中空纖維液相微萃取技術結合纖維/電噴灑質譜法之開發與應用

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(1)國立臺灣師範大學化學系博士論文. 指導教授︰林震煌博士（Cheng-Huang Lin）. 中空纖維液相微萃取技術結合纖維/電噴灑質譜法之開發與應用. The development and applications of an on-line microextraction method based on fiber-spray mass spectrometry. 研究生：劉亞汶（Yea-Wenn Liou）. 中. 華. 民. 國. 一. ○. 八. 年. 一. 月.

(2) 目錄第一章緒論 1-1 環境游離質譜法發展概述……………………………………… 1 1-2 中空纖維液相微萃取之原理與應用…………………………… 5 1-3 濫用藥物之介紹及檢驗方法 ………………………………… 9 1-4 嘉磷塞 (glyphosate)之介紹及檢驗方式…………………… 12. 第二章實驗方法 2-1 實驗藥品…………………………………………………………16 2-2 實驗儀器及周邊設備……………………………………………17 2-3 電噴灑質譜儀之條件設定………………………………………19 2-4 液相層析質譜儀之條件設定……………………………………19 2-5 藥品配製及樣品製備……………………………………………20 2-5-1 MDMA 標準品溶液配製 ………………………………………20 2-5-2 濫用藥物粉末(含有 MDMA 及愷他命)之標準品溶液配製…20 2-5-3 添加濫用藥物之尿液樣品配製 ……………………………20 2-5-4 嘉磷塞標準溶液配製 ………………………………………21 2-5-5 年年春溶液配製 ……………………………………………21 2-5-6 青椒樣品製備 ………………………………………………21.

(3) 2-5-7 黃豆樣品製備 ………………………………………………22 2-6 中空纖維液相微萃取實驗裝置 ………………………………23 2-7 中空纖維液相微萃取實驗步驟 ………………………………24 2-7-1 中空纖維之前處理 …………………………………………24 2-7-2 萃取 MDMA 及愷他命…………………………………………24 2-7-3 萃取嘉磷塞 …………………………………………………26 2-8 纖維電噴灑質譜法 ……………………………………………27 2-9 中空纖維液相微萃取技術結合纖維電噴灑質譜法 …………29 2-10 纖維電噴灑質譜法位置最佳化 ………………………………32. 第三章以中空纖維液相微萃取技術結合纖維噴灑譜法檢測濫用藥物 3-1 中空纖維液相微萃取濫用藥物藥粉之條件最佳化 …………35 3-1-1 液膜溶液對濫用藥物萃取效率的影響 ……………………35 3-1-2 萃取溶劑對濫用藥物萃取效率的影響 ……………………36 3-1-3. 樣品溶液 pH 值對萃取濫用藥物效率之影響………………37. 3-1-4. 氯化鈉濃度對濫用藥物萃取效率的影響 …………………39. 3-1-5. 萃取時間對濫用藥物萃取效率之影響 ……………………41. 3-2 萃取 MDMA 標準品………………………………………………43 3-3 萃取愷他命標準品 ……………………………………………45.

(4) 3-4 濫用藥物粉末成分分析 ………………………………………47 3-5 在尿液樣品中檢測濫用藥物粉末中的 MDMA 及愷他命………49 3-6 濫用藥物檢測方法之比較…………………………………… 51. 第四章以中空纖維液相微萃取技術結合纖維噴灑譜法檢測嘉磷塞 4-1 以電噴灑質譜法檢測嘉磷塞標準品 …………………………53 4-2 以電噴灑質譜法檢測年年春中的嘉磷塞 ……………………56 4-3 中空纖維液相微萃取嘉磷塞條件最佳化 ……………………58 4-3-1 液膜溶液對嘉磷塞萃取效率之影響 ………………………58 4-3-2 萃取溶劑對嘉磷塞萃取效率之影響 ………………………60 4-3-3 樣品溶液 pH 值對嘉磷塞萃取效率之影響…………………60 4-3-4 萃取時間對嘉磷塞萃取效率之影響 ………………………61 4-4 萃取嘉磷塞標準品 ……………………………………………63 4-5 萃取年年春中所含之嘉磷塞 …………………………………65 4-6 檢驗青椒表面殘留之嘉磷塞 …………………………………67 4-7. 檢驗黃豆中殘留之嘉磷塞 ……………………………………73. 4-8. 改造微萃取裝置縮短萃取時間 …………………………… 75. 4-9. 嘉磷塞檢測方法之比較 …………………………………… 78.

(5) 第五章結論…………………………………………………………80. 第六章參考文獻……………………………………………………81. 附錄一期刊論文……………………………………………………93 附錄二研討會口頭發表……………………………………………95.

(6) 圖目錄圖 1-1 環境游離質譜法之採樣及游離方式示意圖…………………4 圖 1-2 聚丙烯中空纖維之電子顯微鏡影像…………………………5 圖 1-3 中空纖維液相微萃取實驗裝置示意圖 …………………… 6 圖 1-4 台灣地區 98 年～107 年 1 月濫用藥物尿液檢驗統計圖 …10 圖 1-5 本研究檢測之濫用藥物結構式 (A)愷他命 (B)MDMA ……11 圖 1-6 嘉磷塞及其代謝物 AMPA 的結構式 ……………………… 12 圖 2-1 自製中空纖維液相微萃取槽實景圖……………………… 23 圖 2-2 中空纖維液相微萃取 MDMA 及愷他命實景圖 …………… 25 圖 2-3 中空纖維液相微萃取嘉磷塞實景圖……………………… 26 圖 2-4 多孔聚丙烯中空纖維電噴灑實驗產生之泰勒錐實景圖 …28 圖 2-5 線上微萃取纖維電噴灑質譜法示意圖 ……………………30 圖 2-6 電噴灑實驗產生之泰勒錐實景圖………………………… 31 圖 2-7 三維平移台實景圖 …………………………………………32 圖 2-8 線上微萃取纖維電噴灑質譜法實景圖 ……………………33 圖 2-9 離子強度與纖維位置關係圖 ………………………………34 圖 3-1 濫用藥物離子強度與樣品溶液 pH 值關係圖………………38 圖 3-2 濫用藥物離子強度與氯化鈉濃度關係圖 …………………40 圖 3-3 愷他命離子強度與萃取時間關係圖 ………………………42.

(7) 圖 3-4 MDMA 標準品萃取前(左)及萃取後(右)之纖維電噴灑質譜圖 …………………………………………………………………44 圖 3-5 愷他命標準品萃取前(左)及萃取後(右)之纖維電噴灑質譜圖 ……………………………………………………………46 圖 3-6 濫用藥物粉末之液相層析圖 ………………………………48 圖 3-7 濫用藥物粉末尿液樣品之纖維電噴灑質譜圖 (A)萃取前(B)萃取後 ………………………………………50 圖 4-1 嘉磷塞標準品水溶液之電噴灑質譜圖 ……………………54 圖 4-2 嘉磷塞於鹽酸水溶液中之斷裂途徑 ………………………55 圖 4-3 年年春水溶液之電噴灑質譜圖 ……………………………57 圖 4-4 aliquat 336 結構式 ………………………………………59 圖 4-5 嘉磷塞離子強度與萃取時間關係圖 ………………………62 圖 4-6 嘉磷塞標準品水溶液之纖維電噴灑質譜圖 ………………64 圖 4-7 年年春水溶液之纖維電噴灑質譜圖 ………………………66 圖 4-8 毛筆採樣青椒表面殘留之嘉磷塞以纖維電噴灑質譜法進行檢測之步驟示意圖…………………………………………68 圖 4-9 毛筆採樣青椒表面殘留之嘉磷塞以纖維電噴灑質譜法檢測之質譜圖……………………………………………………70.

(8) 圖 4-10 以纖維電噴灑質譜法檢測青椒基質中殘留嘉磷塞之質譜圖 (A) 青椒溶液萃取前 (B) 青椒溶液添加 1 ppb glyphosat 萃取後………………………………………………………72 圖 4-11 以纖維電噴灑質譜法檢測黃豆基質中殘留嘉磷塞之質譜圖 (A) 10 ppm 嘉磷塞萃取前 (B) 10 ppb 嘉磷塞萃取後 74 圖 4-12 改良前後之微萃取槽示意圖………………………………75 圖 4-13 改良前後微萃取槽之檢測嘉磷塞離子強度與萃取時間關係圖 (A)改良前 (B)改良後…………………………………77.

(9) 表目錄表 1-1 嘉磷塞殘留容許量彙整表 ……………………………… 14 表 3-1 液膜溶液對濫用藥物萃取效率的影響 ……………………35 表 3-2 萃取溶劑對濫用藥物萃取效率的影響 ……………………36 表 3-3 各種質譜法偵測濫用藥物之比較 …………………………52 表 4-1 液膜溶液對嘉磷塞萃取效率的影響 ………………………59 表 4-2 萃取溶劑對嘉磷塞萃取效率的影響 ………………………60 表 4-3 各種質譜法偵測嘉磷塞之比較 ……………………………79.

(10) 摘. 要. 本研究開發了使用多孔中空纖維液相微萃取技術 (Hollow fiber liquid phase microextraction，簡稱 HF-LPME)結合纖維電噴灑質譜法 (fiber-spray/mass spectrometry)的檢測技術。由 3D 列印製作一個纖維容槽，用於連接中空纖維和電噴灑針。平口纖維前端於電噴灑時亦可形成泰勒錐，其中產生的離子可透過質譜儀進行檢測。本研究設計和測試的微萃取槽由離心管（用於樣品溶液儲存）和一枚多孔中空纖維（用於樣品萃取）所構成。當萃取槽的纖維被放置於質譜入口和電噴灑針間時，從樣品溶液中被萃取出來分析物，因蒸發而隨溶劑從纖維表面逸出。當蒸發出來的分析物與電噴灑輔助溶劑的帶電粒子接觸時，分析物將被游離而能透過質譜儀進行檢測。使用此裝置，以濫用藥物 3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺 (MDMA)為分析物時，透過中空纖維液相微萃取可將偵測極限提高約 360 倍，此方法對 MDMA 的偵測極限為 2 ng/mL。此方法除可應用於濫用藥物的檢測外，亦可應用於農藥殘留的檢驗，本研究使用非侵入性方法採樣，以沾水的毛筆在青椒表面來回塗抹 10 次，收集殘留於青椒表面的嘉磷塞 (glyphosate)，再將採樣後的毛筆放入已完成萃取準備的微萃取槽中，讓筆毛上的嘉磷塞脫附並溶解於微萃取槽的 0.1 M 氫氧化鈉溶液中進行萃取，最終以纖維電噴灑質譜法進行.

(11) 檢測。使用此方法，嘉磷塞的偵測極限為 1 ng/cm2，與青椒樣品均質化再添加嘉磷塞後所測得的偵測極限相同。在樣品均質化的黃豆基質中檢測嘉磷塞，透過線上微萃取技術則可將偵測極限提升 1000 倍。. 關鍵字：纖維/電噴灑質譜法，中空纖維液相微萃取，嘉磷塞.

(12) Abstract A novel fiber-spray/mass spectrometry method using a piece of a porous hollow fiber is described. An adapter, fabricated by a 3D-printer, was designed to connect the fiber and a standard ESI (electro-spray ionization) needle, in which a Taylor cone was formed and the resulting ions were detected by a mass spectrometer. Since a porous hollow fiber is usually used for microextraction, the so-called hollow fiber liquidphase microextraction (HF-LPME) method, a new methodology that involves coupling HF-LPME and fiber-spray, was developed for the first time. We reported herein on the design and testing of a microextraction kit. The kit consists of a centrifuge tube (reservoir for the sample solution) and a piece of a porous hollow fiber (for sample extraction). The kit was placed between the mass inlet and the ESI needle. Using the kit, analytes can be extracted from a very dilute solution and then evaporate and escape from the fiber surface. When they make contact with the ESI plume, which arises from the ESI needle tip, the molecules are ionized and then detected by a mass spectrometer. Using the setup, it was possible to improve the limit of detection after microextraction by ∼360-fold when MDMA (3,4-methylenedioxymethamphetamine) was analyzed, and the limit of detection of 2 ng/mL was achieved. We also reported on a novel on-line microextraction technique, in which a watercolor pen was used for sample collection and a section of porouspolypropylene hollow fiber was used for sample concentration by means of liquid-liquid microextraction. In order to achieve this, a kit was well designed and tested. The kit consists of a watercolor pen, a section of porous-polypropylene hollow fiber and a centrifuge tube. It can be.

(13) placed between the mass inlet and the ESI needle. Using this configuration, glyphosate, collected from a green pepper surface, can be extracted from a very dilute solution and then evaporates and escapes from the fiber surface.. When glyphosate molecules make contact with. the ESI plume, which arises from the ESI needle tip, they were ionized and then detected by a mass spectrometer. Using the setup, it was possible to improve the limit of detection for glyphosate after microextraction by ~1000-fold, resulting in a limit of detection of 1 ng/cm2.. key words: fiber spray/mass spectrometry, hollow fiber liquid phase microextraction, glyphosate.

(14) 第一章緒論 1-1 環境游離質譜法發展概述電噴灑游離法(Electrospray ionization)於 1989 年由諾貝爾化學獎得主 J. B. Fenn 所提出，以極性分子溶劑(如甲醇或水)將溶液中的分析物分子游離，並於大氣壓力下將離子從液態轉換成氣態，提供完整分子離子讓質譜儀進行檢測。此特性使得質譜分析能有效簡化樣品前處理過程，因而大幅縮減了質譜分析所需之時間，讓質譜分析應用更加簡單及普及，開啟了環境游離法廣泛應用於質譜分析之濫觴 [1]。脫附電噴灑游離法 (Desorption electrospray ionization ) 於 2004 年由 Cooks 發表 [2]，以電噴灑之帶電液滴衝擊分析物載體，使分析物脫附及游離；隔年，實時分析 (Direct analysis in real time) 也首次被發表，且商業儀器於兩年後上市，此方法無須其他樣品前處理步驟，可將不同形狀及狀態的樣品放入實時分析游離源中便可即時提供分析數據 [3]。簡易環境聲波噴灑游離法 (easy ambient sonic spray ionization) [4]、雷射輔助脫附電噴灑游離法 (electrospray-assisted laser desorption ionization) [5-8]也已於近幾年被開發使用。紙片電噴灑質譜法 (paper spray-mass spectrometry)於 2010 年被發表，將樣品直接 1.

(15) 滴在被溶劑潤濕的紙片上，並經由紙片上的高壓電游離便可得到偵測訊號，開啟了環境游離質譜分析新的一頁 [9-22]。上述介紹應用於質譜分析的環境游離法，其終極目標是要應用於醫學的診斷測試 [23-26]並被廣泛使用，因為這些方法具有簡單及直接游離樣品的特性，因而能大幅提升質譜分析的速度，增加了質譜儀應用於臨床醫學的可行性。近年來更有些新的採樣及游離方法被應用於質譜分析，甚至可將活體組織樣品以電噴灑游離後，再以質譜儀進行偵測，如刀片塗覆游離法 (coated blade spray) [27]、生物相容性固相微萃取結合大氣壓游離法 (biocompatible solid-phase microextraction to atmospheric pressure ionization) [28]、棉花棒接觸噴灑游離法(swab touch spray) [29-30]，亦有洋菜凍皮膚採樣結合質譜偵測的方法 [31-32]。棉花棒電噴灑顯現出另一種電噴灑材料的可能性，由於棉花棒是橢圓形的多孔隙物質，且棉花棒具有採樣及電噴灑兩種功能，其上滴加的分析物可藉由電噴灑而游離並進行偵測。金屬探針亦可用於採樣，並透過熱脫附電噴灑游離質譜法 (thermal desorption electrospray ionization mass spectrometry)進行偵測 [33]。. 2.

(16) 儘管上述各種方法在靈敏度，精密度和使用簡便性等方面都有其獨特的優缺點，但線上濃縮技術與環境游離質譜法同步聯用尚未有相關報導。本研究則開發了一個新的方法，將中空纖維液相微萃取(hollow fiber liquid phase microextraction)技術與環境游離質譜同步聯用，稱為纖維電噴灑質譜法(fiber-spray mass spectrometry)。圖 1-1 列舉四個應用於環境游離質譜法的採樣及游離方式之示意圖，本研究開發的纖維電噴灑質譜法則如圖 1-1(D)所示。. 3.

(17) 圖 1-1 環境游離質譜法之採樣及游離方式示意圖 (A)木籤電噴灑游離質譜法 (B)棉花棒接觸電噴灑游離質譜法 (C)金屬探針採樣結合熱脫附游離質譜法 (D)纖維電噴灑質譜法. 4.

(18) 1-2 中空纖維液相微萃取之原理與應用聚丙烯 (polypropylene)纖維具有強度高、韌性好、化學惰性及價格低等優點，被廣泛應用於製藥、化工等工業。本研究使用之多孔聚丙烯中空纖維，內徑為 0.6 mm，厚度為 0.2 mm，纖維表面之平均孔隙大小為 200 nm，其截面之電子顯微鏡影像如圖 1-2 所示。. 圖 1-2 聚丙烯中空纖維之電子顯微鏡影像. 5.

(19) 中空纖維液相微萃取實驗裝置如圖 1-3 所示，含有分析物的樣品溶液置於樣品瓶中，藉由調整樣品溶液之 pH 值，使分析物處於非解離狀態以降低分析物在樣品溶液中的溶解度。舉例來說，欲萃取樣品溶液中的鹼性分析物，則須將樣品溶液調整至鹼性，使處在非解離狀態的分析物穿過纖維孔洞中的液膜 (通常為不溶於水的有機溶劑，可隔絕萃取溶劑與樣品溶液)，並進入酸性萃取溶劑中解離，此時解離後的分析物將無法再穿透液膜回到樣品溶液中，而溶解於纖維內腔的萃取溶劑中，達到萃取的目的。. 圖 1-3 中空纖維液相微萃取實驗裝置示意圖. 6.

(20) 以本研究所使用的三相中空纖維液相微萃取為例，目標分析物經過有機輔助液膜後，最後被萃取到纖維內腔的受體溶液中，其反應平衡式如下所示:. 其中，A 為目標分析物，考慮樣品溶液和有機溶液的分配係數以及有機溶液和受體溶液的分配係數 K 後，可以下述方程式來計算反應平衡後的回收率. Ceq,org 為平衡時 A 在有機溶液中的濃度 Ceq,sample 為平衡時 A 在樣品溶液中的濃度 Ceq,acceptor 為平衡時 A 在受體溶液中的濃度在液相微萃取系統達反應平衡時，目標物 A 的總質量不變，所以根據上面兩式可推出回收率 R. Vacceptor 為受體溶液的體積 Vorg 為有機輔助液膜的體積 7.

(21) Vsample 為樣品溶液的體積一般而言，選擇適當的有機溶劑及將樣品溶液調整至適當的 pH 值，可得到較高的分配係數，並可提高回收率。因此，在萃取鹼性化合物時，樣品溶液的 pH 值理想上要高於分析物的 pKa+3，而受體溶液應為酸性，且其 pH 值低於分析物的 pKa-3 為佳。為了確保得到高回收率，樣品溶液與有機溶劑的體積應盡可能越少越好。中空纖維液相微萃取相較於薄膜液相萃取，除可大量減少有機溶劑的使用，是符合綠色化學的實驗方法外，亦可有效達到分析物濃縮的效果。由於中空纖維液相微萃取技術是一種簡單的樣品製備方法 [34-36]，常聯用於氣相層析質譜 (gas chromatography/mass spectrometer, GC-MS) [37]，液相層析質譜 (liquid chromatography/mass spectrometer, LC-MS) [38]，毛細管電泳 (capillary electrophoresis,CE) [39-40]和環境游離質譜 [4142]，也有許多研究案例可以參考，包括抗癌藥物的篩選和定量 [43]，濫用藥物的測定 [44-48]，非類固醇類抗炎藥物 [49]和農藥分析 [50-53]等。. 8.

(22) 1-3. 濫用藥物之介紹及其檢驗方法濫用藥物之法定檢測方法為氣相層析質譜法。近年來有許多研. 究為了提升檢驗濫用藥物的靈敏度，會先將樣品經中空纖維液相微萃取後，再將萃取濃縮後的分析物以注射針移轉至氣相層析質譜儀、液相層析質譜儀或毛細管電泳質譜儀進行偵測。依據我國衛生福利部食品藥物管理署 107 年 1 月之藥物濫用案件暨檢驗統計資料及台灣地區 98 年～107 年 1 月濫用藥物尿液檢驗統計圖所示(圖 1-4)，不難發現愷他命(ketamine)是濫用藥物中被檢出陽性比例最高的，而 MDMA (3,4-methylenedioxy-Nmethamphetamine)被檢驗出陽性比例則位居第五。. 9.

(23) 圖 1-4 台灣地區 98 年～107 年 1 月濫用藥物尿液檢驗統計圖. 10.

(24) 愷他命於我國法律歸為三級毒品，其結構式如圖 1-5 (A)所示，若長期濫用不但會對精神及認知產生不良影響，更將在生理上產生腹痛及潰瘍性膀胱炎等損傷；MDMA 則屬於苯丙胺類興奮劑，於本國法律歸類為二級毒品，其結構式如圖 1-5 (B)所示，若長期濫用會產生上癮及記憶問題，生理上則會出現大量流汗、心跳過速等症狀，亦可能因體溫過高及脫水而死亡。本研究選擇愷他命及 MDMA 為樣品，在尿液中進行檢測，結果發現以線上微萃取技術結合纖維電噴灑質譜法可以將愷他命及 MDMA 離子強度提高約 360 倍，且其偵測極限約為 2 ng/mL (s/n>3)。. 圖 1-5 本研究檢測之濫用藥物結構式 (A)愷他命 (B)MDMA. 11.

(25) 1-4. 嘉磷塞 (glyphosate)之介紹及檢驗方式嘉磷塞是一種廣譜性的有機磷除草劑，以阻斷植物合成生長所. 需之胺基酸，如酪胺酸 (tyrosine)，色胺酸 (tryptophan)和苯丙胺酸 (phenylalanine)等合成途徑為其除草機制，因而可殺死大多數的植物。嘉磷塞極易被土壤所吸附，而被其中的微生物降解為氨甲基磷酸（aminomethylphosphoric acid，簡稱 AMPA），嘉磷塞及其代謝物 AMPA 的結構式如圖 1-6 所示。. 圖 1-6 嘉磷塞及其代謝物 AMPA 的結構式. 12.

(26) 嘉磷塞的商品名稱為年年春(Roundup)，在全球被廣泛販售及使用。年年春中含有嘉磷塞異丙胺鹽(glyphosate isopropylamine)、界面活性劑和水等成分可以非常有效地殺死雜草，上市後已應用於農業、園藝、造林、居家花園維護等範疇。儘管使用嘉磷塞來除草被認為是無害的，但從流行病學資訊、腸道微生物對人體健康和疾病形成的相關報告中，嘉磷塞對生物的影響逐漸引起重視。其中，嘉磷塞會抑制細胞色素 P450（CYP）酶的作用而可能對哺乳動物具有毒性，主因是因 CYP 酶對外源性化學物質可產生解毒作用，此作用對生物是否健康至關重要；若嘉磷塞抑制了 CYP 酶，相對將增強其他食品中化學殘留物和環境毒素對生物體的損害 [54]。依據相關報導，嘉磷塞可能與多種疾病有關，包括自閉症，氧化損傷和神經毒性 [55]，帕金森氏症 [56-58]，阿茲海默症 [59]和癌症 [6062]。因此，開發一個簡單、直接且靈敏的方法來檢測嘉磷塞非常重要。近年來，有許多報導旨在開發一種靈敏的方法來偵測嘉磷塞，如以氣相層析質譜法來檢測人體血清中或地下水及土壤中殘留的嘉磷塞 [63-65]，或以液相層析質譜法檢測植物中的嘉磷塞 [6667]；此外，預濃縮方法也被報導，例如液膜萃取技術與高效液相層析儀 (HPLC）聯用或與液相層析質譜質譜 (LC-MS/MS)聯用 [68-71] 13.

(27) 以檢測嘉磷塞。然而，這些方法皆需要相當的程度及耗時的樣品預處理。許多國家法定以 LC-MS/MS 來檢測嘉磷塞及其主要代謝物 AMPA，我國衛生福利部食品藥物管理署亦同，法定嘉磷塞殘留容許量如表 1-1 所示。. 表 1-1 嘉磷塞殘留容許量彙整表. 14.

(28) 本研究結合過去於本實驗室已開發的兩種質譜技術，包括水彩筆非侵入性採樣 [72-73]及線上微萃取結合纖維電噴灑質譜法 [74]，選擇法定殘留容許量最低的青椒及法定殘留容許量最高的黃豆為基質，檢測其中所含有的嘉磷塞。結果發現，以此方法檢測青椒樣品殘留嘉磷塞的偵測極限為 1 ng/mL 與樣品均質化後所測得的偵測極限相同。使用樣品均質化方法檢測黃豆基質中殘留的嘉磷塞，透過線上微萃取技術則可將偵測極限提升 1000 倍。. 15.

(29) 第二章實驗方法 2-1 實驗藥品項次 1 2. 藥名. 廠牌/來源. 3,4-methylenedioxyN-methamphetamine 憲兵司令部刑事鑑識中心 (MDMA) 提供 ketamine. 化學式 C11H15NO2 C13H16ClNO. 3. glyphosate. CHEM service. C3H8NO5P. 4. sodium chloride. Sigma-Algrich. NaCl. 5. sodium hydroxide. J. T. Baker. NaOH. 6. hydrochloride acid. Acros. HCl. 7. methanol. Merck. CH3OH. 8. ammonium ethanoate. Acros. CH₃COONH₄. 9. acetonitrile. Merck. CH3CN. 10. dodecane. Sigma-Algrich. C12H26. 11. octanol. Acros. C8H15OH. 12. aliquat 336. Acros. C25H54ClN. 13. acetone. Mallinckrodt. CH3OCH3. 14. nitrogen gas. 豐明. N2. 15. helium. 豐明. He. 16. 分子量 193 237 169 58 40 36 32 77 41 170 130 404 58 28 4.

(30) 2-2 實驗儀器及周邊設備項次. 名稱. 製造廠商 Thermo. 1. 2. 3. 液相層析質譜儀. Finnigan. Liquid phase chromatography mass spectrometry (LC/MS). Thermo. 迴轉泵. Finnigan Edwards. 型號 LCQ. LCQ Deca XP plus. EM30. rotary vacuum pump 4. 5. 液相層析管柱. Nacalai. HPLC column. Tesque. 溶劑除氣機. Thermo. Solvent degasser 6. 高效液相層析泵. Thermo. HPLC Pump 7. 桌上型電子顯微鏡. Cosmosil 5C18-MS SpectraSystem SCM1000 SpectraSystem P4000. Hitachi. TM3030. KDS. KDS100. Sartorius. MSA125P-100-DA. scanning electron microscope 8. 注射幫浦 syringe pump. 9. 智慧型半微量天平 semi-micro balance. 10. 超音波震盪器. BRANSON. 3510. ultrasonic oscillator 11. 數位式攪拌器. AS ONE. electromagnetic heating mixer 17. Rexim RS-4DN.

(31) 12. 高速離心機. EVELA. CVE1000. Eppendorf. Research micropipet. EYELA. CVE-1000. Membrana. PPQ3/1. Horiba. NaVi F-52. WONDER. WH-M01J. PureTech. PVDF013N022IM. centrifugal evaporator 13. 微量吸量管 micropipet. 14. 離心管 centrifuge tube. 15. 多孔聚丙烯中空纖維 porous polypropylene hollow fiber. 16. 酸鹼度計 pH meter. 17. 隨行杯果汁機 blender. 18. 針筒過濾器 Syringe filter. 18.

(32) 2-3 電噴灑質譜儀之條件設定本研究所使用的質譜儀之型號為 Thermal Finnigan LCQ Deca XP Plus。以全掃瞄模式進行實驗，偵測範圍為 m/z 50~1000。實驗數據以 Xcalibur 軟體紀錄並轉換成 ASCII 檔案格式儲存。實驗進行時，輔助液體的流速設定為 45 μL/min，濫用藥物之檢測使用正電模式進行實驗(+4.5 kV)，毛細管溫度為 275℃，毛細管電壓為 14 V；嘉磷塞之檢測之檢驗則使用負電模式進行實驗(-5 kV)，毛細管溫度為 275℃，毛細管電壓為-23 V。. 2-4 液相層析質譜儀之條件設定本研究所使用的液相層析質譜儀之型號為 Thermal Finnigan LCQ Classic LC/MS/MS，並選用 Cosmosil 5C18-MS 為液相層析管柱。以全掃瞄模式進行實驗，偵測範圍為 m/z 100~300。實驗數據以 Xcalibur 軟體紀錄並轉換成 ASCII 檔案格式儲存。實驗進行時，以 0.03 M 醋酸銨(NH4Cl)溶液為動相 A，以乙腈(CH3CN)為動相 B，動相溶液混合比例為 50％ A + 50％ B，且動相溶液的流速設定為 1 mL/min，濫用藥物之分析使用正電模式進行實驗(+3.0 kV)，毛細管溫度為 200℃，毛細管電壓為 14 V。. 19.

(33) 2-5 藥品配製及樣品製備 2-5-1 MDMA 標準品溶液配製取 0.021 公克 MDMA 溶於 10.5 毫升去離子水中，以超音波震盪 5 分鐘後，製備成 2000 ppm 標準品溶液，再以此溶液稀釋成下述實驗用之樣品溶液。. 2-5-2 濫用藥物粉末(含有 MDMA 及愷他命)之標準品溶液配製取 0.031 公克濫用藥物粉末溶解於 124.88 毫升去離子水中，以超音波震盪 5 分鐘後，製備成 250 ppm 標準品溶液，再以此溶液適量添加成下述實驗用之樣品溶液。. 2-5-3 添加濫用藥物粉末之尿液樣品配製取 2 毫升志願者之尿液加入 18 毫升去離子水後，於其中添加 1 μg/mL 濫用藥物粉末，再加入 4 公克氯化鈉，以超音波震盪 5 分鐘混和均勻後，以 1 M 氫氧化鈉溶液調整溶液 pH 值為 12。. 20.

(34) 2-5-4 嘉磷塞標準溶液配製取 0.011 公克嘉磷塞溶於 11 毫升去離子水中，以超音波震盪 5 分鐘後，製備成 1000 ppm 標準品溶液，再以此溶液適量添加成下述實驗用之樣品溶液。. 2-5-5 年年春溶液配製取市售 0.08 公克年年春加入 34 mL 去離子水中形成含有濃度 1000 ppm 嘉磷塞之年年春原液。在每次實驗中將年年春溶液適量添加入 1 mL 青椒液中進行實驗。. 2-5-6 青椒樣品製備將青椒切成 1 cm2，然後將 10 μL 年年春溶液（含有 100 ppm 的嘉磷塞）滴在青椒的表面上，並在水彩筆取樣前放置乾燥。以樣品均質化方法，將 30 g 青椒加入到 60 mL 去離子水中，通過果汁機打碎成青椒液。取 4 mL 上層澄清的青椒液加入到 16 mL 去離子水中以產生青椒溶液。再以 1 M 氫氧化鈉溶液調整青椒液 pH 值為 12，並添加適量年年春溶液進行實驗。. 21.

(35) 2-5-7 黃豆樣品製備取 2 公克黃豆加 20 毫升去離子水後，放入果汁機中絞碎成黃豆液，取出後將黃豆液離心處理後，取上清液作為黃豆基質溶液。以 1 M 氫氧化鈉溶液調整黃豆液 pH 值為 12，並添加適量年年春溶液進行實驗。. 22.

(36) 2-6 中空纖維液相微萃取實驗裝置本研究使用自製的中空纖維液相微萃取槽，如圖 2-1 所示，是由一個 1.5 毫升的離心管和一根長 3.5 公分的中空多孔聚丙烯纖維所組成。在離心管底部鑽一個直徑 1 mm 的圓孔，再將中空多孔聚丙烯纖維插入孔中，以環氧樹脂密封中空纖維與離心管間的縫隙後，完成中空纖維液相微萃取槽的製作。位於離心管內部中空纖維用以進行液相微萃取分析物，突出於離心管外的中空纖維末端則以鑷子夾緊，避免萃取液滲漏。. 圖 2-1 自製中空纖維液相微萃取槽實景圖. 23.

(37) 2-7 中空纖維液相微萃取實驗步驟 2-7-1 中空纖維之前處理將市售多孔聚丙烯中空纖維先以剪刀裁剪成每段 3.5 公分後，置入丙酮溶液中，以超音波震盪清洗 5 分鐘後取出自然風乾保存備用。. 2-7-2 萃取 MDMA 及愷他命使用注射針將十二烷注入中空纖維中，待幾秒鐘後，當浸入纖維壁中的十二烷被吸收後，以注射針將空氣吹入纖維內部而除去多餘未被吸收的十二烷。在此步驟中，存在中空纖維表面孔洞中的十二烷形成微萃取時所使用的液膜。接著將 15 μL 萃取溶劑乙腈 (CH3CN)注入纖維內腔中，並將 1.0 mL 樣品溶液倒入離心管中進行萃取。. 24.

(38) 圖 2-2 中空纖維液相微萃取 MDMA 及愷他命實景圖. 25.

(39) 2-7-3 萃取嘉磷塞將 0.4 mL 正辛醇(octanol)，1 mL aliquat 336 和 8.6 mL 十二烷混合，以超聲波震盪 5 分鐘混合均勻後作為液膜溶液。使用注射針將液膜溶液注入中空纖維，待幾秒鐘後，當液膜溶液浸入纖維壁中被吸收後，以注射針將空氣吹入纖維內部而除去未吸收的液膜溶液。在此步驟中，存在中空纖維表面孔洞中的液膜溶液可隔絕樣品溶液與萃取溶劑。之後，將 15 μL 的萃取溶液 0.1 M 鹽酸溶液注入纖維內腔中，並將 1.0 mL 的嘉磷塞溶液(以 1 M 氫氧化鈉溶液調整 pH 值為 12)注入離心管中以進行萃取。. 圖 2-3 中空纖維液相微萃取嘉磷塞實景圖. 26.

(40) 2-8 纖維電噴灑質譜法如圖 2-4 所示，使用 3.5 公分長的多孔中空纖維，在電噴灑針上施加 4500 伏特電壓，並以甲醇為輔助溶劑進行電噴灑實驗時，在多孔中空纖維的平切端可產生泰勒錐。以往熟知電噴灑時，通常會經由銳利尖端產生泰勒錐，如針頭，移液管尖端或三角形層析紙片尖端，因其表面張力和電場間的作用力可產生泰勒錐，而此實驗則發現了與以往經驗不同的現象。當我們發現多孔中空纖維可作為電噴灑的材料時，許多材料之應用也成為可能，例如玻璃材料，多孔材質或海綿等。在電噴灑游離實驗進行時，必須用輔助液體（甲醇）連續通過中空纖維，因此需要一個甲醇容槽，此容槽是由 3D 列印機印製而成 [73]。它由一個密封帽，固定蓋，溶劑槽（容積為 0.1 毫升）所組成，再將所有這些部件組合後可製成用於樣品揮發及離子化的容槽。以這個方法檢測 MDMA 的偵測極限與使用紙片電噴灑質譜法所獲得的相近。然而，如以本研究的方法進行改善，當線上中空纖維液相微萃取方法被應用時，偵測極限將可大幅改善。. 27.

(41) 圖 2-4 多孔聚丙烯中空纖維電噴灑實驗產生之泰勒錐實景圖甲醇流速：6 µL/min 噴灑電壓：+3 kV. 28.

(42) 2-9 中空纖維液相微萃取技術結合纖維電噴灑質譜法圖 2-5 為本研究開發之線上微萃取纖維電噴灑質譜法示意圖。將微萃取槽置於質譜進樣口和電噴灑針間時，以中空纖維液相微萃取法從稀薄的溶液中萃取分析物，再使萃取所得的分析物以擴散方式移動至纖維的外部，經萃取而濃縮的分析物將隨著萃取溶液經過多孔纖維表面蒸發而逸出。當逸散出來的分析物與電噴灑針尖所產生的帶電粒子相遇時，會使來自中空纖維表面（大部分是中性）的分析物於大氣壓力下游離。如圖 2-6 所示，從電噴灑實驗時觀察到明顯的泰勒錐可知，在大氣壓下游離的分析物將進入質譜儀中而被偵測紀錄。. 29.

(43) 圖 2-5 線上微萃取纖維電噴灑質譜法示意圖. 30.

(44) 圖 2-6 電噴灑實驗產生之泰勒錐實景圖. 31.

(45) 2-10 纖維電噴灑質譜法位置最佳化由於微萃取槽外部的纖維位置對於每次實驗是否能提供足夠的離子來進行檢測有很大的影響。為確定微萃取槽能被放置於最佳量測位置，先將玻璃材質的質譜儀觀察窗以大小相同的壓克力板取代，再將三維平移台設置在此壓克力板上，並在壓克力板上切割一個直徑 1 英吋的孔洞，以便微萃取槽通過並移動。在實驗進行時，將微萃取槽調整於最佳位置以檢測分析物。三維平移台設置如圖 27 所示。. 圖 2-7 三維平移台實景圖. 32.

(46) 下圖為線上微萃取實驗過程之實景照片，纖維的位置可藉由三維平移台來調整。. 圖 2-8 線上微萃取纖維電噴灑質譜法實景圖. 33.

(47) 在電噴灑實驗進行時，由於纖維的位置會影響分析物游離而被質譜偵測的比例，因此纖維的位置相當重要。以咖啡因為樣品溶液時，濃度 10 μg / mL 咖啡因離子強度與纖維位置之間的關係，如圖 2-9 所示，此時電噴灑電壓為+4.5 kV。由此實驗結果顯示，圖中以紅色表示的位置，所測得的訊號最強，此位置距離質譜口垂直 3 公厘和水平 2 公厘之處，此位置將使用於本研究的所有實驗。. 圖 2-9 離子強度與纖維位置關係圖樣品：10 μg /mL caffeine 電噴灑電壓：+4.5 kV 輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 34.

(48) 第三章以中空纖維液相微萃取技術結合纖維電噴灑譜法檢測濫用藥物 3-1 中空纖維液相微萃取濫用藥物藥粉之條件最佳化 3-1-1 液膜溶液對濫用藥物萃取效率的影響在中空纖維液相微萃取實驗時，液膜溶液之選擇相當重要，因為液膜溶液不但要隔絕兩個可互溶的樣品溶液及萃取溶劑，也要能讓分析物能通過才能達到萃取的效果。本研究在樣品溶液為含有 1 ppm 濫用藥物粉末及 20%氯化鈉溶液，萃取溶劑為乙腈的實驗條件下，選擇三種有機溶劑當作液膜進行萃取之比較，結果如表 3-1 所示，僅有以正十二烷為液膜溶液時才能成功萃取到本研究所使用的濫用藥物，故於萃取濫用藥物的實驗中，皆採用正十二烷為液膜溶液。. 表 3-1 液膜溶液對濫用藥物萃取效率的影響液膜溶液名稱. 愷他命. MDMA. 正辛醇 (octanol). 萃取失敗. 萃取失敗. 正十二烷 (dodecane). 萃取成功. 萃取成功. 鄰二甲苯 (o-xylene). 萃取失敗. 萃取失敗. 35.

(49) 3-1-2 萃取溶劑對濫用藥物萃取效率的影響在中空纖維液相微萃取實驗時，萃取溶劑之選擇相當重要，因為分析物必須在萃取溶劑中有足夠大的溶解度，才能讓分析物穿過有機液膜進入纖維內腔，溶解於萃取溶劑中以達到萃取的效果。本研究在樣品溶液為含有 1 ppm 濫用藥物粉末及 20%氯化鈉溶液，以十二烷為液膜的實驗條件下，選擇三種溶劑當作萃取溶劑進行萃取之比較，結果如表 3-2 所示，當乙腈及甲醇為萃取溶劑時可成功萃取到本研究所使用的濫用藥物，但因甲醇的揮發性太高，易於萃取過程中揮發散失而降低了質譜偵測的訊號，故本研究於萃取濫用藥物的實驗中，皆採用乙腈為萃取溶液。. 表 3-2 萃取溶劑對濫用藥物萃取效率的影響萃取溶劑名稱. 愷他命. MDMA. 甲醇 (methanol). 萃取成功. 萃取成功. 乙醇 (ethanol). 萃取失敗. 萃取失敗. 乙腈 (acetonitrile). 萃取成功. 萃取成功. 36.

(50) 3-1-3 樣品溶液 pH 值對萃取濫用藥物效率之影響為了解樣品溶液 pH 值對萃取效率的影響，以 1 ppm 濫用藥物粉末為測試樣品，分別將樣品溶液以 1 M 的氫氧化鈉溶液調整 pH 值為 9 至到 13，在相同萃取時間 70 分鐘及氯化鈉濃度為 20%的實驗條件下，比較濫用藥物離子強度與樣品溶液 pH 值的關係，結果如圖 3-1 所示，當樣品溶液之 pH 值被調整為鹼性時，不論對 MDMA 或愷他命之萃取均可顯著提升。此結果可能因 MDMA 和愷他命的 pKa 值分別為 7.8 和 10.14，當樣品溶液的 pH 值為 11 以上時，能使 MDMA 及愷他命的萃取效率較佳。在萃取濫用藥物藥粉的研究中，樣品溶液的 pH 值均調整為 11。. 37.

(51) 離子強度 (counts). 6.E+06. MDMA ketamine. 4.E+06. 2.E+06. 0.E+00 8. 10. 12. 14. pH. 圖 3-1 濫用藥物離子強度與樣品溶液 pH 值關係圖樣品溶液：1 ppm 濫用藥物粉末 (愷他命及 MDMA) 氯化鈉濃度：20% 液膜：dodecane；萃取溶劑：acetonitrile 電噴灑電壓：+4.5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 38.

(52) 3-1-4 氯化鈉濃度對濫用藥物萃取效率的影響為了探討氯化鈉濃度與萃取效率之間的關係，在相同實驗條件下，使用 1 ppm 濫用藥物粉末溶液為樣品進行萃取，在萃取溶液之 pH 值為 11，萃取時間為 70 分鐘的實驗條件下，改變氯化鈉濃度為 5%、 10%、20%、25%的實驗條件下，記錄萃取後之愷他命及 MDMA 的離子強度。實驗結果如圖 3-3 所示，兩者的離子強度均於添加氯化鈉濃度為 20%時達最大值，氯化鈉濃度大於 20%之後所測得之離子強度則又降低。此實驗結果顯示，在樣品溶液中添加氯化鈉，可藉由鹽析現象來提升萃取效率，但當氯化鈉濃度大於 20%時，可能因為溶液密度增加而降低了分析物的擴散速率，使得萃取效率降低，因此，本研究對於濫用藥物粉末樣品溶液的氯化鈉濃度設定為 20%。. 39.

(53) 6.0E+06. 離子強度 (counts). MDMA ketamine. 4.0E+06. 2.0E+06. 0.0E+00 0. 10. 20. 30. 氯化鈉 (%). 圖 3-2 濫用藥物離子強度與氯化鈉濃度關係圖樣品：1 ppm 濫用藥物藥粉 (愷他命及 MDMA) pH 值：11 液膜：dodecane；萃取溶劑：acetonitrile 電噴灑電壓：+4.5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 40.

(54) 3-1-5 萃取時間對濫用藥物萃取效率之影響為了探討萃取時間與離子強度之間的關係，以 10 個相同的萃取槽，在相同實驗條件下，使用 1 ppm 愷他命溶液為樣進行萃取，在萃取溶液之 pH 值為 11，氯化鈉濃度為 20%的實驗條件下，於 100 分鐘的萃取實驗中，每間隔 10 分鐘的測量一次愷他命的離子強度，實驗結果如圖 3-2 所示，離子強度於 40 分鐘至 70 分鐘快速上升，並於 70 分鐘後達最大值且達飽和，若再延長萃取時間亦不能使離子強度再增加。插圖為 1 μg /mL 愷他命溶液萃取 70 分鐘後所測得之質譜圖，本研究對於濫用藥物藥粉的萃取時間設定為 70 分鐘。. 41.

(55) 圖 3-3. 愷他命離子強度與萃取時間關係圖. 樣品溶液：1 ppm 愷他命氯化鈉濃度：20%； pH 值：11 液膜：dodecane；萃取溶劑：acetonitrile 電噴灑電壓：+4.5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 42.

(56) 3-2 萃取 MDMA 標準品圖 3-4 為 MDMA 標準品萃取前後所測得之質譜圖，於樣品溶液中含有 1 ppm MDMA，樣品溶液之 pH 值為 11，氯化鈉濃度為 20%，萃取時間為 70 分鐘的實驗條件下，所測得之 MDMA 質譜圖。MDMA 的分子量為 193，分子式為 C11H15NO2，在正電模式下，可於 m/z 194 處測得其[M+H]+之質譜峰，m/z 195 則可見碳同位素峰。由實驗結果可知，在萃取前 MDMA 在樣品溶液中的訊雜比為 1.12103，經萃取後可測得之訊雜比為 1.26105，經萃取後之訊雜比則可增加 112.5 倍。. 43.

(57) 圖 3-4 MDMA 標準品萃取前(左)及萃取後(右)之纖維電噴灑質譜圖樣品溶液：1 ppm MDMA 氯化鈉濃度：20%； pH 值：11 液膜：dodecane；萃取溶劑：acetonitrile 電噴灑電壓：+4.5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 44.

(58) 3-3 萃取愷他命標準品在樣品溶液中含有 1 ppm 的愷他命，萃取溶液之 pH 值為 11，氯化鈉濃度為 20%，萃取時間為 70 分鐘的實驗條件下所測得之愷他命標準品萃取前後之質譜圖，如圖 3-5 所示。愷他命的分子量為 237，分子式為 C13H16ClNO，在正電模式下，可於 m/z 238 處測得其[M+H]+之質譜峰，m/z 240 處則可見氯之同位素峰。由實驗結果可知，萃取前愷他命在樣品溶液中的訊雜比為 8.9102，經萃取後可測得之訊雜比為 1.25105，經萃取後之訊雜比可增加 140.4 倍。. 45.

(59) 圖 3-5 愷他命標準品萃取前(左)及萃取後(右)之纖維電噴灑質譜圖樣品：1 ppm 愷他命氯化鈉濃度：20%；pH 值：11 液膜：dodecane；萃取溶劑：acetonitrile 電噴灑電壓：+4.5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 46.

(60) 3-4 濫用藥物粉末成分分析為了解濫用藥物粉末中所含有的濫用藥物成分，本研究使用液相層析質譜法對濫用藥物粉末進行分析，並選擇 Cosmosil 5C18-MS (4.6x 250 mm)管柱來進行逆相層析分析 (reversed phase liquid chromatography)。由於水溶液需選擇適用於質譜儀的緩衝溶液，因此選擇 0.03 M 的醋酸銨水溶液(CH3COONH4,pH=6.8)搭配有機溶劑乙腈作為沖提溶液。當動相 A 為 0.03 M 醋酸銨水溶液，動相 B 為乙腈，流速為 1 mL/min，梯度為動相 A: 動相 B= 50:50 (15 min) 時，可將濫用藥物粉末中的成分有效分離，實驗結果如圖 3-6 所示，插圖為分析物之質譜圖。由其質譜圖可知其中含 MDMA 及愷他命兩種成分。MDMA 及愷他命的層析圖面積比約為 1:1，可知本研究所使用的濫用藥物粉末中所含 MDMA 及愷他命的比例約為 1:1。. 47.

(61) 圖 3-6 濫用藥物粉末之液相層析圖樣品：1 ppm 濫用藥物粉末電噴灑電壓：+3 kV 層析管柱：5C18-MS 沖提溶劑：50% NH4Cl+50% CH3CN 沖提溶劑流速：1 mL/min. 48.

(62) 3-5 在尿液樣品中檢測濫用藥物粉末中的 MDMA 及愷他命圖 3-7 為使用纖維電噴灑質譜法檢測含有濫用藥物粉末(MDMA 及愷他命)的尿液樣品所獲得之質譜圖。圖 A 和圖 B 顯示出微萃取技術使用與否之差異(圖 A，萃取前；圖 B，萃取後)。1 mL 的樣品溶液中除含有濃度為 10 ppm 的濫用藥物粉末外，也在樣品溶液中加入 0.2 g 的氯化鈉，藉由鹽析現象提高萃取效率；同時使用 1 M 氫氧化鈉溶液將樣品溶液的 pH 值調整至 11.0；以乙腈為萃取溶劑來進行萃取。圖 A 以纖維電噴灑質譜法檢測濫用藥物粉末溶液可發現 MDMA（m/z= 194）和愷他命（m/z= 238）的訊雜比分別為 1.8×103 和 6.4×102。圖 B 為中空纖維液相微萃取技術結合纖維電噴灑質譜法所獲得之質譜圖，可發現萃取後 MDMA 和愷他命的訊雜比分別為 3.0×105 和 2.3×105。由此可知，在相同條件下，以線上微萃取技術結合纖維電噴灑質譜法可以將訊雜比提高到約 360 倍，且其偵測極限約為 2 ng/mL（S/N= 3）。. 49.

(63) 圖 3-7 添加濫用藥物尿液樣品之纖維電噴灑質譜圖 (A)萃取前 (B)萃取後樣品：10 ppm 濫用藥物粉末氯化鈉濃度：20%；pH 值：11 液膜：dodecane；萃取溶劑：acetonitrile 電噴灑電壓：+4.5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 50.

(64) 3-6 濫用藥物檢測方法之比較本研究開發之中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法與其他質譜法偵測濫用藥物之比較，如表 3-3 所示。可發現經中空纖維萃取濃縮後再以纖維/電噴灑質譜法偵測濫用藥物，相較於未經萃取之紙片電噴灑質譜法，可讓濫用藥物質譜峰的訊離比提升兩個數量級以上，靈敏度較佳。而本研究開發之中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法檢驗 MDMA 及愷他命的偵測極限可達 2 ppb，且微萃取所使用的樣品體積相較於傳統液液萃取可減少 1/15，是較符合綠色化學的檢測方式。因此，對於濫用藥物的檢測，本研究開發之中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法是最佳的偵測方法。. 51.

(65) 表 3-3 各種質譜法偵測濫用藥物之比較質譜法. 訊雜比. 紙片電噴灑. MDMA. 2.75×103. 偵測極限. 樣品溶液體積. 分析物體積. 分析時間. 0.1 ppm. 15 mL. 3 μL. 數秒. 10 ppb. 15 mL. 70 μL. 30 分鐘. 2 ppb. 1 mL. 15 μL. 70 分鐘. 3. 質譜法. 愷他命. 5.55×10. 中空纖維液液萃取/斜口纖維電噴灑質譜法中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法. MDMA. 4.52×104. 愷他命. 4.3×104. MDMA. 1.26×105. 愷他命. 1.25×105. 52.

(66) 第四章以中空纖維液相微萃取技術結合纖維電噴灑質譜法檢測嘉磷塞 4-1 以電噴灑質譜法檢測嘉磷塞標準品由於嘉磷塞為多質子酸，其解離狀態取決於溶液的 pH 值，本研究在不同的電噴灑電壓及溶液酸鹼值下，比較嘉磷塞的離子化效率。圖 4-1 為不同實驗條件下所測得之嘉磷塞標準品水溶液(10 ppm)質譜圖，圖 4-1(A)之實驗條件為正電模式下，電噴灑電壓設定為+5 kV 時所獲得之質譜圖，可發現在正電模式下，嘉磷塞的離子化效率不佳，其離子訊號位於 m/z=192 是由[M+Na]+所產生；當電噴灑電壓轉換為負電模式(-5 kV)時，其質譜訊號位於 m/z=168 是由 [M-H]-所產生，如圖 4-1(B)所示；若於負電模式下檢測嘉磷塞之酸性溶液(溶於 0.1 M 鹽酸)，可於 m/z=125 處清楚看到嘉磷塞之質譜訊號，如圖 4-1(C)所示，此質譜峰推測是因嘉磷塞分子斷掉磷酸根後與鹽酸分子結合後帶負電所形成，其斷裂途徑及化學結構推測如圖 4-2 所示。. 53.

(67) 圖 4-1 嘉磷塞標準品水溶液之電噴灑質譜圖 (A)正電模式 (B)負電模式 (C)溶於 0.1 M HCl 中之負電模式質譜圖樣品：10 ppm glyphosate 電噴灑電壓：5 kV 溶液流速：20 μL/min. 54.

(68) 圖 4-2 嘉磷塞於鹽酸水溶液中之斷裂途徑. 55.

(69) 4-2 以電噴灑質譜法檢測年年春中的嘉磷塞年年春除含有 41%的嘉磷塞外，也有其他成分，如水及界面活性劑…等。由於在正電模式下，界面活性劑極易被離子化，嘉磷塞卻不易離子化，導致在正電模式下偵測嘉磷塞十分困難。如圖 4-3 (A)所示，10 ppm 年年春溶液在正電模式 (+5 kV)下所測得之電噴灑質譜圖顯示界面活性劑產生了複雜的質譜訊號，導致欲偵測之嘉磷塞質譜訊號被抑制。須將特定質譜範圍 m/z 120-200 放大後，才能看見位於 m/z=192 的微小質譜峰。在此實驗條件下檢測年年春中所含嘉磷塞，其線性範圍僅達 3 個數量級，偵測極限為 4.1 ppm，故於正電模式下無法有效檢測農產品殘留年年春中所含有的嘉磷塞；當電噴灑質譜儀切換至負電模式 (-5 kV)來檢測年年春中所含嘉磷塞，其線性範圍則可達 4 個數量級，其偵測極限為 0.5 ppm。年年春經萃取後溶於 0.1 M 鹽酸中後，則可於 m/z=125 處清楚看到嘉磷塞之質譜訊號，且無界面活性劑的干擾，如圖 4-3 (B)所示。由此結果可知，若要檢測年年春中的嘉磷塞，於負電模式下可避免界面活性劑之干擾，且在酸性溶液中檢測年年春，所獲得之質譜訊號與嘉磷塞標準品相同且靈敏度更高。因此，在本研究中選擇使用負電模式並以位於 m/z=125 的質譜峰來偵測嘉磷塞。. 56.

(70) 圖 4-3 年年春水溶液之電噴灑質譜圖 (A)正電模式 (B)萃取後溶於 0.1 M HCl 中之負電模式質譜圖樣品：10 ppm glyphosate 電噴灑電壓：5 kV 溶液流速：20 μL/min. 57.

(71) 4-3 中空纖維液相微萃取嘉磷塞條件最佳化 4-3-1 液膜溶液對嘉磷塞萃取效率之影響由於以正十二烷為液膜來萃取濫用藥物極易成功，本研究首先使用正十二烷為液膜來萃取嘉磷塞，其他實驗條件為樣品溶液中含有 1 ppm 嘉磷塞，pH 值調整至 12，以 0.1 M 鹽酸為萃取溶劑，萃取 60 分鐘，但其結果是失敗的。原因是嘉磷塞具有胺基酸構造，有兩性離子 (zwitterion)的特性，這使得嘉磷塞極易溶於水溶液，但不溶於有機溶劑中，故無法穿透液膜而被萃取。若於液膜溶液中加入離子溶劑 aliquat 336 則可改善此現象，當嘉磷塞以陰離子形式存在樣品溶液時，透過 aliquat 336 在液膜中與嘉磷塞產生離子交換反應，讓嘉磷塞能穿透有機液膜而進入萃取溶劑中。若於液膜溶液中再加入正辛醇則可達到最佳的萃取效率，則是因為正辛醇增加了 aliquat 336 在 dodecane 中的溶解度，上述實驗結果如表 4-1 所示。因此，本研究選擇使用 4% 正辛醇及 0.2 M aliquat 336 溶解於正十二烷中作為液膜溶液 [70]。aliquat 336 為四級胺鹽，分子式為 C25H54ClN，其結構式如圖 4-4 所示。. 58.

(72) 表 4-1 液膜溶液對嘉磷塞萃取效率的影響液膜溶液名稱. 嘉磷塞. dodecane. 萃取失敗. dodecane+ aliquat 336. 萃取成功萃取成功，效果最佳. dodecane+ aliquat 336 + octanol. 圖 4-4 aliquat 336 的結構式. 59.

(73) 4-3-2 萃取溶劑對嘉磷塞萃取效率之影響本研究比較乙腈和鹽酸作為萃取溶劑時，對萃取嘉磷塞的影響。其他實驗條件設定為樣品溶液中含有 1 ppm 嘉磷塞，pH 值調整至 12，以 4% 正辛醇及 0.2 M aliquat 336 溶解於正十二烷中作為液膜溶液，萃取 60 分鐘，結果如表 4-2 所示，本研究選擇以 0.1 M 鹽酸溶液做為萃取溶劑。. 表 4-2 萃取溶劑對嘉磷塞萃取效率的影響萃取溶劑名稱. 嘉磷塞. 乙腈. 萃取失敗. 0.1 M 鹽酸. 萃取成功. 4-3-3 樣品溶液 pH 值對嘉磷塞萃取效率之影響查閱報導嘉磷塞的相關文獻中發現嘉磷塞的 pka 依序為 0.8，2.2， 5.4 和 10.2 [69]，因此為了讓嘉磷塞完全解離，本研究選擇將樣品溶液的 pH 值以 1 M 的氫氧化鈉溶液調整至 12。. 60.

(74) 4-3-4 萃取時間對嘉磷塞萃取效率之影響為了探討萃取時間與嘉磷塞離子強度之間的關係，以 6 個相同的萃取槽，在相同實驗條件下，使用 1 ppm 嘉磷塞為樣品進行萃取，在萃取溶液之 pH 值為 12 的實驗條件下，於 90 分鐘的萃取實驗中，每間隔 15 分鐘的測量一次嘉磷塞的離子強度，實驗結果如圖 4-1 所示，離子強度於 45 分鐘至 60 分鐘間快速上升，並於 60 分鐘後達最大值，若再延長萃取時間則離子強度反而下降。此現象可能是因為液膜溶液隨時間而降低維持纖維表面濕潤的效果，當時間超過 60 分鐘後，因纖維表面乾燥而導致纖維電噴灑效果不佳，導致質譜偵測到的離子強度下降，故本研究將嘉磷塞的萃取時間設定為 60 分鐘。. 61.

(75) 圖 4-5 嘉磷塞離子強度與萃取時間關係圖樣品溶液：1 ppm glyphosate pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 62.

(76) 4-4 萃取嘉磷塞標準品在負電模式下，於樣品溶液中含有 1 ppm 的嘉磷塞，萃取溶液之 pH 值為 12，萃取時間為 60 分鐘的實驗條件下，比較萃取前後所測得之嘉磷塞質譜圖，實驗結果如圖 4-6 所示。可知萃取前於 m/z 168 處發現微小的嘉磷塞質譜峰 (訊雜比 1.1102)，萃取後則於 m/z 125 處發現明顯的嘉磷塞譜峰(訊雜比 1.43104)，由此可知萃取後嘉磷塞質譜峰的訊雜比可增加 130 倍。. 63.

(77) 圖 4-6 嘉磷塞標準品水溶液之纖維電噴灑質譜圖 (A)萃取前 (B) 萃取後樣品溶液：1 ppm glyphosate pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 64.

(78) 4-5 萃取年年春中所含之嘉磷塞在負電模式下，於年年春樣品溶液中含有 1 ppm 的嘉磷塞，萃取溶液之 pH 值為 12，萃取時間為 60 分鐘的實驗條件下，年年春經中空纖維液相微萃取後，於 m/z 125 處發現明顯的嘉磷塞譜峰，如圖 4-7 所示，此結果與萃取嘉磷塞標準品相同，故此方法可實際應用於檢測真實樣品中所殘留的年年春。. 65.

(79) 圖 4-7 年年春水溶液之纖維電噴灑質譜圖樣品溶液：1 ppm glyphosate pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 66.

(80) 4-6 檢驗青椒表面殘留之嘉磷塞本研究嘗試以水彩筆作為採樣工具，於採樣後結合中空纖維液相微萃取技術及纖維電噴灑質譜法來檢測嘉磷塞。實驗步驟如圖 48 所示，首先以去離子水潤濕的水彩筆在青椒表面來回塗抹十次收集殘留於青椒表面的嘉磷塞(1 μg/cm2)，如步驟一所示；接著將水彩筆放入離心管中，將筆毛上的嘉磷塞洗入離心管內的 0.1 M 氫氧化鈉溶液中以進行萃取，如步驟二所示；在此之前，中空纖維外壁的液膜及內腔中的萃取溶液(0.1 M HCl)已先完成製備。經過 60 分鐘的中空纖維液相微萃取後即可進行質譜檢測，如步驟三所示。. 67.

(81) 圖 4-8 毛筆採樣青椒表面殘留之嘉磷塞以纖維電噴灑質譜法進行檢測之步驟示意圖. 68.

(82) 以水彩筆採樣且結合中空纖維液相微萃取技術及纖維電噴灑質譜法來檢測青椒表面殘留之年年春(1 μg/cm2)，結果如圖 4-9 所示，在藉由毛筆採樣但未經萃取的實驗條件下，僅能於 m/z=168 發現微弱的嘉磷塞質譜訊號；相對的，若在毛筆採樣後再經萃取的實驗條件下，則可於 m/z=125 得到顯著的嘉磷塞質譜訊號，插圖則顯示此方法的偵測極限(s/n>3)可達 1 ng/cm2。. 69.

(83) 圖 4-9 毛筆採樣青椒表面殘留之嘉磷塞以纖維電噴灑質譜法檢測之質譜圖 (A)萃取前 (B) 萃取後樣品溶液：1 μg /cm2 glyphosate pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 70.

(84) 為比較此方法與標準方法之間的差異，本研究亦使用樣品均質化方法檢測青椒液中所含有的嘉磷塞，結果如圖 4-10 所示。圖 410 上圖為青椒溶液以注射幫浦直接注入所測得之電噴灑質譜圖，從此圖譜上可找到維他命 B6 及維他命 C 的質譜峰，但並沒有看到嘉磷塞的質譜峰，表示此青椒樣品本身未受到嘉磷塞的汙染。若於此青椒樣品溶液中添加含有 10 ppb 嘉磷塞的年年春，萃取後之質譜圖如圖 4-10 下圖所示，可發現除嘉磷塞主要之譜峰外，其餘譜峰均消失，表示以此方法檢測嘉磷塞可有效避免基質之干擾。. 71.

(85) 圖 4-10 以纖維電噴灑質譜法檢測青椒基質中殘留嘉磷塞之質譜圖 (A) 青椒溶液萃取前 (B) 青椒溶液添加 10 ppb glyphosate 萃取後 pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 72.

(86) 4-7 檢驗黃豆中殘留之嘉磷塞本研究亦使用黃豆為基質來檢測嘉磷塞，圖 4-11 為黃豆液中添加含有 10 ppm 嘉磷塞的年年春後，於萃取前後所測得之質譜圖。上圖為黃豆溶液以注射幫浦直接注入所測得之電噴灑質譜圖，從此圖譜上可看到一些未知物的質譜峰及一微小的嘉磷塞質譜峰。若於此黃豆樣品溶液中添加含有 10 ppb 嘉磷塞的年年春經萃取後之質譜圖如下圖所示，比較萃取前及萃取後之嘉磷塞質譜峰之訊雜比可提升 1000 倍。在黃豆基質中檢測嘉磷塞之偵測極限為 10 ppb。. 73.

(87) 圖 4-11 以纖維電噴灑質譜法檢測黃豆基質中殘留嘉磷塞之質譜圖 (A)萃取前 10 ppm glyphosate (B)萃取後 10 ppb glyphosate 樣品溶液：黃豆溶液；pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min. 74.

(88) 4-8 改造微萃取裝置縮短萃取時間本研究開發的線上液相微萃取結合纖維電噴灑質譜法雖可成功的提升對分析物偵測的靈敏度，但是其萃取過程極為費時(60~70 分鐘)，為改善此項缺點而重新設計萃取槽並加入攪拌子。新型微萃取槽由 2 mL 血清瓶、多孔聚丙烯中空纖維及樣品瓶蓋構成，中空纖維末端以鑷子夾扁封口，防止萃取液漏出，新舊微萃取槽比較如下圖所示:. (A). (B). 圖 4-12 改良前後之微萃取槽示意圖 (A)改良前 (B)改良後. 75.

(89) 以嘉磷塞為樣品，在相同萃取條件下，比較使用新萃取槽時有無加入攪拌子時偵測嘉磷塞離子強度與萃取時間的關係，結果如圖 4-13 所示，可以發現使用新型微萃取槽，在 600 rpm 的攪拌速率下，萃取時間可藉由攪拌可自 60 分鐘縮短至 15 分鐘。因此，改良後的微萃取槽加入攪拌子後，可讓中空纖維液相微萃取技術結合電噴灑質譜法達到快篩嘉磷塞的目的。. 76.

(90) 圖 4-13 改良前後微萃取槽之檢測嘉磷塞離子強度與萃取時間關係圖 (A)改良前 (B)改良後樣品溶液：1 ppm glyphosate pH 值：12；萃取溶劑：0.1 M HCl 液膜：4% octanol 及 0.2 M aliquat 336 in dodecane 電噴灑電壓：-5 kV；輔助溶液：methanol 輔助溶液流速：45 μL/min 77.

(91) 4-9 嘉磷塞檢測方法之比較本研究開發之水彩筆採樣結合中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法與其他質譜法偵測嘉磷塞之比較，如表 4-3 所示。可發現僅用毛筆電噴灑質譜法的靈敏度最低，但使用水彩筆採樣後結合中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法則可大幅提升偵測嘉磷塞之靈敏度，其偵測極限可達 1 ng/cm2，與樣品均質化結合中空纖維液相微萃取纖維/電噴灑質譜法檢測嘉磷塞可達之偵測極限相同。. 78.

(92) 表 4-3 各種質譜法偵測嘉磷塞之比較質譜法毛筆尖電噴. 訊雜比. 偵測極限. 樣品溶液體積. 分析物體積. 分析時間. 1.47×103. 1 μg/cm2. . . 數秒. 灑質譜法水彩筆採樣結合中空纖 4 維液相微萃 1.43×10 取纖維/電噴灑質譜法樣品均質化結合中空纖 5 維液相微萃 1.26×10 取纖維/電噴灑質譜法. 15 分鐘(新萃取槽) 2. 1 ng/cm. 1 mL. 15 μL 60 分鐘(舊萃取槽) 15 分鐘(新萃取槽). 1 ppb. 1 mL. 15 μL 60 分鐘(舊萃取槽). 79.

(93) 第五章結論本研究開發了線上濃縮技術於質譜法的應用，包含由中空纖維液相微萃取與電噴灑游離源組合而成的纖維電噴灑游離質譜法。使用市售離心管和血清瓶，成功設計和開發了一次性使用的中空纖維液相微萃取槽。應用此方法，可成功應用於檢測尿液樣品中的濫用藥物，透過萃取步驟，不但可降低基質之干擾，亦可讓 MDMA 及愷他命之質譜峰訊雜比提升 360 倍以上；本研究亦成功的在青椒及黃豆樣品中檢測到較法定殘留容許量低的嘉磷塞。此方法除簡單、經濟外，亦相當靈敏且具有選擇性，只要針對分析物不同的化學特性，在萃取條件最佳化後，將可廣泛應用於濫用藥物篩檢(MDMA、愷他命)、農藥檢測（如嘉磷塞），中藥（如小蘗鹼，黃連鹼和巴馬汀）和西藥(如飛敏耐藥錠)檢驗等等，在微萃取槽經過改良後更可達到快篩的目的，其他應用也值得繼續探討。. 80.

(94) 第六章參考文獻 [1] D. N. Correa, J. M. Santos, L. S. Eberlin, M. N. Eberlin, S. F. Teunissen, Forensic Chemistry and Ambient mass spectrometry: A perfect couple destined for a happy marriage? Anal. Chem. 88 (2016) 2515-2526. [2] Z. Tak’ts, J. M. Wiseman, B. Gologan, R. G. Cooks, Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization, Science 306 (2004) 471-473. [3] R. B. Cody, J. A. Larame´e, H. D. Durst, Versatile New Ion Source for the Analysis of Materials in Open Air under Ambient Conditions, Anal. Chem. 77 (2005) 2297-2302. [4] E. T. Jansson, M. T. Dulay, R. N. Zare, Monitoring enzymatic reactions in real time using Venturi easy ambient sonic-spray ionization mass spectrometry, Anal. Chem. 88 (2016) 6195-6198. [5] R. Haddad, R. Sparrapan, T. Kotiaho, M. N. Eberlin, Easy ambient sonic-spray ionization-membrane interface mass spectrometry for direct analysis of solution constituents, Anal. Chem. 80 (2008) 898903. [6] C. Y. Cheng, C. H. Yuan, S. C. Cheng, M. Z. Huang, H. C. Chang, T. L. Cheng, C. S. Yeh, J. Shiea, Electrospray-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry for Continuously Monitoring the States of Ongoing Chemical Reactions in Organic or Aqueous Solution under Ambient Conditions, Anal. Chem. 80 (2008) 7699-7705.. 81.

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