1μM 來觀察 lysyl oxidase 蛋白抑制效果(fig 9)，加了藥經由二十四小時，可以

觀察到活化型的 lysyl oxidase(30KDa)具有明顯的抑制效果，而在

未活化型的lysyl oxidase(50KDa)因為活化型 lysyl oxidase 被抑制， 而經由酒精誘發的 lysyl oxidase 無法被活化。

討論

討論

在本篇論文中，我們探討 lysyl oxidase 與肝癌之間的相關性，

並經由天然抗氧化物抑制其活性，減少纖維化與腫瘤持續惡化的關 鍵。在之前的研究中lysyl oxidase 可以當作 tumor suppressor(Min et al., 2007; Murad and Pinnell, 1987)，主要是minoxidil 的作用在纖維細胞 lysyl oxidase 活性喪失，造成細胞擴散幾乎的完全停止。大多數的研

究在胃，大腸，和攝護腺癌病人資料表示，因為甲基化或突變導致lysyl

oxidase 的減少。早先報告表示， 抑制 lysyl oxidase 的基因禁止細胞 的增生(Kagan and Li, 2003)，並支持 lysyl oxidase 作為 tumor suppressor(Min et al., 2007)。在近年來，lysyl oxidase 被發現會讓乳癌 細胞轉移與侵犯(Erler et al., 2006; Erler and Giaccia, 2006; Maki et al., 2005; Payne et al., 2005; Polgar et al., 2007; Sibon et al., 2005; Sion and Figg, 2006)。由此可知，lysyl oxidase 在癌症這方面的重要性。 由我們結果證實在肝癌的組織中 lysyl oxidase 表現量高於正常肝 組織。當我們的免疫細胞攻擊癌細胞時，發炎現象產生、組織為了要

修復組織，膠原蛋白與彈力纖維會過度增生，在先前的研究當中，lysyl

oxidase 會調控膠原蛋白Ⅲ與彈力纖維 promoter(Oleggini et al., 2007)，使膠原蛋白與彈力纖維增生，發炎因子不斷的刺激下，肝癌

氨酸的位子，這或許能夠解釋 lysyl oxidase 在惡性肝腫瘤中表現較 高。並且讓周邊正常的組織不斷的纖維化，尤其是在腫瘤與正常組織 的交界處。而另一個可能的原因是，肝癌病人銅離子會比較高(Harris, 1976; Rucker et al., 1998)，而銅離子是許多胺基酸合成時必要的

元素，銅離子是在lysyl oxidase 轉譯後修飾後加入，銅離子的功能為

輔因子，它可以活化lysyl oxidase 的 LTQ，LTQ 是 lysyl oxidase 主要 氧化膠原蛋白與彈力纖維最重要的地方，因此銅離子可能刺激肝癌細 胞大讓製造lysyl oxidase 蛋白。我們利用 Immunohistochemical (IHC) staining assay 來觀察良性與惡性肝腫瘤 lysyl oxidase 的變化，在良性 腫瘤方面，lysyl oxidase 在週邊正常組織表現比較明顯，而在良性腫 瘤本身反而沒有正常組織表現的多。根據之前肝癌相關的報告指出， lysyl oxidase 表現在肝硬化的後期，也代表良性肝纖維囊腫在還沒惡 化之前，lysyl oxidase 的確不會被大量製造。

在酒精與肝癌之間的關係(Brunt, 2002; Hourigan and Bowling, 2001; Lieber, 2000b; Lieber, 2004; Mendez-Sanchez et al., 2005; Yip and Burt, 2006)，典型的酒精飲料，例如:12 盎司啤酒，包含大約 12-14 克

對氨基苯甲酸二。當每日酒精消耗量超出80 g/day 超過 10 年得到肝

癌的風險為每日酒精消耗量低於80 g/day 的五倍，因為對氨基苯甲酸

過的酵素系統: 酒精 dehydrogenase (ADH), 微粒體對氨基苯甲酸二 氧化的系統(MEOS) 。ADH 反應導致減少作為導致各種各樣的新陳 代 謝 的 混 亂 譬 如 h y p e r p r o t e i n e m i a I V 和 v 的 NADH ,hypoglycaemia 、lactacidosis 、hyperuricaemia, 和 porphyria 的

某些形式。而這些激素或許使 lysyl oxidase 因而增加。而久經進入人

體時lysyl oxidase 因而在細胞外基質慢性產生微妙的變化，不斷的循

環，使纖維化發生。在細胞實驗當中，長期與酒精培養的肝細胞中， lysyl oxidase 的表現，讓細胞與細胞之間更緊密的結合，lysyl oxidase

也會隨著代數的增加而增加。在分子機制上，lysyl oxidase 影響 cyclin

D1 使纖維細胞增生。所以在我們每天加入酒精與肝癌細胞培養時， 有加酒精的細胞生長速度比沒有加酒精的快。我們想知道是哪一種轉

錄因子導致lysyl oxidase 大量增生，我們利用染色質免疫沉澱法，觀

察了Rb 蛋白、NF-κB、phos-stat3，非常可惜的是，在這三個蛋白都

不是與我們設計 promoter 具有相關性的蛋白。之前的研究有提出ㄧ

個假說，lysyl oxidase 被活化後，被切下的 pro-peptide 會再回到細胞 核 內 ， 刺 激 細 胞 製 造 l y s y l o x i d a s e 蛋 白 ， 這 也 是 我 們 日後要探討的方向之ㄧ。

使用天然的抗氧化物加入長期與酒精培養的肝細胞中，lysyl

加入天然抗氧化物 pterostilbene 與 hydroxymethyldibenzoylmethane 之

後，在未被活化的 lysyl oxidase 是無變化的，主要是在活化型的 lysyl

oxidase 可以明顯的看到抑制效果，pterostilbene 與 hydroxymethyl -dibenzoylmethane 這二種結構式都很類似都具有二個苯環，而且這二 個藥物都被報導過具有抗癌功能，所以這可能是天然的抗氧化物會與 lysyl oxidase 主要的活化位 LTQ 結合，或是讓 BMP-1 無法去修飾轉 譯後的lysyl oxidase 蛋白，因而使活化型的 lysyl oxidase 被抑制。也

或者是因為lysyl oxidase 在氧化氨碁酸—離氨酸是主要是靠 ping pong

bi ter kinetic mechanism，一但這個機制受到干擾，可能也會影響 lysyl oxidase 蛋白的活化。

由我們實驗可以看到肝癌 lysyl oxidase 表現量的確高於肝纖維

化病人，若是可以干擾lysyl oxidase 的表現，使 lysyl oxidase 不活化， 可以減少肝癌發生的機率，更可以當作肝癌與肝纖維化的分水嶺指 標。

Fig.1 TMA and lysyl oxidase protein expression. A. for TMA real

size.B. forty organized to liver tumour tissue and normal liver tissue. Red points were lysyl oxidase protein expression. C. On the left is a tumour organization (C6) On the right is a normal organization (C7). Enlarge by 40X，Can be clear that see that organize lysyl oxidase to expressied higher than to organize normally in left tumour. D. Organization enlarges the tumour (C6) by 100X. E The normal organization (C7) enlarges 100X. F. Organization enlarges the tumour (C6) by 200 X. Arrowhead was lysyl oxidase expression. G The normal organization (C7) enlarges 200X. H. Organization enlarges the tumour (C6) by 400 X. Arrowhead was lysyl oxidase expression . I. The normal organization (C7) enlarges 400X.

Fig2. Frash hepatoma tissue for H＆E stain.A.frozen the liver tissue to

cut into slices, judge the seat of the tumour with H& E stain cell nucleus is blue black, the others are red. B. The middle is a fiber seat. On the left is the area of a tumour, on the right is the normal area. Enlarge by 200 X C Fresh tumour liver tissue for H＆E stain.400X.D. Fresh normal liver tissue for H＆E stain.400X

Fig3. Frash liver tissue for masson`s trichrome stain.A. Frozen the

liver tissue to cut into slices, judge the seat of the tumour with masson trichrome stain .collogen was blue ,elstin was blue black,cell nucleus was red black. B. The middle is a fiber seat. On the left is the area of a tumour, on the right is the normal area. Enlarge by 200X. Arrowhead had been fibrosis .C. Fresh tumour liver tissue for masson trichrome stain. 400X. D. Fresh normal liver tissue for masson trichrome stain.400X. Arrowhead had been fibrosis .

Fig.4 Fresh liver tissue for IHC staining assay.A. Fresh liver tissue for

IHC staining assay.100X.B. Fresh liver tissue for IHC staining assay. 200X. The middle is a fiber seat. On the left is the area of a tumour, on the right is the normal area. C. lysyl oxidase for fresh tumour liver tissue. Enlarge by 200 X.D lysyl oxidase for fresh normal liver tissue. Enlarge by 200 X. E. lysyl oxidase for fresh tumour liver tissue. Enlarge by 400 X. lysyl oxidase expressed at ECM and cytoplasm.F Fresh normal liver tissue for IHC staining assay. Enlarge by 400 X. lysyl oxidase was not expression.

Fig.5 Lysyl oxidase protein expressed in frash benignancy liver tumor tissue and normal liver tissue for Immunohistochemical (IHC) staining assay. A. Benign tumour for IHC staining assay.100X.The

observation protein differently displays us in benignity and the malignant tumor. We obtain a benign tumor to use IHC to compare the benignity whether instead displays with the malignant tumor protein the same .But peripheral normal tissue is more than in the benign tumorB. Normal organization of benign tumour for IHC staining assay.200X.C. Benign tumour for IHC staining assay.200X

Fig 6. Lysyl oxidase protein expressed in wild type and long term co-treated Hep 3B cell for immunofluorescence assay.A.Wt Hep 3B

cell with FITC. Lysyl oxidase seem has not been displayed .C. Wt Hep 3B cell with PI.The cell nucleus also not to have as if the excessively activity.D Wt Hep 3B cell for Immunofluorescence assay. Wt Hep 3B cell was the average is dispersible. E. EtOH Hep 3B cell with FITC. Lysyl oxidase protein was massively made.F. EtOH Hep 3B cell with PI The cell nucleus was activation.G. EtOH Hep 3B cell for Immunofluorescence assay. lysyl oxidase protein made cell and cell more close. The cell synapse lets between the cell and

Fig.7 Lysyl oxidase RNA expressed in different generation wild type and long term co-treated Hep 3B cell. Hep 3B cell co-treated 10 mM

ethanol everyday.During two days would subcultured. Long term ethanol treatation could induced lysyl oxidase mRNA in Hep 3B cell.

Fig. 8. Lysyl oxidase RNA expressed in wild type and long term co-treated Hep 3B cell with pterostilbene、curcumin、 hydroxyl -dibenzoylmethane、dibenzoylmethane 、hydroxymethyl dibenzoyl -methane.A.We used 1μM hydroxymethyldibenzoyl methane(HDB),

1μM dibenzoyl methane(DBM), 1μM hydroxydibenzoylmethane (HMDB), 1μM curcumin and 1μM pterostilbene(PSB) treated Hep 3B cell in 24 hours and observed which could suppression lysyl oxidase mRNA effect to be best. The single nature compounds haven`t good effect. Than we used 1μM hydroxyl -methyldibenzoylmethane and 1μM pterostilbene, 1μM dibenzoylmethane and 1μM pterostilbene, 1μM hydroxyldibenzoyl -methane and 1μM pterostilbene,1μM curcumin and 1μM pterostilbene that mixed in ethanol Hep 3B cell for 24 hours and inhibited lysyl oxidase mRNA had good effect that 1μM hydroxydibenzoylmethane and 1μM pterostilbene . B.Comparetion lysyl oxidase mRNA expressed in PSB and HMDB different concentration. The lowest suppression effect was in 1μM PSB and 1μM HMDB. We decided use mix 1μM PSB and 1μM HMDB that best inhitibited lysyl oxidase mRNA.

Fig.9 Lysyl oxidase protein expressed in wild type and long term co- treated Hep 3B cell with pterostilbene and hydroxymethyldibenzoyl- methane. Alcohol indusced lysyl oxidase protein.When PSB and HMDB

add for Hep 3B cell 24 hour, activited lysyl oxidase was suppression. But PSB and HMDB couldn`t inhibited inactivited lysyl oxidase. Maybe inactivited lysyl oxidase indusced that couldn`t degradation

附表一 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B C D E F G H

Legend: Liv - Liver

附表二

Specification sheet POS. NO. Age Organ

Pathology Diagnosis Type

A1 01 52 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant A2 02 50 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal A3 03 50 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant A4 04 34 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal A5 05 51 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant A6 06 65 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal A7 07 48 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant A8 08 42 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal A9 09 51 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant A10 10 36 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

B1 11 63 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant B2 12 57 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal B3 13 40 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant B4 14 41 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal B5 15 46 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant B6 16 65 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal B7 17 33 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant B8 18 55 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal B9 19 57 Liver Hepatocellular carcinoma with _necrosis Malignant B10 20 47 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

C1 21 50 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant C2 22 50 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal C3 23 51 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant

C4 24 27 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal C5 25 45 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant C6 26 60 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal C7 27 68 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant C8 28 62 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal C9 29 48 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant C10 30 63 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

D1 31 46 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant D2 32 25 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal D3 33 40 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant D4 34 53 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal D5 35 63 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant D6 36 63 Liver Liver tissue, (matched normal) _{of No.35} Normal D7 37 48 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant D8 38 63 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal D9 39 49 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant D10 40 50 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

E1 41 43 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant E2 42 46 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal E3 43 38 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant E4 44 56 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal E5 45 46 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant E6 46 58 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal E7 47 42 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant E8 48 40 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal E9 49 57 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant E10 50 47 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

F1 51 35 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant F2 52 31 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal F3 53 43 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant F4 54 63 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal F5 55 27 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant F6 56 61 Liver Liver tissue, (matched normal) _{of No.57} Normal F7 57 61 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant F8 58 36 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal F9 59 60 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant F10 60 40 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

G1 61 27 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant G2 62 27 Liver Liver tissue, (matched normal) _{of No. 61} Normal G3 63 39 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant G4 64 32 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal G5 65 48 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant G6 66 73 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal G7 67 54 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant G8 68 40 Liver Unmatched chronic hepatitis _tissue Normal G9 69 41 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant G10 70 56 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal

H1 71 58 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant H2 72 31 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal H3 73 52 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant H4 74 35 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal H5 75 52 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant H6 76 50 Liver Liver tissue, (unmatched _normal) Normal H7 77 47 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant H8 78 58 Liver Hepatocellular carcinoma Normal

H9 79 47 Liver Hepatocellular carcinoma Malignant H10 80 47 Liver Matched chronic hepatitis of No. ₇₉ Normal

附錄三:

Lysyl oxidase 製作的過程

Inactive lysyl oxidase CuLTQ LOX mRNA LOX protein LOX glycosylation Add cupper and LTQ secretion in ECM

附錄四:

Pathogenesis of hepatocellular carcinoma

HCV HBV 代謝性疾病 Alcohol 慢性發炎 環境因素 Regeneration 基因突變 hepatocellular carcinoma cirrhosis

附錄五:

Pterostilbene 結構式

附錄六: curcumin，dibenzoylmethane， hydroxydibenzoylmethane，Hydroxymethyldibenzoylmethane 的結構式 (Pan et al., 2003) 參考文獻 (References)