行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
台灣北部沿岸海域中海綿附存型和浮游型發光細菌之多樣
性
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2313-B-002-060- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學海洋研究所 計畫主持人： 謝文陽 計畫參與人員： 林育德、邱秀慧、范嵐楓、劉東岩、吳俊毅 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 8 月 31 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
■ 成 果 報 告
□期中進度報告
台灣北部沿岸海域中海綿附存型和浮游型發光細菌之多樣性
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：
NSC 93-2313-B-002-060
執行期間： 93 年 08 月 1 日至 94 年 07 月 31 日
計畫主持人：謝文陽教授
共同主持人：
計畫參與人員：林育德、邱秀慧、范嵐楓、劉東岩、吳俊毅
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計
畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：台灣大學海洋研究所
中 華 民 國 94 年 8 月 18 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫編號: NSC 93-2313-B-002-060 執行期限: 93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 主持人: 謝文陽 執行機構及單位名稱: 台大海洋所 一、中文摘要 本研究在台灣北部沿海不同地區採集了海 水和海綿樣本，針對這些樣本所含發光細菌進 行了計數及分離。平板計數結果顯示，有八個 海綿樣本發光細菌之生菌數介於104~105 CFU/g wet wt，其他樣品生菌數大多小於 102 CFU/ml 或 CFU/g wet wt。發光細菌和異營細菌生菌數 比值，除三個海綿様本超過9% (9.0%~18.2%)， 其他都小於百分之五。 從各類樣本分離出之發光細菌共計41 株，這些 分離株都是屬於需鹽性兼性嫌氣性革蘭氏陰性 桿菌，都可歸類為弧菌科(Vibrionaceae)菌種。 分離株依其在 4°C、40°C 與 8%NaCl 的增殖情 形，及是否利用甘露醇或蔗糖為唯一碳源特 性、可粗分為六群。經16S rRNA 基因序列分析 比對發現，第一菌群代表株之最相似菌種為 Photobacterium leiognathi (相似度 99.4%)。其餘 五群代表株都與 Vibrio herveyi 或其近緣種，具 有 98%以上序列相似度；它們的表型特性也都與 Vibrio herveyi 吻合。利用 HhaI、DdeI、RsaI 和 ScaI 四種限制酶於 16S rDNA 限制型分析， 可將六群菌株區分為二個 16S rDNA 基因型 群 ， 第 一 菌 群 菌 株 與 其 最 相 似 菌 種 Photobacterium leiognathi 都 屬 於 第 一 個 基 因 型，第二至第六菌群菌株與 Vibrio herveyi 都屬 於第二個基因型。研究結果顯示，台灣北部沿 岸 海 水 中 發 光 菌 的 菌 種 組 成 不 外
Photobacterium leiognathi 和 Vibrio herveyi 或其
近緣種。海綿共存發光菌則以 Vibrio herveyi 或 其近緣種為主。
Abstract
Enumeration and isolation of luminous bacteria from seawater and sponges collected from the coastal regions of northern Taiwan were performed in the present study. Plate counts indicated that luminous bacteria in
mostly sponge samples (8 out of 13) were in the range between 104 and 105 CFU/g wet wt; others were less than 102 CFU/ml or CFU/g wet wt. Luminous bacteria accounted for 9.0 to 18.2% of heterotrophic bacteria in some sponge samples (3 out of 13), while only less than 5% of heterotrophic bacteria in the other samples were found to be luminous.
Forty-one strains of luminous bacteria were isolated. All of them were halophilic, facultatively anaerobic, Gram-negative rods, and could be identified as the family of
Vibrionaceae. According to morphological and
physiological characteristics, these isolates were divided into six groups. The first group had the highest similarity with
Photobacterium leiognathi (99.4%). The other
5 groups had higher than 98% similarity with Vibrio harveyi or its closely related species. It was found that these V. harveyi or its closely related species and P. leiognathi represented the entire luminous bacterial flora in the shallow coastal waters of Taiwan during the sampling period. The sponge-associated luminous bacteria were predominated by
Vibrio harveyi or its closely related species.
二、緣由與目的 細菌和真核生物都包含具有發光能力的種 類，發光細菌的發光反應，係藉由細胞所含發 光酵素（luciferase）之催化，進行氧化長鏈醛 類所產生的結果，反應物另包括氧氣與核黃素 單磷酸（riboflavin monophosphate, FMNH2），反 應 後 發 出 波 長 約 為 490 nm 之 黃 綠 色 冷 光 （Hastings, 1985）。 現知具有發光能力的細菌不到十種，包
括：Vibrio harveyi、 Vibrio fisheri、 Vibrio logei、
Photobacterium lreiognathi 、 Photobacterium phosphoreum、 Shewanella hanedai、 Shewanelli woodyi、 Photohabdus luminescens。另外，屬於 Vibrio cholerae 、 Vibrio mediterranei 、 Vibrio orientalis 、 Vibrio splendidus 、 Vibrio salmonicida、Vibrio vulnificus 等菌種的一些特例
性菌株，也曾被檢測出具有發光能力（Baumann & Baumann, 1984; Baumann & Schubert, 1984; Baumann et al., 1984; Caccamo, 1999; Fidopiastis
et al., 1999; Makemson et al., 1997; Satomi et al.,
2003）。Photohabdus luminescens 是一種共生於 土壤線蟲 Heterorhabditis bacteriophora 腸道內 的發光細菌，其他種類發光細菌則都是屬於海 洋原生細菌。現知發光細菌都是屬於具有運動 能 力 的 異 營 性 革 蘭 氏 陰 性 桿 菌 ， 根 據 16S rDNA 鹽基序列比對重建之親緣系統顯示，它們 都是屬於γ-Proteobacteria。 有些發光細菌已被開發利用於作為毒物污 染檢測的指標生物。例如利用 P. phosphoreum 進行微毒性試驗（microtox test），即是一個已經 實 用 化 的 生物 檢 測法（McFerts et al., 1983; Plotkin & Ram, 1984; Ribo & Kaiser, 1983; Ribo
et al., 1985）。發光細菌之能被用於作為污染檢 測之指標生物，是因為發光細菌的發光強度對 毒性物質具敏感性；研究顯示，環境中毒物濃 度與菌株發光強度呈線性相關，毒物濃度愈 高，菌株發光強度愈弱（Perego et al., 2002）。 海洋發光細菌依其生態棲位（niche），可分 為浮游、附存（含附著、寄生、腐生）、共生等 類型。浮游型海洋發光細菌的地理分布受水 溫、鹽分、日照等環境因子之影響，且其密度 低於其他生態棲位發光細菌之密度(Nealson & Hasting, 1991）。附生型發光細菌常附著於海洋 動物體表造成養殖魚蝦或人類病原菌的來源 （Caccamo, 1999; Hastings, 1976; Moriaty, 1998; 揭，1993；張，1995）。寄生型發光細菌，有些 除了寄生於南極蝦等甲殼類和一些外洋中深層 性魚類體表的發光細菌，往往於寄主死後迅速 生長，隨而出現明顯發光現象（Wada et al., 1995），另外尚有些寄生型發光細菌的發光，則 容易導致寄主（如南極蝦和一些中深層性魚類） 被魚類補食；一同被攝入魚類腸道的發光細 菌，不只能生存，還能藉此機會，在魚之腸道 內生長繁衍，成為宿主腸道內共生細菌（Ruby & Morin, 1979）。共生型發光細菌常居住於特殊發 光器官，除可幫助宿主招來偶伴，並可具驚嚇 與驅退補食者，或誘捕可作為餌料之生物的作 用。有證據顯示魚類和頭足類發光器官中之共 生發光細菌，並非得自親代傳承，而是子代於 成長過程中，從環境海水中獲得（Wada et al., 1999）。 海綿是粗具組織分化層級的濾食性動物， 在其濾食過程中，常會從外界攝入大量微生 物；隨著攝入微生物之定棲和生長，海綿與微 生物間形成所謂' 'sponge-microbe associations ''。已知這類海綿和微生物結合體所含原核生物 種類相當多樣，包括古生菌、光合性和化學合 成性自營細菌、以及形形色色好氣性和兼性嫌 氣性異營細菌（Shieh & Lin, 1994; Vacelet et al., 1996; Victoria et al., 2002），都可在海綿體找 到，然而有關海綿附存發光細菌多樣性之研究 仍然闕如。 本計畫擬於台灣北部沿岸海域採集各類型 海綿樣本，進行其附存發光細菌生菌數和種多 樣性之探討。為了比較海綿附存型及浮游型發 光細菌多樣性之異同，本計畫也擬同時針對台 灣北部沿岸海水中浮游型發光細菌，進行生菌 數和種多樣性之探討。 三、結果 1.發光細菌之生菌數 本研究於春、夏月份(四至九月)在宜蘭、東 北角、八斗子及基隆中油場旁各採集了一次海 水樣本，並在淡水及卯澳灣共採集了13 個海綿 樣本。以PY 平板計數法估得這四處樣區海水的 發光細菌生菌數為7-250 CFU/ml，其中只有一 次宜蘭的生菌數高達250 CFU/ml。一般而言， 海水中浮游性發光細菌的生菌數約占總異營菌 數的 0.5-2.5%。由海綿之潤洗液經稀釋後塗抹 於 PY 平板培養基上所估得海綿體表之發光細 菌生菌數為1.2×103-7.7×105 CFU/g wet wt，二樣
區各有二個海綿樣本無觀察到發光細菌。概言 之，海綿體表之發光細菌生菌數約占總異營細 菌數量的1.2-18.2 %。 2.發光細菌菌株之分離和收集 從七次計數用海水中發光菌生菌數的培養 基中分離了發光菌株共 18 株，從 13 個海棉樣 品計數發光菌的培養基分離了發光菌有23 株。 研究期間共篩選出41 株發光細菌，將甚培養於 PY 平板培養基上，其發光現象約可維持數小時 至數十天，其強度會漸轉弱至內眼無法觀察， 在繼代培養的過程中，計有 9 株分離株失去其 發光特性。 3.發光菌菌株之特性檢測和分群 所分離出來的41 株分離菌，皆為無色圓形 菌落，具運動能力的革蘭氏陰性桿菌，觸酶與 氧化酶為正反應，洋水水解酶為負反應，能以 半乳糖、葡萄糖、甘露糖為唯一碳源，但纖維 二糖、乳糖、衛矛醇、肌醇、木糖則無法作為 唯一碳源，能發酵葡萄糖、甘露糖產酸，在不 含納鹽的培養基中無法生長。依其在4°C、40°C 與 8%NaCl 的增殖情形，及是否利用甘露醇、 蔗糖為唯一碳源特性、將其區分為六群，第一 群包含 5 菌株，此群是六群中唯一無法利用甘 露醇(mannitol)者；第二群僅含一株，是唯一可 生長於 4°C 之分離株；第三群所含之唯一菌株 特性與第一群之區分為利用甘露醇當作唯一碳 源能力。第四群含13 菌株在 4°C 與 40°C 皆不 能生長。第五群包含 6 株分離株可在 40°C 生 長，但無法發酵蔗糖產酸。第六群含16 菌株能 在40°C 生長，且具有發酵蔗糖產酸之特性。 4.發光細菌分離株之 16S rRNA 之序列分析 所獲得各菌群代表株的 16S rRNA 序列長度介 於 1426-1446 個鹼基之間。經由與 GenBank 現 存菌株16S rRNA 序列資料比對，其結果如下: 第一群代表株定出鹼基長度 1433bp，經比對結 果，最相似菌種為屬於發光菌屬(Photobacterium) 中有發光特性的 P. leiognathi (ATCC 25521T)， 相似度為99.4%。 第二群僅含一菌株定出鹼基長度為1427 bp，經 比對結果，最相似菌種為無發光特性的 Vibrio campbellii，相似度為 99.9%，而與弧菌屬中的 發光細菌 V. harveyi 相似度為 99.2%。 第三群只含一分離株，其最相似菌種為無發光 特性的 Vibrio alginolyticus 相似度為 99.2%，而 與弧菌屬中的發光細菌 V. harveyi 相似度為 98.5%。 第四群共包含13 菌株代表株之最相似菌種為無 發光特性的 Vibrio natriegens，相似度為 98.9%， 而與弧菌屬中的發光細菌 V. harveyi 相似度為 98.2% 第五群其代表株之最相似菌種為 V. campbellii， 相似度為 98.9%，而與弧菌屬中的發光細菌 V. harveyi 相似度為 99.1%。 第六群之代表株之最相似菌種為 V. campbellii， 相似度為 99.4，與發光菌 V. harveyi 相度為 98.9%。 4.發光細菌分離株之 16S rRNA 之限制型分析 將所有完成表型及 16S rRNA 序列分析的 發光細菌分離株經過 16S rRNA (約 1.5kp)的 PCR 的增幅及純化後，利用四種限制酶進行限 制型分析，經由 HhaI、DdeI、RsaI 和 ScaI 四種 限制酶剪切（或模擬剪切）後，由限制型可分 為二基因型，僅第一群菌株之基因型屬第一基 因型，第二至第六菌群之菌株皆屬於第二基因 型。 5.發光基因的偵測 本 研 究 利 用 已 知 發 光 菌 Photobacterium leiognathi 所設計之發光基因(LuxA)引子，可以 將第一菌群之發光基因利用PCR 增輻而以電泳 膠檢測出，另外第二至第六群的菌株則可以由 Vibrio harveyi 之發光基因序列所設計的引子檢 測，受測菌株之基因片段，會出現在電泳膠 400~500 bp 位置。 四、討論 發 光 細 菌 之 細 胞 懸 浮 液 密 度 須 達 到 107 CFU/ml 時，菌體才能發出生物光，而海洋中自 由 生 存 之 發 光 細 菌 ， 因 密 度 大 多 低 於 102 CFU/ml ， 並 未 能 達 到 發 光 之 最 低 之 菌 量 (Greenberg, 1997)。本研究估得台灣北部海水樣 本中發光細菌數均小於102 CFU/ml，符合海海 微生物學者之認知而生物樣本之菌量，最亦不 多於106 CFU/g wet wt，因此，所有樣本並無法
直接觀察到發光現象之產生。 第一群的細菌是本實驗中唯一無法利用甘 露醇之分離株，代表株之之比對結果顯示，與 P. leiognathi 最為近緣，其相似度高達 99.4%。 而且在16S rRNA 限制型的分析，第一群菌株之 限制型亦與 P. leiognathi 之限制型具相同類型。 第二、三、四、五與第六群菌株，雖在表現型 互有差異，但其16S rRNA 限制型卻屬同一型， 自這些菌群菌株之 16S rRNA 序列與基因庫的 資 料 比 對 ， 其 最 相 似 之 菌 種 為 ， Vibrio
campbellii 、 Vibrio alginolyticus 、 Vibrio
natriegens 、 Vibrio campbellii 和 Vibrio
campbellii，而與已知的發光弧菌 Vibrio harveyi
其相似度均大於98.2%，而且這些與發光菌分離
株最相似的菌株之16S rRNA 模擬基因型，都同
屬於一種基因型，並將此同基因型及限制型的 菌群統稱為 Vibrio harveyi-like 菌群。
本研究所採集分離之發光菌的種類，若非
P. leiognathi 亦即 Vibrio harveyi-like 菌群，而且
此類 Vibrio harveyi-like 細菌不僅占多數且較為 優勢。而自沿岸淺海海水浮游性的發光細菌均 為 P. leiognathi 與 Vibrio harveyi-like 菌群；而自 海綿生物樣本所分離之發光菌株均屬於 Vibrio
harveyi-like 菌群，並沒有 Vibrio fischeri 之類似
菌群。一般而言，寄生或共生性之海洋發光細 菌大多屬於 Vibrio 屬菌種(Dunlap et al., 1995; Wada et al., 1999; Nishguchi, 2000)，本研究從海 綿樣本分離出高比例之 Vibrio 屬發光細菌，它 們是否與海綿間形成共生或寄生之關係，則尚 待累積更多資料驗證。 五、計畫成果自評 （A）執行本計畫已完成: 1. 海水及海綿中對象菌（發光細菌）的菌 數之調查。 2. 分離出 41 株對象菌，全數行以繼代保 存。 3. 針對 41 株分離株完成以下各項: (1) 分離株最適增殖條件之探討。 (2) 依其生理生化特性將之分群。 (3) 完成菌株之 16S rRNA 序列分析。 (4) 測知菌株之限制型與已知菌種之 基因型之比對與分析。 （B）參與本計畫的工作人員已習得細菌的培 養、計數、純化、分離、保存和鑑定等種種技 術。 六、參考文獻
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