以基因晶片初探黃連對人體單核淋巴球免疫功能之影響; Microarray analysis of immune genes regulation by Huang-Lian in human blood mononucleocytes

全文

(1)中國醫藥大學中西醫結合研究所碩士論文編號：GIICWM-94-9308. 指導教授：陳光偉. 副教授. 共同指導教授：謝長奇助理教授. 論文題目以基因晶片初探黃連對人體單核淋巴球免疫功能之影響 Microarray analysis of immune genes regulation by Huang-Lian in human blood mononucleocytes. 研究生：許世典. 中華民國九十五年六月三十日.

(2) 目錄目錄. i. 圖目錄. ii. 表目錄. iii. 中文摘要. 1. 第一章前言. 1. 第二章文獻探討. 3. 第三章材料與方法. 22. 第四章結果. 30. 第五章討論. 63. 第六章結論. 72. 參考文獻. 73. 英文摘要. 77. 附件. 79. 謝辭. 80. i.

(3) 圖目錄圖 4.1 RNA quality test (by Agilent 2100 Bioanalyzer). 30. 圖 4.2 cRNA fragmentation test（by Agilent 2100 Bioanalyzer）. 32. 圖 4.5 Hierarchical clustering. 35. ii.

(4) 表目錄表 3.1 Hybridization cocktail 表 4.1 RNA Purity test. 28 30. 表 4.2 cRNA 品質檢測. 31. 表 4.3 Array output quality report. 34. 表 4.4 服用黃連後表現差異達 2 倍、4 倍、8 倍基因數目. 34. 表 4.4 黃連作用後上調達 2 倍以上免疫相關基因. 37. 表 4.5 黃連作用後下調達 2 倍以上免疫相關基因. 40. 表 5.1 黃連影響下調的類 Toll 接受器基因. 66. 表 5.2 黃連影響下調的細胞激素基因. 67. 表 5.3 黃連影響下調的化學趨化激素及接受器基因. 69. 表 5.4 黃連影響下調的白血球 Fc 接受器基因. 70. iii.

(5) 中文摘要以基因晶片初探黃連對人體單核淋巴球免疫功能之影響許世典指導教授：陳光偉副教授中西醫結合研究所中國醫藥大學目前醫學的發展趨勢，已由中醫、西醫兩系統分流並行，朝向中西醫結合的目標努力。以往中草藥中西結合研究，受限於舊有實驗方法，常就中藥中的單一成分探討機轉，易流於以偏概全。其次，實驗室操作的細胞、動物實驗結果，也常與中藥臨床所見脫節。如何結合現代醫學技術，重新審視中藥作用於人體的藥理機轉，成為現代中西醫結合的一大難題。基因晶片，是近年來生命科學研究的一大利器。它可經由一次實驗，得到生物體所有基因表現量的數據。以基因晶片分析中醫複雜的證型變化或藥物組成，不但免除以偏概全的顧慮，更可以嘗試描繪出證型或藥物的基因圖譜，作為中西醫的交流與整合的橋樑。本次實驗，藉由兩名健康成年男性服食黃連一週前後，抽取血液單核淋巴球中的 RNA，利用 Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array 觀察黃連影響基因變化，探討黃連作用於人體的藥理機轉。黃連共同影響兩人的基因探針數目，表現上調達 2 倍的共 879 個，下調達 2 倍則為 987 個。經由分析黃連影響的基因，發現類 Toll 接受器、腫瘤壞死因子( TNF)、IL1、化學趨化激素、白血球 Fc 接受器的表現明顯下調，可能為黃連調整人體免疫功能、抑制人體發炎反應的機轉。對照濕熱下利、泄瀉、胃火牙痛、肝火脅痛、神昏譫語、癰腫瘡毒、耳目腫痛等黃連臨床療效，恰可由基因層次來驗證， 1.

(6) 提供一個中西醫結合研究的良好範例。. 關鍵字：黃連、基因晶片、免疫. 2.

(7) 第一章前言中國醫學歷史悠久，源遠流長，在五千年的歷史裡，始終守護著我們民族的健康。在歷代，許多醫家屢有創見，在西方醫療還停留於荒蕪之際，就已建構了完整的診斷及治療系統，同時，在長期連續的臨床實踐中，其療效也超越了許多臨床試驗，直至今日，仍深受民眾肯定，照顧大眾的健康。在二十世紀，西方醫學由於解剖、免疫、生理、病理、藥理、分生等基礎學科飛快地進展，有效的應用於診斷與治療，逐漸成為現代醫學的主流。但時至二十一世紀，近年來雖屢有突破性的進步，但也漸漸暴露出其微觀視野的侷限性，太過微細的觀察，往往只看到了疾病的一部分，因此，對疾病的複雜表現，常有顧此失彼的困境，無論病人或醫師，對於目前的西醫治療效果，都不十分滿意。在中國傳統醫學方面，雖然有許多觀念如辨證論治、扶正袪邪、天人合一是西醫所不及的，但由於其思想典範與西醫有極大的分岐，且對同一個案的處置常因醫者的觀察見解不同而有不一樣的治療方向，始終無法建立一套標準統一的診斷流程，因此無法見容於大多數西醫學者。但在近年，由於西方醫學的瓶頸始終未能突破，且中醫在臨床上具有不容忽視的明顯效果，故無論是世界衛生組織、或是兩岸三地，都投入相當大的資源在研究整合中西醫藥，希望能於其中找到更好的治療方向。中醫在治療病人的時候，常採取辯證論治的方法，利用人體外在表現的改變，透過醫師的觀察，與疾病進展作對照整理，然後歸納結果，進行治療。有人稱之為黑箱理論，也就是不管疾病在人體內部的真實作用機轉，單純由其外在表現症狀變化，透過陰陽五行、臟腑經 1.

(8) 絡學說，去推測病情的轉歸，對於疾病的寒、熱、虛、實，作相對應的治療。這種中醫的診斷治療方式與現今西方醫學的思維有極大的差異，常常使雙方對疾病進展及治療方式，有不同的意見，不易溝通整合，不僅造成醫療浪費，也常影響治療結果，所以發展一種能將中西醫整合的方法，是今日醫界極需突破的一大課題。另外，在中藥處方方面，相對於西藥採單一成份作藥理分析，詳細探討在人體影響的機轉，決定療效與副作用，中藥組成成份複雜，過去由藥物治療前後病人證型變化，建立藥物的性味歸經，作為臨床應用的依據。這種藥理機轉的詮釋方法，不易與西方藥理學接軌；若依現代生藥學的方法，由其中已知的單一成份去推測中藥療效，又容易流於以偏概全的困境。所以發展新的研究技術，解讀中藥的性味歸經，結合西方藥理學，是現今中西醫結合的一大課題，也是一大難題。在西元 2001 年，人體基因序列草圖已解碼公布，加上分子生物技術突破、電腦資訊分析的進步，一個突破性的生物技術---DNA 微陣列晶片( microarray)提供了一個平台可同時分析生命體的整體基因表現，有別於以往以單一個基因為目標的研究方式，一次可觀察到整個生命體的基因表現變化。以此技術應用於中醫證型或中藥複雜成份的研究，恰可互相對照，有別於辯證論治的人為觀察誤差，而能對證型及藥性作客觀的描述。本研究應用基因晶片的技術，由基因表現的觀點，來探討黃連 (Huang-Lian)作用於人體單核淋巴球細胞的基因變化，以了解黃連的作用於人體的藥理機轉，與傳統醫學中黃連的主治療效作對照。. 2.

(9) 第二章文獻探討 2.1 黃連 2.1.1 黃連的傳統文獻探討始載於神農本草經。命名: 在本草綱目中記載，其根連珠而色黃，故名黃連來源：本品為毛茛科植物黃連(Coptis chinensis FRANCH)、三角葉黃連(Coptis deltoidea) 、雲連( Coptis teetoides) 、或峨眉野連( Coptis omeiensis)及同屬近緣植物除去鬚根之根莖[1] 別名: 川連、雅連、味連、雞爪連神農本草經[2]：味苦寒。治熱氣，目痛、眥傷、泣出、明目、腸澼、腹痛下利、婦人陰中腫痛。久服令人不忘。一名王連。生川谷。名醫別錄[3] ：微寒，無毒。主治五臟冷熱，久下泄澼、膿血，止消渴、大驚，除水利骨，調胃厚腸，益膽，療口瘡。生巫陽川谷及蜀郡、太山。二月、八月採。本草經集注[4] ：巫陽在建平。今西間者，色淺而虛，不及東陽、新安諸縣最勝。臨海諸縣者不佳。用之當布裹擰去毛，令如連珠。世方多治下痢及渴，道方服食長生。開寶本草[5] ：醫家見用宣州九節堅重，相擊有聲者為勝。本草綱目[6] ：神農本草經上品釋名、支連（藥性論）。時珍曰︰其根連珠而色黃，王連（神農本草經）故名。. 集解 3.

(10) 保升曰︰苗似茶，叢生，一莖生三葉，高尺許，凌冬不凋，花黃色。江左者，節高若連珠；蜀都者，節下不連珠。今秦地及杭州、柳州者佳。頌曰︰今江、湖、荊、夔州郡亦有，而以宣城九節堅重相擊有聲者為勝，施、黔者次之，東陽、歙州、處州者又次之。苗高一尺以來，葉似甘菊，四月開花黃色，六月結實似芹子，色亦黃。江左者，根若連珠，其苗經冬不凋，葉如小雉尾草，正月開花作細穗，淡白微黃色。六、七月根緊，始堪采。恭曰︰蜀道者粗大，味極濃苦，療渴為最。江東者節如連珠，療痢大善。澧州者更勝。時珍曰︰黃連，漢末李當之本草，惟取蜀郡黃肥而堅者為善。唐時以澧州者為勝。今雖吳、蜀皆有，惟以雅州、眉州者為良。藥物之興廢不同如此。大抵有二種︰一種根粗無毛有珠，如鷹、雞爪形而堅實，色深黃；一種無珠多毛而中虛，黃色稍淡。各有所宜。. 根的修治敩曰︰凡使以布拭去肉毛，用漿水浸二伏時，漉出，于柳木火上焙干用。時珍曰︰五臟六腑皆有火，平則治，動則病，故有君火、相火之說，其實一氣而已。黃連入手少陰心經，為治火之主藥︰治本臟之火，則生用之；治肝膽之實火，則以豬膽汁浸炒；治肝膽之虛火，則以醋浸炒；治上焦之火，則以酒炒；治中焦之火，則以姜汁炒；治下焦之火，則以鹽水或朴硝炒；治氣分濕熱之火，則以茱萸湯浸炒；治血分塊中伏火，則以乾漆水炒；治食積之火，則以黃土炒。諸法不獨為之引導，蓋辛熱能制其苦寒，鹹寒能製其燥性，在用者詳酌之。. 氣味苦，寒，無毒。普曰︰神農、岐伯、黃帝、雷公︰苦，無毒。李當之︰小寒。之才 4.

(11) 曰︰黃芩、龍骨、理石為之使，惡菊花、玄參、白蘚皮、芫花、白僵蠶，畏款冬、牛膝，勝烏頭，解巴豆毒。權曰︰忌豬肉，惡冷水。敩曰︰服此藥至十兩，不得食豬肉；若服至三年，一生不得食也。時珍曰︰道書言服黃連犯豬肉令人泄瀉，而方家有豬肚黃連丸、豬臟黃連丸，豈只忌肉而不忌臟腑乎？. 主治治五勞七傷，益氣，止心腹痛，驚悸煩躁，潤心肺，長肉止血，天行熱疾，止盜汗並瘡疥。豬肚蒸為丸，治小兒疳氣，殺虫（大明）。羸。元素曰: 治郁熱在中，煩躁惡心，兀兀欲吐，心下痞滿。瘦氣急（藏器）好古曰: 主心病逆而盛，心積伏梁。時珍曰: 去心竅惡血，解服藥過劑煩悶及巴豆、輕粉毒。. 發明元素曰︰黃連性寒味苦，氣味俱濃，可升可降，陰中陽也，入手少陰經。其用有六︰瀉心臟火，一也；去中焦濕熱，二也；諸瘡必用，三也；去風濕，四也；赤眼暴發，五也；止中部見血，六也。張仲景治九種心下痞，五等瀉心湯，皆用之。成無己曰︰苦入心，寒勝熱，黃連、大黃之苦寒，以導心下之虛熱。蛔得甘則動，得苦則安，黃連、黃柏之苦，以安蛔也。好古曰︰黃連苦燥，苦入心，火就燥。瀉心者，其實瀉脾也，實則瀉其子也。震亨曰︰黃連，去中焦濕熱而瀉心火。若脾胃氣虛，不能轉運者，則以茯苓、黃芩代之。以豬膽汁拌炒，佐以龍膽草，則大瀉肝膽之火。下痢胃口熱禁口者，用黃連、人參煎湯，終日呷之，如吐再強飲，但得一呷下咽便好。劉完素曰︰古方以黃連為治痢之最。蓋治痢惟宜辛苦寒藥，辛能發散開通郁結，苦能燥濕，寒能勝熱，使氣宣平而已。諸苦寒藥多泄，惟黃連、黃柏性冷而燥，能降火去濕而止瀉 5.

(12) 痢，故治痢以之為君。宗奭曰︰今人多用黃連治痢，蓋執以苦燥之義。下俚但見腸虛滲泄，微似有血，便即用之，又不顧寒熱多少，惟欲盡劑，由是多致危困。若氣實初病，熱多血痢，服之便止，不必盡劑。虛而冷者，慎勿輕用。杲曰︰諸痛痒瘡瘍，皆屬心火。凡諸瘡宜以黃連、當歸為君，甘草、黃芩為佐。凡眼暴發赤腫，痛不可忍者，宜黃連、當歸以酒浸煎之。宿食不消，心下痞滿者，須用黃連、枳實。頌曰︰黃連治目方多，而羊肝丸尤奇異。今醫家洗眼，以黃連、當歸、芍藥等分，用雪水或甜水煎湯熱洗之，冷即再溫，甚益眼目。但是風毒赤目花翳，用之無不神效。蓋眼目之病，皆是血脈凝滯使然，故以行血藥合黃連治之。血得熱則行，故乘熱洗也。韓懋曰︰火分之病，黃連為主，不但瀉心火，而與芩、柏諸苦藥例稱者比也。目疾，入以人乳浸蒸，或點或服之。生用為君，佐以官桂少許，煎百沸，入蜜空心服之，能使心腎交于頃刻。入五苓、滑石，大治夢遺。以黃土、姜汁、酒、蜜四炒為君，以使君子為臣，白芍藥酒煮為佐，廣木香為使，治小兒五疳。以茱萸炒者，加木香等分，生大黃倍之，水丸，治五痢。此皆得製方之法也。時珍曰︰黃連，治目及痢為要藥。古方治痢︰香連丸，用黃連、木香；姜連散，用干姜、黃連；變通丸，用黃連、茱萸；姜黃散，用黃連、生姜。治消渴，用酒蒸黃連；治伏暑，用酒煮黃連；治下血，用黃連、大蒜；治肝火，用黃連、茱萸；治口瘡，用黃連、細辛。皆是一冷一熱，一陰一陽，寒因熱用，熱因寒用，君臣相佐，陰陽相濟，最得製方之妙，所以有成功而無偏勝之害也。弘景曰︰俗方多用黃連治痢及渴，道方服食長生。慎微曰︰劉宋王微黃連贊云︰黃連味苦，左右相因。斷涼滌暑，闡命輕身。縉雲昔御，飛蹕上。不行而至，吾聞其人。梁江淹黃連頌云︰黃連上草，丹砂之次。御孽辟妖，長靈久視。驂龍行天，馴馬匝地。鴻飛以儀，順道則利。時珍曰︰本經、別錄並無黃連久服長生之說，惟陶弘景言道方. 6.

(13) 久服長生。神仙傳載封君達、黑穴公，並服黃連五十年得仙。竊謂黃連大苦大寒之藥，用之降火燥濕，中病即當止。豈可久服，使肅殺之令常行，而伐其生發沖和之氣乎？素問載岐伯言︰五味入胃，各歸所喜攻。久而增氣，物化之常也。氣增而久，夭之由也。王冰注云︰酸入肝為溫，苦入心為熱，辛入肺為清，咸入腎為寒，甘入脾為至陰而四氣兼之，皆增其味而益其氣，故各從本臟之氣為用。所以久服黃連、苦參反熱，從火化也，余味皆然。久則臟氣偏勝，即有偏絕，則有暴夭之道。是以絕粒服餌之人不暴亡者，無五味偏助也。又秦觀與喬希聖論黃連書云︰聞公以眼疾餌黃連，至十數兩猶不巳，殆不可也。醫經有久服黃連、苦參反熱之說。此雖大寒，其味至苦，入胃則先歸于心，久而不己，心火偏勝則熱，乃其理也。況眼疾本于肝熱，肝與心為子母。心火也，肝亦火也，腎孤臟也，人患一水不勝二火。豈可久服苦藥，使心有所偏勝，是以火救火，其可乎？秦公此書，蓋因王公之說而推詳之也。我明荊端王素多火病，醫令服金花丸，乃芩、連、梔、柏四味，餌至數年，其火愈熾，遂至內障喪明。觀此，則寒苦之藥，不但使人不能長生，久則氣增偏勝，速夭之由矣。當以素問之言為法，陶氏道書之說，皆謬談也。楊士瀛云︰黃連能去心竅惡血。. 附方和劑局方︰心經實熱，瀉心湯，用黃連七錢。水一盞半，煎一盞，食後溫服。小兒減之。外台秘要: 卒熱心痛，黃連八錢。嚼咀，水煎熱服。丹溪方：肝火為痛︰黃連姜汁炒，為末，粥糊丸梧子大。每服三十丸，白湯下。左金丸︰用黃連六兩，茱萸一兩。同炒為末，神曲糊丸梧子大。每服三、四十丸，白湯下。和劑局方：伏暑發熱，作渴嘔惡，及赤白痢，消渴，腸風酒毒，泄瀉諸病，並宜酒煮黃龍丸主之。川黃連一斤，切，以好酒二升半，煮乾焙研，糊丸梧子大，每服五十丸，熟水下， 7.

(14) 日三服。易簡方：陽毒發狂，奔走不定。宜黃連、寒水石等分，為末。每服三錢，濃煎甘草湯下。廣利方：骨節積熱，漸漸黃瘦。黃連四分切。以童子小便五大合，浸經宿，微煎三、四沸，去滓，分作二服。直指方：小兒疳熱流注，遍身瘡蝕，或潮熱，肚脹作渴。豬肚黃連丸︰用豬肚一個（洗淨），宣黃連五兩。切碎，水和，納入肚中縫定，放在五升粳米上，蒸爛，石臼搗千杵，或入少飯同杵，丸綠豆大。每服二十丸，米飲下。仍服調血清心之藥佐之。蓋小兒之病，不出于疳，則出于熱，常須識此。易簡方：三消骨蒸。黃連末，以冬瓜自然汁浸一夜，晒干又浸，如此七次，為末，以冬瓜汁和丸梧子大。每服三、四十丸，大麥湯下。尋常渴，只一服見效。消渴尿多。肘后方：消渴尿多。用黃連末，蜜丸梧子大。每服三十丸，白湯下。寶鑒方︰用黃連半斤，酒一升浸，重湯內煮一伏時，取晒為末，水丸梧子大。每服五十丸，溫水下。崔氏︰治消渴，小便滑數如油。黃連五兩，栝蔞根五兩，為末，生地黃汁丸梧子大。每牛乳下五十丸，日二服。忌冷水、豬肉。聖濟總錄︰用黃連末，入豬肚內蒸爛，搗丸梧子大，飯飲下。范汪方：濕熱水病。黃連末，蜜丸梧子大。每服二丸至四五丸，飲下，日三四服。高文虎蓼花洲閑錄：破傷風病。黃連五錢，酒二盞，煎七分，入黃蠟三錢，溶化熱服之。普濟方：小便白淫，因心腎氣不足，思想無窮所致。黃連、白茯苓等分，為末，酒糊丸梧子大。每服三十丸，煎補骨脂湯下，日三服。千金方：熱毒血痢。宣黃連一兩，水二升，煮取半升，露一宿，空腹熱服，少臥將息，一二日即止。勝金方：赤痢久下，累治不瘥。黃連一兩。雞子白和為餅，炙紫為末，以漿水三升，慢火煎成膏。每服半合，溫米飲下。一方︰只以雞子白和丸服。本事方：熱毒赤痢︰黃連二兩，切，瓦焙令焦，當歸一兩，焙，為末，入麝香少許。每服二錢，陳米飲下。佛智和尚在閩，以此濟人。楊子建護命方；赤白久痢，並無寒熱，只日久不. 8.

(15) 止。用黃連四十九個，鹽梅七個。入新瓶內，燒煙盡，熱研。每服二錢，鹽米湯下。經驗方：赤白暴痢，如鵝鴨肝者，痛不可忍。用黃連、黃芩各一兩，水二升，煎一升，分三次熱服。胡洽九盞湯︰治下痢，不問冷熱赤白，谷滯休息久下，悉主之。黃連（長三寸）三十枚（重一兩半），龍骨（如棋子大）四枚（重一兩），大附子一枚，干姜一兩半，膠一兩半。細切。以水五合著銅器中，去火三寸煎沸，便取下，坐土上，沸止，又上水五合，如此九上九下。納諸藥入水內，再煎沸，輒取下，沸止又上，九上九下，度可得一升，頓服即止。肘后方：下痢腹痛、赤白痢下，令人下部疼重，故名重下，日夜數十行，臍腹絞痛。以黃連一斤。酒五升，煮取一升半，分再服，當止絞痛也。李絳兵部手集︰治赤白諸痢，裡急后重，腹痛。用宣黃連、青木香等分；搗篩，白蜜丸梧子大。每服二、三十丸，空腹飲下，日再服，其效如神。久冷者，以煨蒜搗和丸之。不拘大人嬰孺皆效。易簡方︰黃連（茱萸炒過）四兩，木香（面煨）一兩，粟米飯丸。錢仲陽香連丸︰治小兒冷熱痢，加煨熟訶子肉。又治小兒瀉痢，加煨熟肉豆蔻。又治小兒氣虛瀉痢腹痛，加白附子尖。劉河間治久痢，加龍骨。朱丹溪治禁口痢，加石蓮肉。王氏治痢渴，加烏梅肉，以阿膠化和為丸。韓氏醫通：五疳八痢。四治黃連丸︰用連珠黃連一斤（分作四分︰一分用酒浸炒，一分用自然姜汁炒，一分用吳茱萸湯浸炒，一分用益智仁同炒，去益智，研末），白芍藥（酒煮，切焙）四兩，使君子仁（焙）四兩，廣木香二兩，為末，蒸餅和丸綠豆大。每服三十丸，米飲食前下，日三服。忌豬肉冷水。肘后方：傷寒下痢，不能食者。黃連一斤，烏梅二十枚（去核，炙燥為末），蠟一棋子大，蜜一升。合煎，和丸梧子大。一服二十丸，日三服。又方︰黃連二兩，熟艾（如鴨子大）一團。水三升，煮取一升，頓服立止。氣痢后重，裡急或下泄。杜壬方姜連散︰用宣連一兩，干姜半兩。各為末，收。每用連一錢，姜. 9.

(16) 半錢，和勻，空心溫酒下，或米飲下。神妙。濟生方秘傳香連丸︰用黃連四兩，木香二兩，生姜四兩。以姜鋪砂鍋底，次鋪連，上鋪香，新汲水三碗，煮焙研，醋調倉米糊為丸。如常，日服五次。子母秘錄：小兒下痢，赤白多時，體弱不堪。以宣連用水濃煎，和蜜，日服五、六次。直指方：諸痢脾泄，臟毒下血。雅州黃連半斤，去毛切，裝肥豬大腸內，扎定，入砂鍋中，以水酒煮爛，取連焙，研末，搗腸和丸梧子大。每服百丸，米湯下，極效。濕痢腸風︰百一選方變通丸︰治赤白下痢，日夜無度，及腸風下血。用川黃連（去毛）、吳茱萸（湯泡過）各二兩，同炒香，揀出各為末，以粟米飯和丸梧子大，各收。每服三十丸，赤痢，甘草湯下黃連丸；白痢，姜湯下茱萸丸；赤白痢，各用十五丸，米湯下。此乃浙西河山純老方，救人甚效。局方戊己丸︰治脾胃受濕，下痢腹痛，米谷不化。用二味加白芍藥，同炒研，蒸餅和丸服。楊氏家藏方：積熱下血，聚金丸，治腸胃積熱，或因酒毒下血，腹痛作渴，脈弦數。黃連四兩（分作四分︰一分生用，一分切炒，一分炮切，一分水浸晒研末），條黃芩一兩，防風一兩，為末，面糊丸如梧子大。每服五十丸，米泔浸枳殼水，食前送下。冬月，加酒蒸大黃一兩。濟生方：臟毒下血，黃連為末，獨頭蒜煨研，和丸梧子大，每空心陳米飲下四十丸。醫學集成：酒痔下血，黃連（酒浸，煮熟）為末，酒糊丸梧子大。每服三、四十丸，白湯下。一方︰用自然姜汁浸焙炒。斗門方：雞冠痔疾，黃連末敷之。加赤小豆末尤良。醫方大成：痔病秘結，用此寬腸。黃連、枳殼等分，為末，糊丸梧子大。每服五十丸，空心米飲下。經驗良方：痢痔脫肛，冷水調黃連末涂之，良。活人心統：脾積食泄，川黃連二兩。為末。大蒜搗和丸梧子大。每服五十丸，白湯下。博濟方：水泄脾泄，神聖香黃散。宣連一兩，生姜四兩，同以文火炒至姜脆，各自揀出為末。水泄，用姜末；脾泄，用連末，每服二錢，空心白湯下。甚者不過二服。亦治. 10.

(17) 痢疾。簡要濟眾方：吐血不止，黃連一兩搗散。每服一錢，水七分，入豉二十粒，煎至五分，去滓溫服。大人、小兒皆治。眼目諸病︰勝金黃連丸︰用宣連不限多少，捶碎，以新汲水一大碗，浸六十日，綿濾取汁，入原碗內，重湯上熬之，不住攪之，候干。即穿地坑子可深一尺，以瓦鋪底，將熟艾四兩坐在瓦上，以火燃之。以藥碗覆上，四畔泥封，開孔出煙盡，取刮下，丸小豆大，每甜竹葉湯下十丸。劉禹錫傳信方: 羊肝丸，治男女肝經不足，風熱上攻，頭目昏暗羞明，及障翳青盲。用黃連末一兩，羊子肝一具，去膜，擂爛和丸梧子大。每食后暖漿水吞十四丸，連作五劑，瘥。昔崔承元活一死囚，囚后病死。一旦崔病內障，逾年半夜獨坐，聞階除悉之聲，問之。答曰︰是昔蒙活之囚，今故報恩。遂告以此方而沒。崔服之，不數月，眼複明。因傳于世。暴赤眼痛，宣黃連銼，以雞子清浸，置地下一夜，次早濾過，雞羽蘸滴目內。又方︰苦竹兩頭留節，一頭開小孔，入黃連片在內，油紙封，浸井中一夜。次早服竹節內水，加片腦少許，外洗之。海上方︰用黃連、冬青葉煎湯洗之。選奇方︰用黃連、干姜、杏仁等分，為末，綿包浸湯，閉目乘熱淋洗之。全幼心鑒：小兒赤眼，水調黃連末，貼足心，甚妙。仁存方: 爛弦風眼︰黃連十文，槐花、輕粉少許，為末。男兒乳汁和之，飯上蒸過，帛裹，熨眼上，三、四次即效，屢試有驗。外台秘要：目猝痒痛︰乳汁浸黃連，頻點眥中。抱朴子云︰治目中百病。肘后方：淚出不止︰黃連浸濃汁，漬拭之。李樓奇方：牙痛惡熱︰黃連末摻之，立止。口舌生瘡︰肘后方：用黃連煎酒，時含呷之。赴筵散︰用黃連、干姜等分，為末摻之。簡便方：小兒口疳，黃連、蘆薈等分，為末，每蜜湯服五分。走馬疳，入蟾灰等分，青黛減半，麝香少許。張傑子母秘錄：小兒鼻齆，鼻下兩道赤色，有疳。以米泔洗淨，用黃連末敷之，日三、四次。小兒月蝕，生于耳后。黃連末敷之。姚和眾童子秘訣：小兒食土︰取好黃土，煎. 11.

(18) 黃連汁搜之，晒乾與食。王海藏湯液本草：預解胎毒，小兒初生，以黃連煎湯浴之，不生瘡及丹毒。又方︰未出聲時，以黃連煎汁灌一匙，令終身不出斑；已出聲者灌之，斑雖發亦輕。此祖方也。熊氏補遺：腹中兒哭，黃連煎濃汁，母常呷之。子母秘錄：因驚胎動、出血。取黃連末。酒服方寸匕，日三服。婦人良方：妊娠子煩，口乾不得臥。黃連末。每服一錢，粥飲下。或酒蒸黃連丸，亦妙。王氏簡易方：癰疽腫毒，已潰、未潰皆可用。黃連、檳榔等分。為末。以雞子清調搽之。肘后方：中巴豆毒，下利不止︰黃連、干姜等分。為末。水服方寸匕。. 本草備要大苦大寒。入心瀉火，鎮肝涼血，燥濕開鬱，解渴除煩。益肝膽，厚腸胃，消心瘀，止盜汗。酒毒胎毒，明目，定驚，止汗解毒，除疳，殺蚘。治腸澼瀉痢，腹痛，心痛伏梁，目痛眥傷，癰疽瘡疥。. 現代中醫主治濕熱下利、痞滿、嘔吐、泄瀉、胃火牙痛、消渴、肝火脅痛、心火煩躁不得寐、神昏譫語、癰腫瘡毒、耳目腫痛[1]。. 2.1.2 黃連化學成份[7, 8]: 小檗鹼(berberine)、黃連鹼(coptisine)、甲基黃連鹼(worenine)、掌葉防己鹼(palmatine)、藥根鹼(jatrorrhizine)、表小檗鹼(epiberberine)、非州防己鹼(columbamine)、木蘭花鹼(magnoflorine)、阿魏酸(ferulic acid)、氯原酸（chlorogenic acid）。. 12.

(19) 2.1.3 黃連的現代藥理作用. 抗菌作用黃連及其有效成份對多種病菌均有抑制或殺死作用。陳群等[9]以中藥黃連的提取物為質體消除劑，用攜帶 R 質體的多重耐藥性大腸桿菌Ｅ.102 株為靶細胞，進行了体外 R 質體消除作用的實驗研究。結果發現黃連具有消除大腸桿菌 R 質體的作用，經黃連作用 24 小時，消除率為 2.42%；延長作用時間至 48 小時，其消除提高率為 22.57%。陳波華等[10] 通過紙片法抑菌實驗發現黃連能抑制幽門螺旋菌生長，其效果甚至超過某些抗菌素。陳芝芸等[11]採用瓊脂平板稀釋法對常用中藥 100 味進行體外抑制幽門螺旋菌的研究，發現黃連等對幽門螺旋菌有高度抑制作用，最低抑菌濃度為 1:640-1:320。常明向等[12]採用瓊脂稀釋法對香連丸的抗菌作用進行拆方研究，發現單用黃連對金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、福氏痢疾桿菌有較強的抗菌作用，而香連丸煎劑較單用黃連弱。姜廣水等[13]研究黃連水煎液提取物對兩种牙周致病菌的生長有強效抑制作用，推測黃連可用于各型牙周炎的治療。. 抗癌作用小檗鹼併用 CPT-11 可抑制體內植入 Lewis lung carcinoma 小鼠的腫瘤生長。機轉為減少 activator protein(AP-1)轉錄活性，降低 urokinase-type plasminogen activator 使腫瘤侵犯轉移活性降低[14]。比較黃連及其複方對鼻咽癌細胞(HNE1)的殺傷作用。黃連單用時作用最明顯，半抑制濃度為 1︰729。與其他藥配伍時，其作用減弱，半抑制濃度為 1︰243，兼具濃度依賴性和時間依賴性兩個特點[15]。觀察 3 組中藥方劑對鼻咽癌和子宮頸癌裸鼠移植瘤的抑制效應，發現中藥組成瘤時間明顯慢於對照組，移植瘤體積及瘤重顯著低於對照組。其中以單 13.

(20) 味黃連效果最明顯，鼻咽癌抑瘤率達到 86.3%，子宮頸癌抑瘤率達到 77.0% [16]。利用 mRNA 差異顯示技術(Differential display by means of the polymerase chain reaction)研究以黃連為主的益氣解毒片(複方黃連) 對鼻咽癌細胞基因的抑制作用，從基因表達強度探討其抗鼻咽癌細胞的機轉。結果發現益氣解毒片在体外能抑制鼻咽癌細胞基因的表達，同時誘導一些特異基因的表達，從而抑制鼻咽癌細胞的增殖[17]。. 抗病毒作用馬伏英[18]等用柯薩奇 B3 病毒(coxsakievirus B3；CB3V)感染 BAL B/C 小鼠建立 CB3V 心肌炎動物模型，用黃連、黃芩、梔子及複方製劑對感染鼠進行治療，表明 4 种藥物均有抗病毒心肌炎作用。. 對凝血功能的影響三黃合劑(黃柏、黃連、黃芩)對大鼠 ADP(二磷酸腺苷)誘導的血小板聚集( platelet aggregation)有抑制作用，在体外試驗中能抑制 ADP、 ADR(腎上腺素)誘導的血小板聚集。其治療血小板高聚集率患者的有效率為 88.7%，與腸溶阿司匹林 50 mg/d 的療效相當[19]。用家兔耳靜脈注入大腸桿菌內毒素製作溫病營血分証動物模型。發現腹腔注入以黃連等藥為主的苦寒液的動物，其發燒狀態、白血球總數、血小板聚集率、凝血時間、體外血栓形成的長度與濕重、乾重、臟器組織瘀血、出血、微血栓形成、變性壞死等各項指標皆有顯著改善(P<0.01) [20]。. 對紅細胞滲透脆性的影響將黃連與黃芩、甘草配伍的各種煎劑液通過灌胃給藥途徑,應用至 G6PD 缺陷大鼠模型中，檢測紅血球滲透脆性的變化,發現黃連與黃芩、 14.

(21) 甘草經適當配伍,可降低 G6PD 缺陷大鼠紅血球滲透脆性[21]。. 降血糖作用選用《萬病回春》中黃連地黃湯治療非胰島素依耐型糖尿病(NIDDM) 屬氣陰兩虛，燥熱兼瘀血者 30 例，顯效率 30.0%，有效率 46.7%，總有效率 76.7%。該方能顯著改善糖尿病臨床症狀，對糖尿病多種併發症也有較好的療效。且能改善血脂、血液流變學的異常指標，調節血清胰島素的異常釋放。其降血糖機轉主要與增強胰島 β 細胞膜上受體對葡萄糖的敏感性和改善胰島素抗性有關[22]。. 對胃腸道的作用小檗鹼對結腸平滑肌細胞鈣的內流與釋放均有抑制作用，可阻礙鈣離子通道[23]。小檗鹼可抑制人與大鼠結腸電子傳遞(ion transport)的作用[24, 25]。. 心臟疾病改善對口服小檗鹼的 17 例充血性心臟衰竭患者進行療效觀察，服藥後增加心肌收縮力，降低周邊阻力，改善心功能作用[26]。小檗鹼降低大鼠因 pressure-overload 所引起的心臟肥大( cardiac hypertrophy)[27]。. 2.2 基因晶片與生物晶片的介紹 2.2.1 基因晶片的的歷史回顧在了解生命體的生理發育，病理發展過程裡，基因扮演一個非常重要的角色，但由於基因體內包含了太多的資訊，使用舊的分子生物技術不足以探測大量訊息表現，所以在二十世紀末期，科學家開始開發新的分子生物學技術，進行基因體研究，基因晶片的應用，就是當時一個重 15.

(22) 大突破[28]。基因晶片的研究發展，歸功於 1950-1990 間的技術突破，如 DNA polymerase 的發現、recombinant DNA 與 PCR 技術的提出，另一方面，電腦晶片工程的進展，使得基因晶片的發展開始有了雛形。在 1980 年代開始，Bains 將短 DNA 片段固定於支持物上藉著雙股分子雜合(hybridization)進行序列測定[29]。90 年代，史丹佛大學 Brown 的晶片研究團隊，於 1995 年於 Science 雜誌發表第一篇 microarray 的論文，使用晶片快速分析四十五個阿拉伯芥基因的基因表現差異[30]。到目前為止，已有數千篇以上 microarray 的研究論文發表。目前晶片的設計，已進展到生物晶片，以微小化技術將生物有機成分作為探針，以大量矩陣的方式，置於一數公分的晶片上，利用核酸雜合或抗體抗原反應，以分析標的分子的變化[31]。其類型分述如下。微陣列晶片經 PCR 反應將純化的已知基因片段製作成探針，置入基因佈放機，利用機械打點的方式點印到晶片上，其優點為成本低、操作迅速、用途廣、可製備各式生物探針、適合實驗室使用，但缺點為樣品需經一連串的純化與儲存，需一套完善的基因庫管理系統辦法，確保基因品質，過程繁複。. 寡核苷酸陣列(oligonucleotide array) 主要代表為 affymetrix 公司所採用的光導引原位合成技術（light-directed in situ synthesis）、Agilent 公司所採用的 ink-jet 方法及 NimbleGen 公司採用的 micromirror photolithography。. 蛋白質/抗體晶片利用抗體抗原反應，研究蛋白質的表達，其基本類型有三：平版式 (plain-glass slide)、立體膠墊式(3D gel pad)、微孔式(microwell)。 16.

(23) 組織晶片將數種組織包埋後切片固定於同一晶片上，可一次探究同一基因或蛋白質在數百或數千組織上的變化。. 實驗室晶片利用微機電技術製造，將一個分析過程的不同步驟整合微型化，已達快速自動分析的目標，即所謂 micro-total analysis systems (μ-TAS)。. 其他如 CpG island microarray、cell-based microarray。. 2.2.2 基因晶片的特點大量樣本、同時進行、自動化分析。. 2.2.3 基因晶片的應用領域基因晶片可進行基因定量、差異基因搜尋及剖繪基因表現輪廓。故應用於差異表現基因的篩選、細胞週期基因表現的研究、基因突變之解析、藥物開發及藥理學研究、驗證基因或部份序列之效能、疾病之基因型分類、致病原對細胞宿主之影響、轉錄因子的搜尋、遺傳網路的建構、生物數量遺傳之研究。. 2.2.4 Affymetrix 晶片介紹本實驗所使用的晶片為 Affymetrix 公司的 GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array，其特點如下： (1). 可在單一晶片裡廣泛地分析所有人體基因轉錄樣本。 17.

(24) (2). 分析高達 47,000 個轉錄 RNA 的表現量，其中包括了 38,500 個已知的人類基因。. (3). 包含 54,000 個探針組及 1300,000 不同的 oligonucleotide。. Affymetrix 公司乃是寡核苷酸陣列晶片的先趨，他們的晶片，有多項特有的設計[32]，較以往傳統的微陣列晶片，有更準確的實驗結果，將其特點分別敘述於下： (1) 光罩蝕刻法(Photolithography) 過去微陣列晶片需依賴自己實驗室持有的有限基因樣本作為基因探針，數量及品質有時不能完全符合實驗需求。光罩蝕刻法可自行設計探針，在一小晶片中探究生命體所有基因變化。操作方法如下： A. 首先將石英晶圓(Quartz Wafer)進行 Hydroxylation 接上 Blocking compound。 B. 運用光罩中設計的 11 μm 見方的窗口來對石英晶圓上的 Blocking compound 進行 Light deprotection 反應。 C. 石英晶圓經通過光罩的紫外光照射後的區域會產生 Light deprotection 反應。 D. 將核苷酸加入進行化學偶合反應,便可將核苷酸接上去晶圓上面。 E. 更換光罩進行紫外光照射。 F. 加入核苷酸進行化學偶合反應。 G. 不斷重複上述步驟即可合成所需長度及序列的寡核苷酸。 (2). 探針組(ProbeSet)的採用在生物演化上表現的基因常會出現類似轉錄樣本，以往. 18.

(25) 在實驗室有限的基因樣本中所選擇的探針，其專一性及代表性不夠，造成非專一性雜交(Cross hybridization)，容易高估訊號表現量，影響到分析結果的可信度。因此，採用多個探針來偵測基因的表現與否便成為可以減少訊號錯誤的一個方式。 (3). 完美配對及不完美配對探針設計(Design of perfect match/mismatch probe pairs) 設計一對獨特的 25 mer 寡核甘酸探針，其中一個是完全與 Target sequence 互補的完美配對，另一個則是除了第 13 個核甘酸不互補配對外其餘序列與 Target Sequence 互補配對。此種設計可針對每一個點均有相對的陰性控制點，作背景值計算，提高探針的靈敏性及特異性，尤其在檢測低表現量時更能增加訊號判斷的正確性。. 2.2.5 如何應用基因晶片與生物晶片在中醫藥方面的研究[33]. 在基因的層次尋找藥物標靶中藥為一混合物，作用是多方面的。將中藥及其方劑直接作用于細胞或生命體，以基因晶片觀察特定基因表達及蛋白質活性，如篩選離子通道調節劑、蛋白激酶抑制劑或啟動劑、細菌或腫瘤組織抗藥性抑制劑等，有助於發現藥物作用的標靶基因，闡明藥物的作用機制。另外，原先設想的作用是針對某一標靶，但在全基因篩選中也許可發現該藥在另一方面有很強的作用，不但可篩選出有效中藥及其有效成分，也可為新藥開發研究提供線索。. 藥物毒理學研究 19.

(26) 普通的藥理學方法耗時長，需要的人力和物力多，還有可能遺漏某些可能存在的潛在毒性和不良反應。應用晶片在基因層次進行毒理學研究分析，觀察中藥對人體一些 house keeping gene 的影響，瞭解該中藥的可能毒性和不良反應。如果該中藥能抑制重要基因的表達，則對它的深入研究就值得考慮，或對它進行改造時，去除有害成分，以便截長補短。. 中藥大規模篩選及藥物鑑定中藥的有效成分複雜，傳統的藥理研究時間長，耗費經費高。若改採基因晶片研究，將數千種不同中藥或中藥不同成分作用于一定的培養細胞後，觀察它們對基因表達的影響，瞭解它們的作用機制與範圍，可在短期內完成中藥篩選過程。另外，對新發現的中草藥的功能鑑定也起一定的貢獻。. 中藥方劑研究中藥方劑成分複雜，傳統研究方法是將其中的中藥進行不同組合，進行拆解，從而推出方劑的可能作用機理，很難對該複方有全面的認識，尤其是對新功能的認識和開發。而採用基因晶片技術，能迅速瞭解該複方對基因組中某些基因表達的影響，不僅瞭解該方劑的原有功能，還可發現該方劑組方後可能出現的新功能，為方劑的新功能開發提供了客觀依據。. 證型的本質研究中醫理論涉及到生命的整體，因此牽涉到許多基因和蛋白質，傳統的方法學無法全面分析證型的實質。從中醫理論來看，證型的形成是由先天的體質因素和後天的環境因素共同作用的結果，所以，藉著生物晶片繪製基因組圖譜( genetic map)、SNP 圖譜( single nucleotide 20.

(27) polymorphic map)和蛋白質體學圖譜( proteomic map)，我們可從基因與蛋白質的全面剖析，了解證型的本質。. 經脈實質研究通過基因晶片測量不同部位基因表達的差異，可判斷經絡部位基因表達是否具有特異性，希望藉此解決經脈實質這一長期爭論不休的問題。. 針刺參數研究以晶片了解不同針刺參數,包括作用方法(磁、電、力等)、刺激頻率、刺激幅度、刺激時間對身體組織的影響，進而瞭解針灸的可能作用，提高針灸臨床療效。. 針灸原理研究針灸的作用是與神經、內分泌、免疫網路系統密切相關的，但針灸的信號是如何在細胞間和細胞內傳遞的過程仍不明朗。如果引入基因晶片，可以高通量地檢測細胞內基因表達的時空特徵，有助於瞭解針灸作用機制。. 21.

(28) 第三章材料與方法 3.1 實驗藥物、對象及試劑組黃連：由中國醫藥大學附設醫院中藥局提供。實驗對象：由兩名身體健康無慢性疾病的健康男性擔任 (本實驗經中國醫藥大學附設醫院人體試驗委員會通過；DMR93-IRB-32)。試劑組： Ficoll-Plaque Plus ( Amersham Biosciences)：抽取血液中的單核淋巴球( mononucleocytes) TRIzol reagent ( Invitrogen Life Technologies)：抽取單核淋巴球中的 RNA 基因晶片： GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymerix) 3.2 實驗大綱每名受測者在用藥前先抽取 50 ml 血液，抽取其單核淋巴球之 RNA。接下來受測者每日分三次服用 2 g 黃連，每日總劑量 6 g，連續服用一週。於一週後再抽取 50 ml 的血液，抽取單核淋巴球的 RNA。最後以基因晶片分析服藥前後單核淋巴球的 RNA 表現差異，探討黃連影響的基因表現。. 3.3 由全血中抽取淋巴球(使用 Ficoll-Plaque Plus) (1) 加入 3 ml Ficoll-Plaque Plus 溶液於離心管中。 (2) 將 4 ml 的血液樣本以分層方式加入 Ficoll-Plaque Plus 溶液中，盡可能不與 Ficoll-Plsque Plus 溶液混合。 (3) 在 18-20℃以 400 g 離心 30-40 分鐘。 22.

(29) (4) 以 Pasteur pipette 移除上面的 plasma 層。 (5) 以 Pasteur pipette 將 lymphocyte 層移至另一離心管中，小心勿吸到下層的溶液。 (6) 加入三倍的 balanced salt solution 到含 lymphocyte 的離心管。 (7) 利用 Pasteur pipette 反覆抽吸使血球細胞懸浮。 (8) 在 18-20 ℃下，以 60-100 g 離心 10 mins。 (9) 移除上清液。 (10) 重覆步驟(7)到(9)，獲得樣本中的單核淋巴球。. 3.4 抽取 mononucleocytes 中的 RNA（TRIzol reagent） (1) 將 TRIzol 加入步驟 3.3 獲得的血球細胞溶液中(1ml TRIzol reagent per 5-10x106 of cells)，pipet 混合。 (2) 靜置於室溫 5 分鐘。 (3) 加入 chloroform（0.25ml chloroform per 1ml of TRIzol），混勻，用手用力搖 15 秒。 (4) 靜置於室溫 5 分鐘。 (5) 在 4℃以 12000 g 離心 15 分鐘。 (6) 吸出上清液至新的 eppendroff。 (7) 加入 isopropanol（0.5ml isopropanol per 1ml of TRIzol），混勻。 (8) 靜置於室溫 10 分鐘。 (9) 在 4℃以 10000 g 離心 10 分鐘 (10) 吸去上清液。 (11) 以 alcohol（0.5ml 75% alcohol per 1ml of TRIzol）清洗 RNA。 (12) 在 4℃以 7000 g 離心 5 分鐘，盡量吸乾上清液。 (13) 加入適當的 DEPC-H2O(約 50μl)後 vortex。. 23.

(30) (14) 打開上蓋，將 eppendroff 至於 65℃hot plate 上。 (15) 蓋上 hot plate 上蓋，靜置 10 分鐘。 (16) 再 vortex 一次。 (17) 放置於冰上 (18) 在 4℃以 12000 g 離心 1 分鐘. 3.5 RNA Quality Report 以 UV spectrophotometer OD260/OD280 比值及 Agilent 2100 Bioanalyzer electropherogram 測試 RNA 品質。. 3.6 加入 poly-A RNA controls (1) 加 2 μl poly-A control stock 到 38 μl poly-A control dil buffer 混合稀釋。 (2) 取 2 μl 第一次稀釋液到 98 μl poly-A control dil buffer 做第二次混合稀釋。 (3) 取 2 μl 第二次稀釋液到 18 μl poly-A control dil buffer 第三次混合稀釋。 (4) 取 2 μl 第三次稀釋液與 5 μg RNA 樣本混合。. 3.7 第一股 cDNA 合成 (1) 將剛加入 poly-A control 的 RNA 樣本移到 0.2 ml PCR tube 與 2 μl 50 μM 的 T7-Oligo(dT) primer 混合 (2) 加入 RNase-free water 直至總溶液體積達 12 μl，輕敲試管數次，然後短暫離心(~5 secs)，使試劑在試管底部反應 (3) 在 70 ℃讓樣本反應 10 分鐘。 (4) 降溫至 4 ℃，至少維持 2 分鐘。 24.

(31) (5) 短暫離心(約 5 秒)，使試劑留在試管底部。 (6) 加入 7 μl First-Strand Master Mix( 5 X 1st strand reaction mix,4μl, DTT, 0.1 M 2 μl, dNTP, 10 mM, 1μl)，輕敲試管數次，短暫離心(約 5 秒)，使試劑在試管底部反應，將試管立即置於 42 ℃ (7) 在 42 ℃下讓樣本反應 2 分鐘。 (8) 加入 1 μl SuperScript II ( Invitrogen)。 (9) 輕敲試管數次，短暫離心(約 5 秒)，使試劑在試管底部反應。 (10) 在 42 ℃下讓樣本反應 1 小時。 (11) 將樣本降溫至 4 ℃下至少至少維持 2 分鐘，短暫離心(約 5 秒)。. 3.8 第二股 cDNA 合成 (1) 準備 Second-Strand Master Mix( RNase-free water 91 μl, 5X 2nd strand reaction mix 30 μl, dNTP, 10 mM, 3μl, E coli DNA ligase 1μl, E coli DNA polymerase 1 4μl, RNase H 1μl)130 μl，加入原先 20 μl 經 first strand cDNA synthesis 的樣本。 (2) 輕敲試管數次，然後短暫離心(約 5 秒)，使試劑在試管底部反應。 (3) 在 16 ℃下讓樣本反應 2 小時。 (4) 加入 2 l T4 DNA polymerase，在 16 ℃下讓樣本反應 5 分鐘。 (5) 加入 10 μl EDTA, 0.5 M。. 3.9 Cleanup of double-stranded cDNA (1) 加入 600 μl cDNA binding buffer 至完成 double-stranded cDNA synthesis 得的樣本，vortex 3 秒。 (2) 注意混合液是否變黃，如未變黃需加 10 μl 3M sodium acetate, PH 5.0，使混合液變黃。 (3) 加入 500 μl 的樣本到 cDNA cleanup spin columnn tube 上，在 8000 25.

(32) g 離心 1 min，將濾液丟棄。 (4) 將剩下的樣本加入到 cDNA cleanup spin column 上，在 8,000 g 離心 1 min，將濾液及收集管丟棄。 (5) 將 cDNA cleanup spin column 移到另一新的收集管，加入 750 μl 的 cDNA wash buffer，在 8000 g 離心 1 分鐘，將濾液丟棄。 (6) 將 cDNA cleanup spin column 蓋子打開，以最高速離心 5 分鐘，將濾液及收集管丟棄。 (7) 將 spin column 置放於 1.5 ml 的收集管，pipet 14 μl cDNA elution buffer 在 spin column menbrance，於室溫中放置 1 分鐘，以最高速離心 1 分鐘。. 3.10 Synthesis of Biotin-labeled cRNA (1) 將剛收集的樣本 cDNA(約 12 μl)移到 RNase-free microfuge tubes，加入 10X IVT labeling buffer 4 μl, IVT labeling NTP mix 12 μl, IVT labeling enzyme mix 4 μl，RNase-free water 8 μl，以 microcentrifugation 混合(約 5 秒)。 (2) 在 37 ℃下作用 16 小時。. 3.11 Cleanup and quantification of Biotin-labeled cRNA。 (1) 加 60 μL RNase-free water 至 IVT 反應後的樣本，vortex 三秒。 (2) 加 350 μL IVT cRNA Binding Buffer，vortex 三秒。 (3) 加入 250 μL ethanol (96-100%)混合。 (4) 將樣本 700 μL 加到 IVT cRNA Cleanup Spin Column (含 2 mL 收集管)，以>8000 g 離心 15 秒，將濾液及收集管丟棄。 (5) 將 spin column 換到另一新的 2 mL 收集管，加 500 μL IVT cRNA Binding Buffer 至 spin column，以>8,000 g 離心 15 秒，將濾液丟 26.

(33) 棄。 (6) 加 500 μL 80% (v/v) ethanol 到 spin-column，以>8,000 g 離心 15 秒，將濾液丟棄。 (7) 打開 the spin column and centrifuge 的蓋子，以最高速離心 5 分鐘，將濾液及收集管丟棄。 (8) 將 spin column 換到一個新的 1.5 mL 收集管，加 11 μl RNase-free water 於 spin column menbrance，以最高速離心一分鐘。 (9) 加 10 μl RNase-free water 於 spin column menbrance，以最高速離心一分鐘。. 3.12 Quantification of the cRNA ( Spectrophotometric analysis) 3.13 Fragmenting the cRNA (1) 將完成定量的 cRNA20ug 與 5X fragmentation buffer 8 μl 混合，加入 RNase-free water 直到總體積為 40 μl。 (2) 在 94 ℃下作用 35 分鐘。 (3) 將裂解完成的 cRNA 存於-20 ℃，並使用 Agilent 2100 bioanalyzer 分析裂解狀態(目標: 35-200 bases)。. 3.14 Hybridization (1) 依下列成份比例混合成 hybridizaion cocktail。(見表 3.1). 27.

(34) 表 3.1 hybridization cocktail Component. Amount. Fragmented cRNA. 15μg. Control oligonucleotide B2. 5μl. 20X eukaryotic hybridization. 15μl. controls( bioB, bioC, bioD, cre) Herring sperm. 3μl. DNA( 10mg/ml) BSA( 10mg/ml). 3μl. 2X hybridization buffer. 150μl. DMSO. 30μl. H2O. To final volume of 300μl. Final volume. 300μl. (2) 將 array 在使用前置於室溫，與室溫平衡。 (3) 將 hybridazation cocktail 置於 heat block 加熱到 99 ℃，持續 5 分鐘，移到 45 ℃ heat block，持續 5 分鐘，離心移除無法融解的產物。 (4) 使用適量 1X hybridization buffer 由 septa 注入潤濕 array，並將 array 置於 45 ℃10 分鐘，另需旋轉使 buffer 分佈均勻。 (5) 將 buffer 從 probe array cartridge 移除，注入 250 ul clarified hybridization cocktail。 (6) 將 array 置於 hybridization oven，設定溫度為 45 ℃，以 60 rpm 旋轉。 (7) Hybridize 16 小時 28.

(35) 3.14 Arrays 的清洗、染色與掃描操作 GeneChip Fluidics Station、做自動化的晶片的清洗、染色、以 Gene chip Scanner 3000 掃瞄(詳細操作步驟參照 Affymetrix genechip expression analysis technical manual). 3.15 結果分析 (1) 使用 GeneSpring (http://www.silicongenetics.com)做 gene tree 與 ontology 分析黃連影響基因表現之輪廓[34, 35]。 (2) 使用 Affymetrix gene ontology mining tool (http://affymetrix.com/analysis/netaffx/go_analysis_netaffx4.affx)在 GeneSpring ontology 結果下做更詳細的 ontology 分析。. 29.

(36) 第四章結果 4.1 UV spectrophotometer 及 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測 RNA 數量及品質報告(見表 4.1、圖 4.1) 表 4.1 RNA Purity test Sample ID A Post A B Post B. OD260/280 Ratio. ug/ul 0.93 0.56 1.13 0.66. Approval 1.81 V 1.78 V 1.80 V 1.79 V. 圖 4.1 RNA quality test (by Agilent 2100 Bioanalyzer) 30.

(37) 圖 4.1 continued 4.2 cRNA 品質檢測: 四個樣本 cRNA 的量均大於 0.6μg/μl(見表 4.2)，cRNA fragmentation 後分佈於 35-200bases 間(見圖 4.2) 表 4.2 cRNA 品質檢測 Sample ID A Post A B Post B. cRNA synthesis Fragmentation Input(μl) Product(μg/μl) Approval 0.93 1.81 V 0.56 1.78 V 1.13 1.8 V 0.66 1.79 V 31.

(38) 圖 4.2 cRNA fragmentation test(by Agilent 2100 Bioanalyzer)，RNA ladder 包含六個 transcripts，長度分別為 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、 6.0 kb. 32.

(39) 圖 4.2 continued. 33.

(40) 4.3 基因晶片品質檢測(見表 4.3) 表 4.3 Array output quality report Check items Array image Background Noise B2 oligo performance Hybridization controls Internal control genes. Decriptions Without seriously artifacts 20-100. Definition OK OK OK. Alternating pattern on border Checkerboard pattern at corners. OK. Array name BioB 50%A, 50%P bioC,bioD, and cre:P. OK OK OK. 3’/5’ probe set of GADPH<3 3’/5’ probe set of actin <3. OK OK. OK. 4.4 服用黃連後顯著表現差異達 2 倍、4 倍、8 倍基因(見表 4.4). 表 4.4 服用黃連後表現差異達 2 倍、4 倍、8 倍基因數目受試者 A. 受試者 B. 受試者 A&B 共. 表現差異基因. 表現差異基因. 同表現差異基因. 2 倍上調基因. 1549. 2094. 879. 2 倍下調基因. 1562. 1801. 987. 4 倍上調基因. 263. 481. 63. 4 倍下調基因. 403. 564. 215. 8 倍上調基因. 84. 138. 1. 8 倍上調基因. 143. 221. 44. 34.

(41) 4.5 利用 GeneSpring 使用 5 倍上下調基因，作 Hierarchical clustering，繪出黃連的基因圖譜(見圖 4.5). A-post. A. B- post. B. 圖 4.5 Hierarchical clustering 4.5 使用 GeneSpring ontology analysis 分析黃連的基因表現基因晶片的數據十分龐大，為減低分析的複雜度，兼顧通盤了解黃連作用於人體的機轉的企圖，選擇 3 倍共同上調與 5 倍共同下調的基因作初步探討，以 Biological process 與 molecular function 的分組，了解黃連影響人體基因表現大致輪廓，及進一步深入研究的方向。. 35.

(42) 3 倍上調基因的分佈情形及數目 Biological progress. Cell communication(11) Signal transduction(21). Molecular function. Cell cycle regulator(1) Chaperone(3) Enzyme(21) Immunity protein(3) Nucleic acid binding(8) Singal transducer(3) Structural protein(4) Transport(5). 5 倍下調基因的分佈情形及數目 Biological progress. Cell adhhesion(25) Cell death(5) Cell growth and maintenance(114) Cell surface linked signal transduction(46) Developmental processes(63) Intracellular signaling(156). Molecular function. Apoptosis regulator(13) Cancer(11) Cell cycle regulator(12) Chaperone(15) Enzyme(121) Immunity protein(37) Nucleic acid binding(38) Signal transducer(50) Structural protein(73) Transport(37). 在全盤分析上述分類的基因，可發現黃連對人體免疫功能的基因調控，與黃連臨床抗發炎的療效有一致性的變化，尤其在下調基因變化方面， 36.

(43) 更為明顯，為了更透徹了解黃連對免疫基因的影響，以 Affymetrix gene ontology mining tool 進一步分析兩倍以上的與免疫相關的上下調基因(見表 4.4 及 4.5)。表 4.4 黃連作用後上調達 2 倍以上免疫相關基因 Probe Set ID. Gene Title. Gene Symbol. GO Biological Process Description. GO Molecular Function Description. 1559882_at. SAM domain and HD domain 1. SAMHD1. immune response signal transduction immune response. 1563509_at. FYN binding protein (FYB-120/130). FYB. 1569409_x_at. Inhibin, alpha. INHA. 210439_at. inducible T-cell co-stimulator. ICOS. protein amino acid phosphorylation NLS-bearing substrate import into nucleus immune response signal transduction protein kinase cascade skeletal development ovarian follicle development induction of apoptosis cell cycle arrest cell surface receptor linked signal transduction cell-cell signaling nervous system development response to external stimulus cell differentiation erythrocyte differentiation negative regulation of phosphorylation hemoglobin biosynthesis negative regulation of interferon-gamma biosynthesis negative regulation of B cell differentiation negative regulation of macrophage differentiation positive regulation of follicle-stimulating hormone secretion negative regulation of follicle-stimulating hormone secretion signal transduction negative regulation of progression through cell cycle immune response. catalytic activity 3',5'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity protein binding receptor binding. 219751_at. hypothetical protein FLJ21148. FLJ21148. 231005_at. Hypothetical protein FLJ21148. FLJ21148. humoral immune response positive regulation of cell proliferation signal transduction humoral immune response positive regulation of. 37. cytokine activity hormone activity protein binding growth factor activity activin inhibitor activity hormone activity growth factor activity. growth factor activity. growth factor activity. GO Cellular Component Description Intracellular. nucleus nucleus actin cytoskeleton. extracellular region extracellular region. integral to membrane integral to membrane extracellular region. extracellular region.

(44) 231108_at. Fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma). FUS. 232002_at. Glucose phosphate isomerase. GPI. 232210_at. B-cell CLL/lymphoma 2. BCL2. 232431_at. Nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 (glucocorticoid receptor). NR3C1. 232614_at. B-cell CLL/lymphoma 2. BCL2. 235522_at. C-type lectin domain family 2, member D. OCIL. 235925_at. Transcription factor 12 (HTF4, helix-loop-helix transcription factors 4). TCF12. cell proliferation signal transduction immune response. carbohydrate metabolism gluconeogenesis glycolysis humoral immune response nervous system development hemostasis regulation of progression through cell cycle release of cytochrome c from mitochondria anti-apoptosis humoral immune response negative regulation of cell proliferation regulation of apoptosis apoptosis anti-apoptosis regulation of transcription, DNA-dependent transcription from RNA polymerase II promoter inflammatory response signal transduction transcription transcription, DNA-dependent. regulation of progression through cell cycle release of cytochrome c from mitochondria anti-apoptosis humoral immune response negative regulation of cell proliferation regulation of apoptosis apoptosis anti-apoptosis cell surface receptor linked signal transduction antimicrobial humoral response (sensu Vertebrata) regulation of transcription from RNA polymerase II promoter immune response. 38. nucleotide binding DNA binding RNA binding protein binding zinc ion binding metal ion binding nucleic acid binding RNA binding tumor necrosis factor receptor binding glucose-6-phosphate isomerase activity cytokine activity growth factor activity isomerase activity. nucleus nucleus membrane. protein binding protein self binding protein binding. nucleus mitochondrion mitochondrial outer membrane mitochondrial outer membrane endoplasmic reticulum membrane integral to membrane. transcription factor activity glucocorticoid receptor activity steroid binding protein binding metal ion binding DNA binding transcription factor activity steroid hormone receptor activity receptor activity ligand-dependent nuclear receptor activity glucocorticoid receptor activity zinc ion binding protein binding protein self binding protein binding. nucleus cytoplasm mitochondrial matrix nucleus. nucleic acid binding sugar binding receptor activity transmembrane receptor activity DNA binding RNA polymerase II transcription factor activity. extracellular space. nucleus mitochondrion mitochondrial outer membrane mitochondrial outer membrane endoplasmic reticulum membrane integral to membrane nucleus membrane fraction integral to plasma membrane Nucleus.

(45) 236924_at. Glomulin, FKBP associated protein. GLMN. 237104_at. Cathepsin S. CTSS. 239876_at. Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105). NFKB1. 240870_at. Histone deacetylase 4. HDAC4. 241435_at. V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian). ETS1. development muscle development transcription regulation of transcription, DNA-dependent regulation of transcription vasculogenesis regulation of gene expression, epigenetic negative regulation of T cell proliferation positive regulation of phosphorylation muscle cell differentiation positive regulation of interleukin-2 biosynthesis positive regulation of cytokine secretion proteolysis immune response proteolysis. regulation of transcription, DNA-dependent transcription from RNA polymerase II promoter apoptosis anti-apoptosis inflammatory response signal transduction response to pathogenic bacteria antibacterial humoral response (sensu Vertebrata) transcription regulation of transcription transcription regulation of transcription, DNA-dependent inflammatory response cell cycle development nervous system development chromatin modification B cell differentiation negative regulation of striated muscle development regulation of transcription, DNA-dependent chromatin modification B cell activation transcription regulation of transcription, DNA-dependent transcription from RNA polymerase II promoter immune response negative regulation of cell proliferation. 39. transcription regulator activity. hepatocyte growth factor receptor binding protein binding protein binding. Intracellular. cathepsin S activity cysteine-type endopeptidase activity cathepsin S activity peptidase activity cysteine-type peptidase activity hydrolase activity transcription factor activity protein binding DNA binding transcription factor activity protein binding. extracellular region lysosome lysosome lysosome. histone deacetylase activity transcription factor binding transcriptional repressor activity hydrolase activity protein binding. histone deacetylase complex nucleus cytoplasm nucleus. transcription factor activity RNA polymerase II transcription factor activity DNA binding. Nucleus. nucleus cytoplasm nucleus.

(46) 241737_x_at. Ryanodine receptor 1 (skeletal). RYR1. 244556_at. Lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2 domain containing leukocyte protein of 76kDa). LCP2. cation transport calcium ion transport calcium ion homeostasis muscle contraction transport ion transport calcium ion transport calcium ion transport response to organic substance regulation of progression through cell cycle protein folding apoptosis cell motility protein processing regulation of exocytosis calcium-mediated signaling B cell mediated immunity regulation of endocytosis B cell differentiation B cell proliferation positive regulation of transcription immune response transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway intracellular signaling cascade. receptor activity ryanodine-sensitive calcium-release channel activity calcium ion binding calcium-release channel activity ion channel activity cation channel activity calcium channel activity receptor activity receptor activity ryanodine-sensitive calcium-release channel activity calcium ion transporter activity. smooth endoplasmic reticulum integral to plasma membrane membrane integral to membrane. protein binding protein binding. 表 4.5 黃連作用後下調達 2 倍以上免疫相關基因 Probe Set ID. Gene Title. Gene Symbol. GO Biological Process Description. GO Molecular Function Description. 1552773_at. C-type lectin domain family 4, member D toll-like receptor 4. CLEC4D. immune response. sugar binding. TLR4. signal transduction activation of NF-kappaB-inducing kinase detection of pathogenic bacteria detection of fungi T-helper 1 type immune response macrophage activation positive regulation of interleukin-12 biosynthesis positive regulation of interleukin-1 biosynthesis positive regulation of interleukin-13 biosynthesis positive regulation of interleukin-6 biosynthesis mast cell activation negative regulation of osteoclast differentiation inflammatory response immune response innate immune response immune response. lipopolysaccharide binding transmembrane receptor activity protein binding receptor activity transmembrane receptor activity receptor activity. 1552798_a_at. 40. GO Cellular Component Description integral to membrane integral to plasma membrane membrane lipopolysacchari de receptor complex integral to membrane.

(47) 1553530_a_at. integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen CD29 includes MDF2, MSK12). ITGB1. 1553678_a_at. integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen CD29 includes MDF2, MSK12). ITGB1. 1554406_a_at. C-type lectin domain family 7, member A. CLEC7A. 1554899_s_at. Fc fragment of IgE, high affinity I, receptor for; gamma polypeptide. FCER1G. 1555214_a_at. C-type lectin domain family 7, member A. CLEC7A. 1555756_a_at. C-type lectin domain family 7, member A. CLEC7A. 1555812_a_at. Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta. ARHGDIB. cellular defense response cell adhesion homophilic cell adhesion cell-matrix adhesion integrin-mediated signaling pathway development cellular defense response cell adhesion homophilic cell adhesion cell-matrix adhesion integrin-mediated signaling pathway development phagocytosis, recognition cell recognition carbohydrate mediated signaling T cell activation antibacterial humoral response (sensu Vertebrata) antifungal humoral response (sensu Vertebrata) defense response to pathogenic protozoa reduction of virulence immune response cell surface receptor linked signal transduction. receptor activity protein binding protein binding protein heterodimerization activity protein self binding. integrin complex integrin complex integral to membrane. receptor activity protein binding protein binding protein heterodimerization activity protein self binding. integrin complex integrin complex integral to membrane. sugar binding sugar binding pattern recognition receptor activity receptor activity MHC protein binding. integral to membrane integral to membrane. transmembrane receptor activity receptor signaling protein activity protein binding IgE binding receptor activity. phagocytosis, recognition cell recognition carbohydrate mediated signaling T cell activation antibacterial humoral response (sensu Vertebrata) antifungal humoral response (sensu Vertebrata) defense response to pathogenic protozoa reduction of virulence phagocytosis, recognition cell recognition carbohydrate mediated signaling T cell activation antibacterial humoral response (sensu Vertebrata) antifungal humoral response (sensu Vertebrata) defense response to pathogenic protozoa reduction of virulence immune response negative regulation of cell adhesion Rho protein signal. sugar binding sugar binding pattern recognition receptor activity receptor activity MHC protein binding. plasma membrane integral to plasma membrane membrane integral to membrane integral to membrane integral to membrane. 41. sugar binding sugar binding pattern recognition receptor activity receptor activity MHC protein binding. integral to membrane integral to membrane. Rho GDP-dissociation inhibitor activity GTPase activator activity Rho GDP-dissociation. cytoplasm cytoplasmic membrane-boun d vesicle.

(48) transduction development actin cytoskeleton organization and biogenesis immune response signal transduction immune response inflammatory response response to oxidative stress respiratory gaseous exchange prostaglandin biosynthesis protein folding protein complex assembly intracellular protein transport immune response signal transduction cell proliferation humoral defense mechanism (sensu Vertebrata) antigen presentation, endogenous antigen regulation of macrophage activation negative regulation of apoptosis T cell selection iron ion transport intracellular sequestering of iron ion immune response cell proliferation negative regulation of cell proliferation iron ion homeostasis iron ion homeostasis lipid metabolism cell motility inflammatory response cell surface receptor linked signal transduction. 1559883_s_at. SAM domain and HD domain 1. SAMHD1. 1560587_s_at. peroxiredoxin 5. PRDX5. 1567628_at. CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated). CD74. 200748_s_at. ferritin, heavy polypeptide 1. FTH1. 201012_at. annexin A1. ANXA1. 201422_at. interferon, gamma-inducible protein 30 cornichon homolog (Drosophila). IFI30. immune response. CNIH. 201743_at. CD14 antigen CD14 antigen. CD14. 201963_at. acyl-CoA synthetase long-chain family member 1. ACSL1. immune response intracellular signaling cascade signal transduction phagocytosis apoptosis inflammatory response cell surface receptor linked signal transduction immune response inflammatory response lipid metabolism fatty acid metabolism digestion metabolism fatty acid metabolism. 201653_at. 42. inhibitor activity. catalytic activity 3',5'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity peroxidase activity electron transporter activity oxidoreductase activity antioxidant activity cytokine binding MHC class II protein binding protein self binding unfolded protein binding. intracellular. ferroxidase activity binding ferric iron binding oxidoreductase activity kinase binding metal ion binding iron ion binding iron ion binding. plasma membrane ferritin complex. phospholipase inhibitor activity receptor binding calcium ion binding calcium ion binding calcium-dependent phospholipid binding phospholipase A2 inhibitor activity phospholipase inhibitor activity phospholipid binding oxidoreductase activity. mitochondrion peroxisome mitochondrion peroxisome intracellular membrane integral to membrane integral to membrane. extracellular region lysosome membrane integral to membrane. peptidoglycan receptor activity. plasma membrane extrinsic to membrane membrane. magnesium ion binding long-chain-fatty-acid-CoA ligase activity ligase activity catalytic activity. integral to membrane.

(49) immune response 202833_s_at. serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1. SERPINA 1. acute-phase response. 202859_x_at. interleukin 8. IL8. 202877_s_at. complement component 1, q subcomponent, receptor 1 complement component 1, q subcomponent, receptor 1 complement component 1, q subcomponent, receptor 1. C1QR1. angiogenesis cell motility chemotaxis cell cycle arrest G-protein coupled receptor protein signaling pathway intracellular signaling cascade cell-cell signaling sensory perception negative regulation of cell proliferation calcium-mediated signaling regulation of cell adhesion neutrophil chemotaxis neutrophil activation regulation of retroviral genome replication induction of positive chemotaxis chemotaxis inflammatory response immune response inflammatory response cell adhesion signal transduction phagocytosis cell-cell adhesion macrophage activation cell adhesion blood coagulation. C1QR1. phagocytosis cell-cell adhesion macrophage activation cell adhesion blood coagulation. 202902_s_at. cathepsin S. CTSS. proteolysis immune response proteolysis. 202988_s_at. regulator of G-protein signalling 1. RGS1. 203535_at. S100 calcium binding protein A9 (calgranulin. S100A9. immune response signal transduction G-protein signaling, adenylate cyclase inhibiting pathway negative regulation of signal transduction B cell activation inflammatory response cell-cell signaling. 202878_s_at. 43. long-chain-fatty-acid-CoA ligase activity sugar binding serine-type endopeptidase inhibitor activity protein binding endopeptidase inhibitor activity serine-type endopeptidase inhibitor activity endopeptidase inhibitor activity interleukin-8 receptor binding protein binding chemokine activity cytokine activity chemokine activity interleukin-8 receptor binding. extracellular region. extracellular space soluble fraction extracellular region extracellular space. complement component C1q binding receptor activity calcium ion binding protein binding sugar binding receptor activity protein binding complement component C1q binding receptor activity calcium ion binding protein binding sugar binding receptor activity protein binding cathepsin S activity cysteine-type endopeptidase activity cathepsin S activity peptidase activity cysteine-type peptidase activity hydrolase activity signal transducer activity GTPase activator activity calmodulin binding. integral to membrane integral to membrane. signal transducer activity calcium ion binding. extracellular space. integral to membrane integral to membrane. extracellular region lysosome lysosome lysosome. plasma membrane.

(50) 203561_at. B) Fc fragment of IgG, low affinity IIa, receptor (CD32). FCGR2A. immune response. regulation of transcription, DNA-dependent transcription from RNA polymerase II promoter immune response antimicrobial humoral response (sensu Vertebrata). 203574_at. nuclear factor, interleukin 3 regulated. NFIL3. 203645_s_at. CD163 antigen. CD163. 203922_s_at. cytochrome b-245, beta polypeptide (chronic granulomatous disease). CYBB. 203923_s_at. cytochrome b-245, beta polypeptide (chronic granulomatous disease). CYBB. 203932_at. major histocompatibility complex, class II, DM beta major histocompatibility complex, class II, DM beta Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor (CD16a) Fc fragment of IgG, low affinity IIIb, receptor (CD16b) interferon regulatory factor 8 interferon regulatory factor 8. HLA-DM B. 204122_at. TYRO protein tyrosine kinase binding protein. TYROBP. 204174_at. arachidonate 5-lipoxygenase-activati ng protein. ALOX5AP. 204232_at. Fc fragment of IgE, high affinity I, receptor for; gamma polypeptide. FCER1G. 204006_s_at. 204057_at. FCGR3A FCGR3B. IRF8. electron transport ion transport inflammatory response antimicrobial humoral response (sensu Vertebrata) transport generation of precursor metabolites and energy electron transport ion transport inflammatory response antimicrobial humoral response (sensu Vertebrata) transport generation of precursor metabolites and energy immune response detection of pest, pathogen or parasite antigen presentation, exogenous antigen antigen processing, exogenous antigen via MHC class II immune response. negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter transcription regulation of transcription, DNA-dependent immune response immune response cellular defense response intracellular signaling cascade signal transduction inflammatory response leukotriene biosynthesis leukotriene metabolism leukotriene metabolism immune response cell surface receptor linked signal transduction. 44. calcium ion binding receptor activity receptor signaling protein activity IgG binding DNA binding DNA binding transcription factor activity transcription corepressor activity scavenger receptor activity scavenger receptor activity scavenger receptor activity voltage-gated ion channel activity electron transporter activity iron ion binding oxidoreductase activity metal ion binding ion channel activity. plasma membrane integral to membrane nucleus nucleus. membrane extracellular region integral to plasma membrane mitochondrion membrane integral to membrane. voltage-gated ion channel activity electron transporter activity iron ion binding oxidoreductase activity metal ion binding ion channel activity. mitochondrion membrane integral to membrane. MHC class II receptor activity. membrane integral to membrane. receptor activity IgG binding. plasma membrane integral to membrane membrane. RNA polymerase II transcription factor activity, enhancer binding DNA binding transcription factor activity. nucleus. receptor signaling protein activity. integral to plasma membrane integral to membrane membrane fraction integral to membrane plasma membrane integral to plasma membrane membrane integral to. binding enzyme activator activity enzyme activator activity transmembrane receptor activity receptor signaling protein activity protein binding IgE binding receptor activity.