玖、附錄
第一子計劃：生化分析領域教學與品質提昇計畫。(執行單位：理工學院應化系) 附件一
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF)驗收報告書
年度月份 廠商名稱 儀器型號 工程師
93/10 美商布魯克道爾頓股份有限公司 autoflex 王廉雍、黃光明
附件二
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF)教育訓練相關資料
實施日期 授課人員 參與對象 地點
93/10/13 王廉雍 研究生 人文與科技大樓 G-606
93/11/23 王廉雍 研究生 圖書館一樓演講廳
94/01/25 王廉雍 研究生 人文與科技大樓 G-606 94/09/08 王廉雍 研究生、專題生 人文與科技大樓 G-606
教育訓練資料
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
High Throughput Research With High Throughput Research With
Bruker Mass Spectrometry Bruker Mass Spectrometry
Bruker Daltonics
Bruker Daltonics 王廉雍 王 廉雍 美商 美商 布魯克道爾頓 布魯克道爾頓
台灣分公司 台灣分公司 2005 0125 @
2005 0125 @ 朝陽科技大學 朝陽科技大學 應化系 應化系
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
Why Why
Mass Spect?
Mass Spect?
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
Sensitivity!
Sensitivity!
Resolution!
Resolution!
Speed!
Speed!
Cost!
Cost!
Precise!
Precise!
Consist!
Consist!
Why Why “ “ MS MS ” ” ? ?
MALDI
MALDI- -TOF TOF 特性： 特性：
MALDI
MALDI- -TOF TOF
質譜儀如何加速研究 質譜儀如何加速研究
– – 高靈敏 高靈敏
– – 樣品製備容易 樣品製備容易
– – 分析速度快 分析速度快
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
內容摘要：
內容摘要：
• • MALDI MALDI 的離子化原理 的離子化原理
• • TOF TOF 的飛行原理與模式 的飛行原理與模式
• • 應用與儀器搭配 應用與儀器搭配
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
MALDI
MALDI - - TOF TOF M M ass Spect ass Spect
Hello, I am Melody, Not MALDI !
Hello, I am Melody, Not MALDI !
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
什麼是『 MALDI』？
MALDI MALDI
基質輔助雷射脫附離子化 基質輔助雷射脫附離子化
M M atrix atrix 基質 基質
A A ssisted ssisted 輔助 輔助
L L aser aser 雷射 雷射
D D esorption esorption 脫附 脫附
I I onization onization 離子化 離子化
常見的 常見的 MATRIX MATRIX
HCCA HCCA
alpha
alpha- -cyano cyano- -4 4- -hydroxycinnamic acid hydroxycinnamic acid
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
常見的 常見的 MATRIX MATRIX
DHB DHB
Gentisic
Gentisic acid acid
(2,5- (2,5 -dihydroxybenzoic acid dihydroxybenzoic acid
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
常見的 常見的 MATRIX MATRIX
SA SA
sinapinic
sinapinic acid acid
(3,5- (3,5 -dimethoxy dimethoxy- -4 4- - hydroxycinnamic acid) hydroxycinnamic acid)
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
常見的 常見的 MATRIX MATRIX
HPA HPA
3- 3 -hydroxypicolinic acid hydroxypicolinic acid
(3- (3 -hydroxy hydroxy- -2 2 -pyridinecarboxylic acid) - pyridinecarboxylic acid)
•CCA ,
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid
SA, Sinapinic acid
DHB, 2,5-Dihydroxybenzoic acid Recommanded for Glycoproteins
MATRIX used for MALDI-TOF
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
How Matrix
How Matrix assiste assiste Protein Protein Ionisation? Ionisation ?
Matrix - CHCA
H H
337 nm Laser 337 nm Laser
Matrix 的特性 ：
可吸收 UV wavelength 的 Laser 光源，並增加能量
除釋放熱能外，並可游離 H+，使得 Protein 接受，並帶有電荷 （M+H+） Protein +H+在真空狀態下，霧化形成氣態單一分子（Plume Gas）
在高壓電場的吸引下 Protein 開始朝負極飛離
Matrix Matrix
Protein/Peptide
Protein/Peptide
Time of Flight Time of Flight
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
MALDI
MALDI- -TOF Analysis Mode TOF Analysis Mode
• • Linear Mode : Provide Wild Mass Range Linear Mode : Provide Wild Mass Range – – Protein MW determination Protein MW determination
•
• Reflectron Mode : Provide High Resolution Reflectron Mode : Provide High Resolution
– – Peptide Mass Fingerprint Peptide Mass Fingerprint ，also for Peptide ， also for Peptide Sequencing , based on PSD function
Sequencing , based on PSD function
• • TOF/TOF Mode : TOF/TOF Mode :
– – High Throughput Analysis, High sensitivity High Throughput Analysis, High sensitivity
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
La se r
MALDI-TOF-MS Analysis
Sample plate
Analyte molecules
in matrix
Acceleration grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrumVacuum system
Vacuumlock
Got Mass in less one second!! 10 Hertz Laser
Collect 20~200 Spectra in 2~20 Sec
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
MALDI TOF MALDI TOF
With With
Reflectron Reflectron
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
Resolution of Linear/Reflection TOF
Resolution of Linear/Reflection TOF Analyser Analyser
Linear TOF Linear TOF- -MS MS Res. ~10,000 (FWHM) Res. ~10,000 (FWHM)
Reflection TOF
Reflection TOF- -MS MS
Res. ~ 20,000 (FWHM)
Res. ~ 20,000 (FWHM)
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
High Resolution With Ion Reflector High Resolution With Ion Reflector
HiRes mass spectrum Ion
detector MALDI ion
source
Ion reflector
Flight Path Increasing and Reflector Cause High Resolution
Digested Peptides got High Accurate Mass for Peptide Mapping
La se r
+ + + + + + +
+ + + + + + +
Isotopic Distribution
Isotopic Distribution 同位素分佈 同位素分佈
1 Carbon C
1 Carbon C 12 12 : C : C 13 13 = = 98.9 : 1.1 98.9 : 1.1 2 Carbon 2C
2 Carbon 2C 12 12 : C : C 12 12 /C /C 13 13 : 2C : 2C 13 13 = = 97.8 : 2.2 : 0.01 97.8 : 2.2 : 0.01 3 3 Carobn Carobn
3C
3C 12 12 : C : C 12 12 /C /C 13 13 /C /C 12 12 : C : C 12 12 /C /C 13 13 /C /C 13 13 : 3C : 3C 13 13
= = 96.7 : 96.7 : 3.2 3.2 : : 0.03 0.03 : 0.0001 : 0.0001
………
………. .
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
Isotopic Patten Simulation Isotopic Patten Simulation
C
94H
147N
21O
28S
0 2000 4000 6000 Intens.
0 50 100 150 200
1024.0 1024.5 1025.0 1025.5 1026.0 1026.5 1027.0 1027.5 1028.0 1028.5m/z
Simulation
Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry™
Results of the„Formula Finder“
Ag
1-2C
6-10Cl
2-4H
10-20O
1-3S
1-3 Range of elemental composition:sum formula m/z;err [ppm]
C 6 H 12 Ag 1 Cl 2 N 2 O 3 S 1 -22.423 C 6 H 14 Ag 1 Cl 2 N 3 O 2 S 1 42.1174 C 7 H 14 Ag 1 Cl 2 N 1 O 1 S 2 -36.4713 C 7 H 14 Ag 1 Cl 2 N 1 O 3 S 1 11.667;0 C 8 H 16 Ag 1 Cl 2 O 1 S 2 -2.38123 C 8 H 16 Ag 1 Cl 2 O 3 S 1 45.757 C 10 H 10 Ag 1 Cl 2 N 1 O 1 S 1 -45.6086
Formular Finder 結果
附件三
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF)相關表格
項目 功 用
1 檢點表-定期做儀器的檢點維持良好狀態
2 使用紀錄表-使用儀器前後切確的紀錄使用狀態
基 質 輔 助 雷 射 脫 附 游 離 法–飛 行 時 間 質 譜 儀 （MALDI-TOF）
每 日 檢 點 表
檢點日期 檢點時間 實驗室編號 檢點人 簽名
N
2(g)壓力
（mbar) Vaccum 鋼瓶壓力 Ion Source current
(範圍 4 0~60μA) 備註
基 質 輔 助 雷 射 脫 附 游 離 法–飛 行 時 間 質 譜 儀 （MALDI-TOF）使 用 記 錄 表
使用日期 姓名 實驗室編號 時間 N
2(g)
壓力（mbar) Vaccum 雷射
Shot Count 鋼瓶壓力 雷射能量大小 備註
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
開始 開始 開始 開始 開始
結束 結束 結束 結束 結束
附件四
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF)考試相關資料
項目 相關資料
1 考試規則
2 考試題目-筆試
3 上機考試結果
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF)考試規則公告
1.質譜儀(TOF)每個月 20 號舉行筆試，在 15 號前向鳳玉報名，若遇假日則順延。
2.題庫及 3 篇參考文獻可向鳳玉索取，筆試題目由題庫中抽 10 題為考試題目。
3.筆試通過者須由具有執照的同學陪同上機 6 小時，並確實紀錄上機日期及時間。
4.最後再進行上機考試。
5.通過考試者須等公佈名單後，才可單獨上機。
6.若以上規定有更正，將另行公佈 。
考試題目-筆試
MALDI－TOF 的筆試考題 題庫
1. 依據使用手冊，sample plate 使用後，該如何清洗？
2. 在離子源的部分，使用 delayed extraction，使用 delayed extraction 的目的為何？
delayed extraction 的時間約為多少？
3. 請描述 CID（collision-induced dissociation）和 PSD（post-source decay）有何不同？
4. Time-of-flight mass analyzer 使用何種偵測器？請描述偵測器的原理。
5. 何謂 TFA？在樣品製備過程中加入 TFA 的目的為何？
6. 在我們的 TOF MS 中，linear mode 和 reflectron mode 的 mass resolution 分別為何？
7. 請描述詳細的樣品配製過程，製備一個 sample spot 含有 1fmol 的 ACTH
（MW=2464.2），matrix 為 CHCA（MW=189.17），而 matrix 和 ACTH 的比例為 10000：1。
8. MALDI 是由何人發展出來？在哪一年？此項成果於哪一年獲得 Nobel Prize？
9. 請寫出 MALDI-TOF/MS 的英文全名及中文譯名。
10. 請寫出 MALDI 的機制及原理。
11. 請利用簡單的公式導出 Voltage（V），Mass（m），Time of Flight（t）及 Distance of flight（D）之間的關係。
12. 請寫出質量精準度（mass accuracy）在 TOF/MS 中的定義。
13. 請寫出質量解析度（mass resolution）在 TOF/MS 中的定義。
14. 請寫出在 MALDI-TOF/MS 中影響所得到的訊號峰寬度的兩個主要因素以及可以何 種技術或方法來改善。
15. 請畫出（a）linear 及（b）reflectron MALDI-TOF/MS 的簡圖。
16. 請寫出基質的兩種主要功能，並畫出以下三種基質的結構式及標示出他們的全名：
α-CHCA，2,5-DHB 及 SA。
17. 請寫出使用 SA 及 α-CHCA 當基質時一般調配的濃度及其製備的過程。
18. 當你正在操作 Autoflux 質譜儀時，請問你如何確定你已經從你的樣品結晶中得到最
上機考試結果
附件五
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF) 提供在職訓練「人 才培訓課程」相關資料
項目 相關資料
1 質譜儀應用於發酵程序蛋白質變化之測定原理
2 實驗：以基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF）分析醱酵前後培養液成份
3 相關照片
質譜儀應用於發酵程序蛋白質變化之測定原理
2.1 基質輔助雷射脫附-飛行時間/質譜儀(MALDI-TOF/MS)原理介紹
質譜儀 (Mass Spectrometer, MS) 是一種用來量測離子（包括帶電荷的分子、原子或 分子碎片等） 質量的儀器，主要分為五大部分：(1)離子化器 (ionizer)、(2)質量分析器 (analyzer)、(3)偵檢器 (detector)、(4)訊號處理器 （電腦）(data processor)和(5)真空系統 (vacuum system)。當待測樣品在離子化器被離子化後，這些氣態離子首先被高電場進行加速 後進入質量分析器 (analyzer) 進行分離；之後依質荷比 (m/z) 的不同，在偵測器上被偵測 到；這些偵測到的離子訊號經電腦處理後，在圖譜上按照質/荷比 (m/z) 的大小依序列出來，
表示離子在樣品中的可能分佈情形。在質譜儀的操作中，質量分析器及偵測器必須處於極 低真空系統中，以防止離子在此分析過程中遭受空氣中各組成粒子的干擾；離子化器則視 分子游離的方法不同，而可能位於真空系統外。
以下的離子，而離子阱式則可進行多次的離子碰撞，以得到更多的離子碎片來幫助鑑定分 析樣品。本實驗所用的基質輔助雷射脫附-飛行時間質譜儀則是專為偵測氨基酸、多肽、多 醣體、蛋白質及高分子化合物等大分子而開發的。其離子化器是以基質輔助雷射脫附法來 產生離子，質量分析器則是根據離子飛行時間的長短來分辨離子質荷比的大小。以下將就 這兩項來詳細說明。
2.2 離子化器：基質輔助雷射脫附游離法（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI）
質譜儀中之離子源，依能量常可分成兩大類：
1.軟離子源 (soft source) — 圖譜中幾乎無碎片離子 (fragment ions)，僅包含分子離子峰及少 數 peak，可得知分析物分子量。
2.硬離子源 (hard source) — 高能量傳遞下所形成的離子，因位處高能階，故斷鍵形成碎片 離子 (fragment ions)，可藉此判斷官能基種類及分子結構，缺點是看不到分子質量。
質譜儀之離子源，若依方法可分成三大類：
1.氣相游離法 (gas phase ionization) — 樣品需先加熱揮發 (vaporize) 成氣相分子 (gas) 再 離子化，缺點為適用沸點 (b.p.) < 500℃以下的熱安定物 (質量範圍小於 1000Da)。
2.脫附游離法 (desorption ionization) — 引入不同形式的能量，使固體或液態樣品直接變成 氣體離子，優點為 (1)適用於非揮發性分子、易熱解分子、分子量大於 1000Da 以上之化合 物，(2)圖譜大為簡化，常只含分子離子峰或質子化的分子離子峰。
3.噴灑游離法 (spray ionization) — 以高電壓將液體噴灑出去並在噴灑過程中將分析物離 子化。也適用於非揮發性易熱解的分子。因為可形成多價離子，所以可分析的質量範圍從 數十到數萬 m/z。
綜合以上對離子化法的分類標準，我們大致可將現今的基質輔助雷射脫附游離法，因 其大部分提供分子離子峰 (M+H
+
) 的特性及基質的功用，可視為一種軟性脫附游離法。脫 附游離法又可分為直接雷射脫附法和基質輔助雷射脫附游離法。早期將高能雷射聚焦後，照到固體分析樣品表面，直接產生脫附游離的現象，稱之為直接雷射脫附法 (direct laser desorption, LD)。因沒有添加基質來扮演能量吸收的角色，其待測樣品本身常需具有吸收雷 射能量的特性。可分析的質量範圍小於 2000Da，大多數為數百 Da 左右的小分子；如果待 測樣品本身無法有效吸收雷射波長，則其能量須藉由探針 (probe) 的金屬基層 (substrate) 來進行吸收傳遞，在有限的吸收能力下以熱傳導方式提供能量給樣品分子。但是雷射波長 範圍內吸收效率及能量傳遞的速度有限，在能量輸入及相轉移的速度小於熱分解的速度的 情況下，常造成高分子分解，產生多種碎片離子而較難得到分子離子峰，直到引入基質之 後，才解決了大分子的氣化裂解的問題。
(1:10-1:50000)，經由溶劑揮發的乾燥過程，使分析物與基質形成晶體 (即共結晶)，當用脈 衝雷射照射晶體時，由於在結晶中，基質分子的數目遠較分析物分子為多，因此雷射能量 主要先由基質分子先吸收後，再將部分能量傳遞給其所環繞的分析物分子，這些受雷射能 量影響區域內的分子，在短時間內 (10－
12
~10－15
秒間) 被雷射能量迅速加熱而由固相直接昇 華形成氣相，在形成的高密度氣體中，據推測至少包括了光解離子反應 (Photoionization)、光化學反應 (Photochemical ionization) 及 分子-離子反應 (ion-molecular reaction)，並依樣品 的特性產生正離子或負離子，所產生的離子最後被選擇（＋或－）送進飛行時間質譜儀分 離偵測。MALDAI 所產生的質譜圖多為單質子加成的分子離子 (M+H
+
)，因而質譜圖中的 離子與多肽和蛋白質的質量有一一對應關係，另外，圖譜中常可觀察到與金屬鈉 M+Na+
、 金屬鉀 M+K+
所形成的加成物 (adduct) 分子離子峰和二聚物 (dimer) 離子峰。一般 MALDI 採用的鐳射波長通常為 337nm (N
2
鐳射，脈衝時間 1～5ns)、1064nm (Nd:YAG 雷射) 和 10.6nm (二氧化碳 CO2
氣體雷射)，鐳射功率通常為 5- 20W，每單位面積 上有效的雷射能量範圍限制在 106
～107
W/cm2
，但僅有 10~4W 的能量用於樣品的脫附和離 子化 (Desorption and ionization)，所以樣品的分解機率減小。圖 2. MALDI 離子化過程
MALDI 的優點：
1 圖譜簡單：背景雜訊低、不存在分析物離子的碎裂片段。
2 靈敏度高：極少量的樣品。
3 效率高：分析速度快。
5 可溶性: 可溶於樣品溶液中。
6 低的反應活性: 不與分析物反應，使質譜圖不複雜化。
許多具有共軛結構的芳香化合物很容易滿足以上 6 點的要求，如 2，5-二羥基苯甲酸
（DHB, 2,5-Dihydroxybenzoic acid,常用於肽 (peptide)、蛋白質 (protein)、碳水化合物 (carbohydrates) 分析）、芥子酸（SA, sinapinic acid,常用於 peptide、protein 分析）、α-CN-4-OH- 肉桂酸(HCCA, α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid 常用於 protein、carbohydrates 分析)等。
表一. 常用 MALDI 之 matrix(基質)
基質 簡寫 分子式 分子量 分子結構
3-Hydroxypicolinic acid 3-HPA C
6
H5
NO3
139.11N O
HO HO
3-Hydroxypicolinic acid
2,4,6 - Trihydroxyacetophenone 2,4,6-THAP C
8
H8
O4
168.15 CHO
OH OH O
CH3
Sinapinic acid
(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy- cinnamic acid)
SA C
11
H12
O5
224.22O
HO OH
O O
3,5-Dimethoxy-4-hydroxy- cinnamic acid
2,5-Dihydroxybenzoic acid 2,5-DHB C
7
H6
O4
154.12O OH HO
OH
2,5-Dihydroxybenzoic acid
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid α-CHCA (α-HCCA)
C
10
H7
NO3
189.17α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
OH N O OH
SDHB(2,5-Dihydroxybenzoic acid /2-Hydroxy-5-methoxybenzoic acid)
super DHB
2,5-Dihydroxybe nzoic acid
C
7
H6
O4
2-Hydroxy-5-me thoxybenzoic acid
C
8
H8
O4
154.03
168.04
O OH HO
2,5-Dihydroxybenzoic acid
OH
O HO
O HO
2-Hydroxy-5-methoxybenzoic acid
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid methyl ester
CNME
2.3 質量分析器-- 飛行時間質量分析器（Time-of-Flight, TOF mass analyzer）
飛行時間質量分析器，如其名稱所示，乃是根據離子由離子源離子化器飛行到偵測 器之時間來決定其質荷比。
3)，藉此來分別出不同質荷比的離子。由於記錄的是飛行時間，所以 TOF 分析器可分析分 子的質量數理論上是沒有上限的，因此適於質量動態範圍大的樣品，如蛋白質、多肽、核 酸和多醣體等生物大分子的研究。
除了上述的優點，飛行時間分析器也具有先天的缺陷，即其質量解析度會因為離子生 成時的時間分佈 (temporal distribution)、空間位置分佈及初始動能分佈的影響而變差。（1）
時間分佈的影響--因離子在離子源產生時，生成時間不同所致，若在質量、帶電荷、生成位 置及動能皆相同的情況下，則各離子將以其生成的時差到達偵測器，造成質量解析度降低；
一般而言，解決此誤差的方法為降低加速電壓或增加無場飛行管的長度來改善，或利用脈 衝式雷射來縮短生成時間，進而減少誤差。（2）空間位置分佈 (spatial distribution) 的影響 --由於某些離子的生成位置離加速電場出口較近，因加速距離較短，所獲得的動能相對較 小，容易造成到達偵測器的時間落後於其他相同質量同電荷但生成位置離加速電場出口較 遠的離子，欲改善這種情形可利用兩階段推出法 (two-stage extraction)，第一段先利用較低 的加速電壓聚焦，第二段才用較大的加速電壓將離子推出，以提高解析度。（3）起始動能 分佈 (initial kinetic energy distribution) 的影響--當相同質量及電荷值的離子，因起始動能分 佈的方向或大小不同，而具不同的總動能或飛行速度時會造成訊號峰變寬、解析度下降。
改善的方式除了上述數種方法（脈衝式的間歇性雷射光、兩階段推出法、增加飄移管長度(D)）
外，主要乃是利用遲滯聚焦 (delayed extraction) 來改善，即離子於離子源生成後並不立刻 施加推出電場來刻意延遲一段適當時間，使各離子能以其初始動能沿著飛行管軸線向離子 源出口端遠離或靠近，則離子生成時的初始動能分佈會轉變成空間位置分佈，如此再經由 兩段式推出法將其送入飛行管中，即可得到最佳解析度。另外還有一種改善方法為使用 reflector mode TOF (反射型，見圖三)，使帶有不同能量但相同質量 m 及電荷 z 的離子，因 撞擊反射電場 (reflectron) 的深度不同，能量較大者 (速度較快) 但其質荷相同者撞擊較 深、而較晚脫離出反射面，且飄移長度同時較長，因此恰好抵銷能量散佈，而使相同 m/z 值的離子聚集使得帶寬變窄。另外，利用 reflector mode TOF (反射型) 偵測 PSD (post source decay) 則是調整反射處 (reflectron) 的電壓，改變彼此之間能量差異微小的 PSD 離子之加 速度，使其在穿越 TOF 的時間剛剛好能得到分離微小 m/z 差異的最佳解析度，常能得到關 於結構訊息的質譜。
以本實驗所用的 MALDI-TOF/MS 來講，離子飛行模式可分為直線式和反射式兩種 (如 圖三所示），直線式的質量解析能力 (mass resolution, m/ m)△ 最高可超過 4000，而反射式 則可達 18000。不過對於大質量的分子離子(質量超過 8000)，一般多在直線模式下操作，因 為反射電場無法反射太大的離子。
圖 3. TOF 示意圖 (a)linear mode 直線型，(b)reflector mode 反射型。
註：離子 (質量 m 電荷 z) 的飛行時間 t 為其在加速場(長度 d)和飛行管(長度 D)中的 飛行時間之和： t=d(2m/zeV)
1/2
+D(m/2zeV)1/2
……..(1)或 (m/z)
1/2
=at+b…….………...(2) 即 m/z 值愈大，時間愈長。TOF（time of flight）mass analyzer 飛行時間質量分析器的特性：
1 質量分析範圍沒有限制 2 離子源易獲得
3 靈敏度高
4 掃描時簡短(μs) 5 構造簡單而耐用
Mode 優點： 缺點：
質量分析範圍大 解析度(力)差 Linear TOF(直線型)
靈敏度高
解析度(力)高 質量分析範圍小 Reflector TOF(反射型)
靈敏度差
(1) 極高的偵測質量範圍 可分析分子量高達百萬的分析物。
(2) 極高質量精確性(mass accuracy) 離子接近真實狀況。
(3) 極高的靈敏度(sensitivity) 最高可分析到 femtomoles (10
-15
) 甚至 attomole (10-18
) 濃度的分析物。(4) 極高的解析度(力)(resolution) 常可高達M/ΔM>10,000以上。
(5) 偵測時間極短 掃描時間μs，一天便可分析上百件樣品。
(6) 操作非常簡便 操作介面人性化，使用者易上手。
(7) 較低能量消耗 相對上優於須高溫加熱的 TS (熱噴灑離子化) 或 GC/MS。
(8) 低實驗花費 使用上分析溶劑體積大大地減少。
由於以上之特點，使 MALDI 短時間內就被商品化，並廣泛地使用於大分子樣品之分 析。
2.4 Bruker MALDI-TOF/MS 操作程序
步驟大綱：（一）記錄（二）選方法（三）校正（四）樣品（五）存檔
（一）記錄
1. 點選
2. 點選 → → 填寫使用手冊（記錄 使用日期、姓名、實驗室編號、使 用時間、鋼瓶壓力、氮氣 N
2(g)
壓力、真空度 Vacuum、雷射槍數 shot counts）。3. 先關閉高電壓：點選 → 在 High Voltage 中點選
4. 用拭鏡紙將 stainless steal target plate 四周擦拭乾淨以避免灰塵累積，造成自動手臂的拖 盤故障。
5. 打開退出拖盤：點選 或 按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
6. 放入 stainless steal target plate
7. 關回拖盤:點選 或 按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
8. 出現 Sample
9. 至 看真空度是否 OK! (因機器會處於休眠狀態，真空度 OK 後，要按〝打雷射〞，
高電壓才會開啟。)
14. 按 打雷射。
<待找到最佳的標準品圖譜>
（三）校正 15. 點選
16. 於 選擇已存在的適當標準品方法，
如:PeptideCalibStandard mono。
17. 於 選擇影像擴大比率，如：±0.5％。
一一點選標準品的 peak name → 會出現圖譜中該標準品的相關位置(ppm)→ 若圖譜 中存在該標準品成分 peak 時，於第一支正確 peak 上方點滑鼠左鍵→出現〝質量數〞及
〝箭號〞於該 peak 上方，例如: 。 18. 將所有符合的標準品成分勾選完。
19. 點選 (Error[ppm]最好小於±20；C
0
值800↓皆可接受，但以接近 200 為最好。)<當有更改到建議的參數時請另存方法檔 Save Method As 至自己的資料夾>
（四）樣品
20. 點選 →利用滑鼠點選 target 上〝樣品〞的位置。
21. 利用滑鼠 (1)調整雷射強度 及 (2)選擇不同位置的結晶 去尋找 sweet spot。
（五）存檔
22. 將圖譜存檔：按 選擇儲存位置 →
可於 更改存檔路徑資料夾；
中 key 入名稱會以一個資料夾的形式存在；
中 key 入檔案描述；
記得勾選Buffers□Single□Sum 儲存單一圖譜或總圖
→ 按 。
23. 填寫使用手冊（記錄結束時之時間、鋼瓶壓力、氮氣 N
2(g)
壓力、真空度 Vaccum、雷射 槍數 shot counts 等）。24. 打開拖盤:點選 或 按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
25. 取出 stainless steal target plate。
26. 關回拖盤:點選 或按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
＊軟體無需關閉 + 請勿關閉電腦＊
實驗：以基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF） 分析醱酵前 後培養液成份
實驗目的：利用基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀設備，分析醱酵前後培養液成份 的差異。
實驗儀器：
1. 基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF)：Bruker autoflex 2. 樣品盤（Target）：不銹鋼樣品盤 125 mm × 80 mm
實驗藥品：
1. 溶劑：50% TA (TA=ACN：0.1% TFA 1：2) 2. 標準品溶液：40 fmol Cytochrome C、Myoglobin 3. 基質：20 mg/ml Sinapinic acid
4. 樣品：醱酵培養液 實驗操作步驟：
1. 樣品盤清洗：先以清潔劑清洗，去離子水沖洗擦拭，再以甲醇沖洗擦拭，並以氮氣吹 乾樣品盤。
2. 將配製好的基質溶液及標準品溶液分別以微量吸管各取 10μl，並將兩者於樣品瓶中充 份混合，取此混合溶液 1 μl點在樣品盤上，將樣品盤送入具真空乾燥能力的樣品製備 器內將溶液中溶劑迅速揮發，使標準品與基質分子在樣品盤上形成共結晶。
3. 將配製好的樣品、基質溶液分別以不同比例充份混合，並取1μl的混合物點在樣品盤 上，同樣的將樣品盤送入具真空乾燥能力的樣品製備器內將溶液中溶劑迅速揮發，使 分析物與基質分子在樣品盤上形成共結晶。
4. 最後將樣品盤送入質譜儀中進行分析。
儀器操作步驟：
填寫使用記錄表 點選軟體 按 退出托盤 放上樣品盤
按 送入托盤 開起高電壓 選擇分析方法 點選樣品結晶處施以雷射
儲存圖譜 關高電壓 按 退出托盤 取出樣品盤 填寫使用記錄表 清洗
樣品盤
儀器：基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀（MALDI-TOF/MS）
日期： 年 月 日
姓名：
相關照片
附件六
基質輔助雷射脫附游離法–飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF) 標準操作程序相關
資料
項目 相關資料
附件六之一 MALDI-TOF 標準操作程序
附件六之二 MALDI-TOF 離子源清理標準操作程序 附件六之三 MALDI-TOF 幫浦換油標準操作程序
MALDI-TOF 標準操作程序
記錄
點選
點選 → → 填寫使用手冊（記錄 使用日期、姓名、實驗室 編號、使用時間、鋼瓶壓力、氮氣 N
2(g)
壓力、真空度 Vacuum、雷射槍數 shot counts）。 先關閉高電壓：點選 → 在 High Voltage 中點選
用拭鏡紙將 stainless steal target plate 四周擦拭乾淨以避免灰塵累積，造成自動 手臂的拖盤故障。
打開退出拖盤：點選 或 按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
放入 stainless steal target plate
關回拖盤:點選 或 按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
出現 Sample
至 看真空度是否 OK! (因機器會處於休眠狀態，真空度 OK 後，要按〝打
選方法
選方法：點選 <出現 System READY 亮綠色>
點選 選擇質量偵測範圍 → 利用滑鼠移動橫軸。
點選 → 利用滑鼠點選 target 上〝標準品〞的位置。
利用滑鼠(1)調整雷射強度(由低至高)及(2)選擇不同位置的結晶。
按 打雷射。<待找到最佳的標準品圖譜>
校正
點選
於 選擇已存在的適當標準品方
法，如:PeptideCalibStandard mono。
於 選擇影像擴大比率，如：±0.5％。
一一點選標準品的 peak name →會出現圖譜中該標準品的相關位置(ppm)→ 若圖譜中存在該標準品成分 peak 時，於第一支正確 peak 上方點滑鼠左鍵→
出現〝質量數〞及〝箭號〞於該 peak 上方，例如: 。
將所有符合的標準品成分勾選完。
點選 (Error[ppm]最好小於±20；C
0
值800↓皆可接受，但 以接近 200 為最好。) <當有更改到建議的參數時請另存方法檔 Save Method As 至 自己的資料夾>
樣品
點選 →利用滑鼠點選 target 上〝樣品〞的位置。
利用滑鼠 (1)調整雷射強度 及 (2)選擇不同位置的結晶 去尋找 sweet spot。
【標準操作步驟】
1. 關電腦。
2. 關 MALDI-TOF 儀器上的鑰匙。
3. 關 MALDI-TOF 儀器後 pump 的 power。
MALDI-TOF 離子源清理標準操作程序
中 key 入檔案描述；
記得勾選 Buffers□Single□Sum 儲存單一圖譜或總圖
→ 按 。
填寫使用手冊（記錄結束時之時間、鋼瓶壓力、氮氣 N
2(g)
壓力、真空度 Vaccum、雷射槍數 shot counts 等）。
打開拖盤:點選 或 按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
取出 stainless steal target plate。
關回拖盤:點選 或按機殼上的 IN/OUT 按鈕。
＊ 軟體無需關閉 + 請勿關閉電腦＊
4. 關機 20 分鐘後才可開始清理儀器。
5. 打開 MALDI-TOF 儀器兩旁的門及拆下方的蓋子。
6. 破真空，卸下 4 個位於底部的螺絲，慢慢卸不可過快，直到” 斯斯 聲” 沒了，即可卸下。
7. 戴上手套。
8. 將 轉開，慢慢卸下。
9. 將鐵板降下一半時，先將高壓線頭拔出，避免斷掉。
10. 以 Isobutyl Alcohol 或無水酒精擦拭。
13. 關上鐵板時 ，注意高壓線是否有脫落，之後再將 螺絲平均稍微上鎖，待抽真空後經大氣壓力將鐵板往上升壓緊，再 將螺絲鎖緊。
14. 開 MALDI-TOF 儀器後 pump 的 power。
15. 開 MALDI-TOF 儀器上的鑰匙。
16. 開電腦。
17. 此時抽真空，再次轉緊螺絲。
18. 由電腦觀看電壓的狀態。
19. Start Programs Bruker Daltunics Utilities Flex Service
Analog in GTOF 可觀察電壓狀態。
20.開機後須等真空度達標準才可開始使用。
【標準操作步驟】
從電腦上關幫浦破真空，點 Vacuum 中 Source 的 Vent 來破真空，
等待約 20 分鐘再換幫浦油。
MALDI-TOF 幫浦換油標準操作程序
拆掉幫浦下方 4 顆螺絲。
拆掉幫浦上的管子。
取出幫浦，並墊高幫浦方便換油。
以六角板手慢慢轉開幫浦下方的螺絲，使 油慢慢流出。
當油穩定流出，再以一字起子轉開上方紅色螺絲，加快油的流出速 度。
當油完全流出後，再加入少許新油，使舊油更完全的流出。
最後倒入新油，直到油達到視窗的一半即可(約 400ml)。
之後將幫浦放回原位、接上管子、鎖回螺絲、電腦上開幫浦抽真空，
點 Vacuum 中 Source 的 Evac. 來抽真空，等待約幾小時再使用機
器。
【注意事項】
1. 當油霧過濾器油太多時，需更新或拆下擦拭乾淨在裝回，避免油霧 無法排出造成漏油現象。
2. 拆卸方式：
不用關機即可拆油霧過濾器。
拆除油霧過濾器兩端的管子。
慢慢對稱的除去油霧過濾器上四顆螺絲。
以衛生紙將油霧擦拭乾淨。
油霧過濾器兩端的管子、白色過濾網以吹風機將油吹出，
以衛生紙墊在下方以便將吹出的油馬上吸走(約 1 小時)。
當白色過濾網上的油大都吹出後即可裝回，裝回不易須小
第二子計劃：天然物活性確效領域教學品質提昇計畫。(執行單位：理工學院生技所) 附件七 生技產業特論開課實施方式及教學方法
開課課號【7222】
生技產業特論 94 學年第 1 學期修課學生清單
學號 系所 班級 姓名
9432601 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 黃文軍 9432602 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 江佳典 9432603 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 簡逸晢 9432604 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 謝耀文 9432605 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 胡曉菁 9432606 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 鄭雨薰 9432607 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 王昭翔 9432608 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳科如 9432609 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 王振宏 9432610 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 張政鴻 9432611 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳志榮 9432612 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 姜為棟 9432613 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 鍾依涵 9432614 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 楊智凱 9432615 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳春玲 9432616 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳冠余 9432618 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 王嬿甄 9432619 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 李啟安 9432620 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 高唯敏
共有19位學生
附件八-1 生技產業特論課程授課師資及授課大綱
朝陽科技大學 生物技術研究所 生物技術產業特論課程大綱
日期 上課教師 題目
09/15 李孟真 序論
09/22 柯俊良 生產真菌類免疫調節蛋白之產程及產品開發
09/29 張清安 無特定病原種苗在現代農業上之重要性與應 用
10/06 高穗生 微生物殺蟲劑簡介
10/13 王強生 植物代謝工程與代謝基因體學 10/20 方世華 免疫學在生物技術產業之應用 10/27 柯俊良 癌症及其療法
11/03 林俊義 藥用菇類之生產與利用
11/10 呂秀英 生物資訊學在生物技術產業之應用及發展 11/17 李孟真 期中考
11/24 鄭如茜 基因重組技術在醫藥生物技術產業的應用 12/01 鄭櫻慧 植物基因轉殖之應用
12/08 曾經洲 蘇力菌的研發
12/15 高清文 微生物殺菌劑之概論
12/22 蔡新聲 值得產業發展的農業生物技術
12/29 蔣慕琰 植物檢測 DNA 標記之應用
1/5 (5-7 節) 莊順興* 環境生技產業
附件八-2 生物技術產業特論上課講義(版權為各老師所有 僅附上各講義第一張)
附件九 分子與細胞生物學開課實施方式及教學方法 開課課號【7226】
學號 系所 班級 姓名
9332607 生物技術研究所碩士班 二年 A 班 廖述麟
9432601 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 黃文軍
9432602 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 江佳典
9432604 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 謝耀文
9432605 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 胡曉菁
9432606 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 鄭雨薰
9432607 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 王昭翔
9432608 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳科如
9432609 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 王振宏
9432614 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 楊智凱
9432615 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳春玲
9432616 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 陳冠余
9432618 生物技術研究所碩士班 一年 A 班 王嬿甄
共有 13 位學生
附件十-1 分子與細胞生物學課程授課師資及授課大綱
朝陽科技大學 生物技術研究所 分子與細胞生物學 課程大綱
date title 授課老師 課程 Suggested reference
09.14 大綱 李孟真
1. 基礎生化: Nucleic acids and Proteins
2. 遺傳及微生物學:mitosis and meiosis
3. central dogma 4. Geneic code 5. gene function
6. Components of gene expression
自編教材
09.21
分子生物學 技術
陳靖棻
1. gel electrophoresis, 2-D electrophoresis
2. ion-exchange
chromatography,gel filtration chromatography
3. autoradiography, phosphoimaging
4. liquid sccitilation counting 5. southern, northern, Western 6. sequencing
7. RE mapping 8. Eliza
9. yeast 2 hybrid,
immunoprecipitation…..(see Weaver)
Weaver, chapter 5
09.28
分子生物學 技術
陳靖棻
1. 基因選殖之設計 2. 基因定位與據圖選殖 3. material used: enzyme,
vector
Weaver chapter 4
1. The organization and packaging of chromosomal
date title 授課老師 課程 Suggested reference 3. DNA repair and
recombination
4. homologous recombination 5. application of Recombinant
DNA
10/12
原核生物轉 錄
鄭如倩
1. 小考 2. Operon
3. DNA-protein interaction
Weaver, chapter 6-9
10/19
真核生物轉 錄
鄭如倩
1. Promoters
2. general transcription factors 3. transcription factors
4. transcription regulation and post-transcriptional
regulation
5. RNA synthesis and processing
Weaver, chapter 10-13
10/26 蛋白質體學 柯俊良
1. protein synthesis and sorting
2. proteomics 自編教材 11/02 基因體學 王強生 Structure of eukaryotic genomes 自編教材 11/09 基因體學 王強生 plant genomics 自編教材
11/16
植物功能性 基因體學
王強生 plant genomics 自編教材
11/23 病毒學 鄭櫻慧
1. classification
2. structure and biology 3. genome organization and
expression。
自編教材
11/30 總復習+考試 李孟真
1. Golgi complex
2. Protein glycoslation The world of the
date title 授課老師 課程 Suggested reference 子, junctions
細胞骨架 訊息傳遞-1
hyaranic acid 2. cytoskeleton 3. integrin
4. MMP tight junction, gap junction, desmosome
of the Cell, by Alberts et al.
12/21 訊息傳遞-2 李孟真
mode of action (cell communication slides) receptors types: membrane, nuclear growth factors G proteins: viagra Ras/raf MEK Transcription factors Nuclear translocation Paracrine, autocrine
12/28 細胞分裂 李孟真
1. phases, cytoskeleton, telomere 2. mitosis and meosis
3. G1 S G2 M 4. Checkpoint 5. Cdk, cyclin, EF 6. Rb, P53 Meiosis
1/04
癌症之分子 生物學
李孟真
1. oncogene (element of the signal transduction): growth factors, receptor mutation, plasma membrane G protein, transcription factor, cyclin, 2. tumor suppressor defect: P53,
Rb,
3. multiple hit, care-taker and gate keeper telomere 1/11 總復習+考試 李孟真
附件十-2 分子與細胞生物學上課講義 (版權為各老師所有 僅附上各講義第一張)
附件十一 腎絲球細胞之培養
朝陽科技大學 生物技術所 應用生物醫學實驗室 Cell lines re-culture
CP-001-1
Establish date: 2005/04/13 Latest version date: 2005/04/13
說明:
此 protocol 是將冷凍保存的 cell lines 解凍再培養的操作過程，內容主要是操作 SV40 MES 13 細胞株的材料。
設備及儀器 水浴槽 藥品及器材 藥品
SV40 MES 13 medium (see SOP CM-001) 器材
plate
glass tip with sterile 步驟
*過程需要在細胞培養室無菌狀態下操作(lamina flow；無菌操作台) Sterile=滅菌過未拆封或只在 lamina flow 開過的 (#)
接近小管管蓋。
(4) 細胞融化後，以 75％酒精消毒擦拭乾淨，移入細胞培養室。
2. Re-culture 冷凍細胞*
(1) 將準備好的 medium 及細胞移入無菌操作台。
(2) 取出適量培養基加到培養皿上。
(3) 緩慢的將已解凍的細胞加入培養皿內，並混和均勻。
(4) 將培養皿放入 37℃，5％ CO2 培養箱培養。
3. 可於培養 3 小時後觀察細胞貼附情形。
4. 第二天確定細胞貼附、生長良好後，可去除含有 DMSO 之培養基，更換新鮮之培養基。
附件十二 腎絲球細胞之繼代
朝陽科技大學 生物技術所 應用生物醫學實驗室 Passages of cell lines
CP-002-1
Establish date: 2005/04/13 Latest version date: 2005/04/13
說明:
此方法是將 SV40 MES 13 細胞株繼代培養的操作過程，當細胞生長覆蓋滿培養皿 後，即可進行繼代培養。
設備及儀器 水浴槽
離心機(可離心 50ml 離心管) 藥品及器材
藥品
SV40 MES 13 medium (see SOP CM-001)
Trypsin-EDTA (Sigma T4049)
PBS (Sigma P3813)
器材 plate
glass tip with sterile
5. 準備材料(若不足)
(1) 使水浴槽預熱至 37℃。
(2) 將事先分裝好冷凍之培養基(see SOP CM-001)、Trypsin-EDTA 取出。
(3) 置於水浴槽回溫並使用 75％酒精消毒擦拭乾淨，移入細胞培養室。
6. 繼代培養*
(1) 使用 suction 沿著邊緣將培養皿上的 medium 去除。
(2) 加入適量 PBS，使其覆蓋滿培養皿，去除到殘餘的 medium，並用 suction 沿著邊緣 將培養皿上的 PBS 去除。
(3) 加入少量 Trypsin-EDTA(0.5-2ml)使其覆蓋滿細胞，靜置 3 分鐘，使用顯微鏡觀察細 胞脫落之情形。
(4) 細胞完全脫落後，加入等量 medium 與其混合，並使用 glass tip 將細胞取出，放入 乾淨之 50ml 離心管。
(5) 將離心管以 1000rpm、5 分鐘離心後，使用 suction 沿著邊緣將上清液去除。
(6) 再加入少量 medium 將沈澱之細胞輕輕沖散。
(7) 依照比例將細胞平均分散至 3 個 plate，並加入適量 medium。
(8) 將培養皿放入 37℃，5％ CO2 培養箱培養。
附件十三 腎絲球細胞之保存
朝陽科技大學 生物技術所 應用生物醫學實驗室 Storage cell lines in liquid Nitrogen
CP-003-1
Establish date: 2005/04/15 Latest version date: 2005/04/15
說明:
此方法是將 SV40 MES 13 細胞株繼代培養的操作過程，當細胞生長情形良好，活力 正常且覆蓋滿培養皿後，即可進行繼代培養。
設備及儀器 水浴槽
離心機(可離心 50ml 離心管) 藥品及器材
藥品
SV40 MES 13 medium (see SOP CM-001)
Trypsin-EDTA (Sigma T4049)
PBS (Sigma P3813)
DMSO (Sigma D8418)
器材
glass tip with sterile
Sterile=滅菌過未拆封或只在 lamina flow 開過的 (#) 7. 準備材料(若不足)
(1) 使水浴槽預熱至 37℃。
(2) 將事先分裝好冷凍之培養基(see SOP CM-001)、Trypsin-EDTA 取出。
(3) 置於水浴槽回溫並使用 75％酒精消毒擦拭乾淨，移入細胞培養室。
8. 準備冷凍保存液(可事先準備存於 4℃下備用)
(1) 使用 MES 13 之培養基(包含 DMEM、F12、FBS 與 PSN)：DMSO = 93:7 (2) 混合均勻後，使用 Filter 過濾備用。
9. 細胞冷凍保存*
(1) 使用 suction 沿著邊緣將培養皿上的 medium 去除。
(2) 加入適量 PBS，使其覆蓋滿培養皿，去除到殘餘的 medium，並用 suction 沿著邊緣 將培養皿上的 PBS 去除。
(3) 加入少量 Trypsin-EDTA(0.5-2ml)使其覆蓋滿細胞，靜置 3 分鐘，使用顯微鏡觀察細 胞脫落之情形。
(4) 細胞完全脫落後，加入等量 medium 與其混合，並使用 glass tip 將細胞取出，放入 乾淨之 50ml 離心管。
(5) 將離心管以 1000rpm、5 分鐘離心後，使用 suction 沿著邊緣將上清液去除。
(6) 再加入適量冷凍保存液將沈澱之細胞輕輕沖散。
(7) 依照比例將細胞平均分散至冷凍小管，每管約 1ml。
(8) 將小管置於冰上 10 分鐘，再移至-4℃約 2 小時，再移至-80℃隔夜，最後再放到液 態氮桶中貯存。
附件十四-1 「儀器使用及示範說明會」照片及講義
附件十四-2 「儀器使用及示範說明會」照片及講義
附件十五 「儀器使用及示範說明會」實際出席人員名單
附件十六-1 購置儀器設備清單
九十四年度教育部補助「提昇系科教學品質專案計畫」購置設備儀器 設備
儀器 名稱
迴轉式切片機 (rotary microtome)
廠
牌 Leica 型 號 RM2125
購置
日期 94.11. 數 量 1
主要 規格
1. 石蠟切片機, 可切片厚度含 1-30uM, 標本座可微調方向, 含切片刀, 丟棄式切片組, 2. 含集屑托盤 附精密烘箱 1 , 定溫烘箱 1,加熱板 1.
主 要 用
1. 配合本計畫改善「生物醫學實驗室」 ，為基礎及擴大化發酵培養一貫操作場地。
2. 提供大學部生物材料實驗之用。
3. 支援生物技術專長教師專題研究。
附件十六-2 購置儀器設備清單
九十四年度教育部補助「提昇系科教學品質專案計畫」購置設備儀器
設備儀 器名稱
正立螢光顯微鏡 含 CCD 影像 擷取系統 (compound
fluorescence microscope and camera image capture system) 廠
牌 蔡斯 型 號 Axio Imager
購置日
期 94.11. 數 量 1
主 要 規 格
1. 顯微鏡機台: 含濾片空槽可放入濾片。含色溫校正濾片。本體含側邊分光的影像 擷取光路，同時至少可用兩台相機接收影像。需附防塵罩
2. 螢光顯微鏡機台 : 反射與螢光光路，含濾片轉盤組及強光擋板 含減光濾片組 3. 雙目折疊式照相鏡筒: 含照相與觀察分光。
4. 機械式載物台與物件夾。
5. 4 倍物鏡: Achro-PLAN 等級 (或等同品)以上
6. 40 倍油鏡: 大口徑(M27)高對比(EC) PLAN-NEOFLUAR(或等同品)孔徑值達 0.75
7. 10 倍接目鏡一對
8. 消色差及球差聚光鏡 NA>=0.9。
9. 50 瓦螢光光源組 10. 鹵素光源組
11. 螢光濾片: 激發波 450 到 490nm 放射波 515 到 565nm(或等同品) 12. 螢光濾片 激發波 546/12 放射波 575 到 640nm(或等同品)
低溫數位 CCD 照相系統含軟體及轉接環：解析度達 140 萬畫素以上(含)。畫素尺寸 為 6.45 x 6.45 μm以上(含)。傳輸速率 14 bit/10MHz 以上(含)。雜訊比小於 10 e rms。
Dynamic range 大於 1700:1(含)。Peltier cooling 冷卻器 60N 介面 C-mount 轉接環(或 等同品)。軟體所需功能：背景修正、長度周長角度量測、置放比例尺、可完整驅動 CCD 攝影槍，可自動測光拍攝。含軟體安裝。
主要 用途
