下水污泥堆肥應用於受柴油污染土壤現地處理之研究

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(1)國立交通大學環境工程研究所碩士論文. 下水污泥堆肥應用於受柴油污染土壤現地處理之研究. Applied sewage sludge compost to diesel-contaminated soil in-situ treatment. 研究生：張仕音指導教授：林志高博士. 中華民國九十三年八月.

(2) 下水污泥堆肥應用於受柴油污染土壤現地處理之研究. Applied sewage sludge compost to diesel-contaminated soil in-situ treatment. 研究生：張仕音. Student：Shih-In Chang. 指導教授：林志高博士. Advisor：Dr.Jih-Gaw Lin. 國立交通大學環境工程研究所碩士論文. A Thesis Submitted to Department of Environmental Engineering College of Engineering National Chiao Tung University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Environmental Engineering August, 2004/8/12 Hsinchu, Taiwan, Republic of China. 中華民國九十三年八月.

(3) 誌謝在將近兩年的研究生生涯裡，終於到了該畫下句點的時候，伴隨我在實驗研究的路途上，有許多生活中的點點滴滴及數不完的片段回憶，這一路上有許多學長姐、同學、學弟妹、朋友及家裡成員的陪伴，使得醉心於實驗室的日子雖然辛苦但倒也怡然自得。該感謝的人很多，首先要感謝指導教授林志高博士，不管在實驗的架構、分析方法或是論文的撰寫上，都給予很大的幫助，其悉心的指導以及在茲念茲的諄諄教誨、耳提面命，讓我銘感五內，在此獻上萬分的謝意；感謝陳勝一學長在實驗上的諸多建議以及在論文撰寫方面的修訂，使得本論文研究方向和整體架構上更加明確，另外，在口試期間，承蒙賴俊吉老師、陳重元老師及何公亮博士三位口試委員的指正和給予許多寶貴意見，使得本論文能更加充實且詳細完整。在研究室方面，首先感謝大家平時接受我冷笑話的荼毒，讓夏天的研究室充滿涼意，冬天的研究室徹底結冰，謝謝實況野球專家的宏旭學長、成熟穩重充滿男人味，但是講笑話比我還冷的志誠學長、嫵媚動人的秀鳳學姐、身材高大超用功的宏邦學長、喜歡插一隻皮夾在屁股上的人傑學長還有講話很老實的揚根、談吐溫雅的榮杰、擅長多功能虛擬實境模擬動畫的高手憲昌加上本所最漂亮的佳紘學妹、身材瘦小又愛軋車的理安學弟、很帥氣但不愛穿襪子的少奇學弟，有了你們在研究上的相互砥礪、縱使實驗履敗也能履戰，在多次挑燈夜戰的夜晚亦不覺得孤單。最後要感謝我的家人在我就學期間，沒有因為很少回家而碎碎念，以及吾姊惠盆在英文部分文法的指正、吾弟仲瑋在電腦軟體資源上的免費提供、強迫我聽故事又愛搶電視看的瓊蓁，使得我在研究生涯中有了無比的助力與動力，另外，還有因提筆匆促而未能提及的好友們，在此，一併向你們致上十二萬分的謝意。.

(4) 結束了在新竹的求學生涯，無限的感激將長駐我心，緊接著即將踏入職場，追求另一個人生目標，此刻將以更認真的態度追尋更精采的人生，再會了，風城。. 張仕音謹誌於交通大學環工所.

(5) 下水污泥堆肥應用於受柴油污染土壤現地處理之研究. 學生：張仕音. 指導教授：林志高博士. 國立交通大學環境工程研究所. 摘要. 近幾年，石化產品之汽油、柴油及其他化學成品等高污染性的有機化合物在眝存和運輸方面十分頻繁而造成環境污染之事件層出不窮對於生態環境所造成的影響甚鉅。本研究所採用之生物復育技術是相當經濟且有效的油污染處理技術。利用污水廠之污泥予以堆肥後做為受柴油污染土壤的營養鹽和改良劑，模擬受柴油污染土壤現地復育之方式利用中央合成設計 (CCD) 與反應曲面法 (RSM) 作為實驗統計分析之工具，以摻合比 (濕重) 與水分含量作為實驗因子，再加上以溫度為正交區集設計，經由 MINITAB 統計軟體產生一反應曲面並探討獨立變數與反應變數之間的數學模式關係，探討其迴歸係數及變異數分析等相關數據並進行控制組之實驗分析。由反應曲面結果可以知道生物降解最佳含水率範圍約在最大含水量之 20％-65％間，且可知摻合比分別在最高 (土壤和堆肥在濕基下，1:1 之重量摻合比例) 和最低 (土壤和堆肥在濕基下，1:0.1 之重量摻合比例) 摻合比中有最顯著之效果。而上述摻合比中可發現，在降解初期約 10 至 15 天中，產生較快的降解，降解率約 50 至 55％，在最後 20 至 30 天，則有較緩慢之降解，降解率約 10 至 13％。由迴歸係數分析，可知含水率和摻合比無相互作用 (intereaction) 關係，但是溫度對生物之降解影響 I.

(6) 相當顯著，亦即在冬天進行現地復育時，降解效率會較差。從滅菌組實驗中可發現只有 11％之降解效果，故可知本研究之降解過程，主要係生物降解所產生。由配適一階反應模式得知具有相當高之相關係數，故可知本研究之降解過程，可由一階反應模式表示，最適當之摻合比係為 1：0.1 (濕重)，且其動力常數 K 值大於未添加堆肥於土壤中之兩倍。. 關鍵詞: 柴油、堆肥、中央合成設計法、一階反應動力模式. II.

(7) Applied sewage sludge compost to diesel-contaminated soil in-situ treatment Student：Shih-In Chang. Advisor：Dr. Jih-Gaw Lin. Institute of Environmental Engineering National Chiao Tung University Abstract In recent years ,leakage of various petroleum hydrocarbons from underground storage tanks primarily at automobile service stations and from pipelines has been experienced at an alarming rate. It would became a environmental pollution accident. Bioremediation with compost is the most cost-effective clean-up technology for the treatment of diesel-contaminated soil. Central composite design (CCD) and response surface method (RSM) of bioremediation experiments were used to construct second order response surfaces for the total petroleum hydrocarbons (TPH) degradation rate to investigate the effects of compost amendment. Fourteen fixed volume batch reactors were designed by central composite design (CCD). The CCD was applied with two design factors (mix ratio and water content) and a block orthogonally (temperature). The experiment data for the central composite design (CCD) was generated by MINITAB. Total cell counts in soil samples were stained by the dye, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). The results showed that TPH of contaminated soil decreased in all treatments during bioremediation process. Addition of compost to contaminated soil showed a more rapid TPH reduction that occurred in the early stage (within about 10-15 days), i.e. 50-55％ of TPH can be degraded. The 10-13％ TPH reduction was obtained in the final stage (within about 20-30 days) with a slower degradation rate. By Estimated Regression Coefficients for TPH, the interaction of mix ratio and water content was insignificant (P=0.868). The biological reaction in III.

(8) bioremediation process of the diesel contaminated soil was the major reaction, since the biocide (control experiment) was only 11％ TPH reduction. The data of the bioremediation process were well described by a first order model. The degradation rate constant of TPH in the appropriate mix ratio was two times greater than that of contaminated soil only.The appropriate mix ratio (wet weight basis) of contaminated soil and compost was 1 to 0.1. Keywords ： Diesel; compost; central composite design; first order reaction. IV.

(9) 目錄. 摘要 ..........................................................................................................I 英文摘要 .................................................................................................III 目錄 ........................................................................................................ V 圖目錄.................................................................................................. VIII 表目錄..................................................................................................... X 第一章前言...........................................................................................1 1-1 研究緣起 ........................................................................................1 1-2 動機及目的 ....................................................................................2 第二章文獻回顧....................................................................................4 2-1 石油碳氫化合物之組成 ..................................................................4 2-2 柴油之基本性質 .............................................................................4 2-3 柴油在環境中之宿命 ......................................................................7 2-3-1 有機污染物在土壤及地下水中的傳輸....................................10 2-4 柴油污染對環境之危害 ................................................................10 2-5 柴油污染和無機物污染對生物之影響........................................... 11 2-5-1 柴油污染對土壤微生物之影響............................................... 11 2-5-2 無機物污染對生物之影響......................................................12 2-6 柴油對人類健康之影響 ................................................................14 2-7 影響土壤微生物活性因子.............................................................14 2-8 污染場址之復育技術 ....................................................................20 2-8-1 現地處理 (In-situ treatment).................................................22 2-8-2 離地處理 (ex-situ treatment) ................................................23 2-9 實驗設計方法介紹........................................................................24 2-9-1 中央合成設計 ........................................................................24 2-9-2 反應曲面法和區集劃分 .........................................................25 第三章實驗設備及實驗方法................................................................27 3-1 研究流程 ......................................................................................27 3-2 實驗方法 ......................................................................................31 3-2-1 土壤和堆肥之基本性質分析 ..................................................31 3-2-2 土壤 pH 值...........................................................................31 3-2-3 土壤電導度測定 ....................................................................32 3-2-4 含水率...................................................................................32 V.

(10) 3-2-5 田間容水量............................................................................33 3-2-6 有機碳含量............................................................................33 3-2-7 土壤質地分析 ........................................................................34 3-2-8 陽離子交換容量 ....................................................................36 3-2-9 重金屬分析............................................................................36 3-3 受柴油污染土壤採樣及萃取方法 ..................................................38 3-4 實驗中總石油碳氫化合物之 (TPHD) 分析....................................39 3-4-1 設備及材料............................................................................39 3-4-2 分析步驟 ...............................................................................39 3-4-3 氣相層析分析 ........................................................................40 3-4-4 柴油成份分析 ........................................................................40 3-5 品質保證與品質管制 (QA/QC) ....................................................42 3-5-1 建立起始檢量線 ....................................................................42 3-5-2 檢量線的線性和確認 .............................................................42 3-5-3 柴油類有機物 (Diesel range organics，DRO) 之外標準品校正 ........................................................................................................43 3-5-4 方法偵測極限 (Method Detection Limit, MDL) .....................44 3-5-5 空白樣品分析 (Blank)...........................................................44 3-5-6 重覆樣品分析 (Duplicate).....................................................44 3-5-7 添加樣品分析 (Spike sample analysis) ................................44 3-6 生物菌數測定...............................................................................45 3-6-1 分析方法 ...............................................................................45 3-6-2 觀察 (Visualization) ..............................................................45 3-7 實驗設備 ......................................................................................47 3-7-1 反應槽...................................................................................47 3-7 實驗設備及藥品 ...........................................................................48 3-8 堆肥實驗 ......................................................................................49 3-9 實驗設計與分析 ...........................................................................52 3-10 單一因子之實驗規劃 ..................................................................57 3-10-1 TPHD 降解之動力模式探討 .................................................59 第四章結果與討論 ..............................................................................60 4-1 基本性質分析之結果 ....................................................................60 4-2 反應級數之探討 ...........................................................................62 4-3 實驗設計結果...............................................................................62 4-3-1 統計分析 ...............................................................................63 4-3-2 配適二階模型之設計 .............................................................63 4-3-3 模型適當性與常態性假設檢驗...............................................72 4-4 單一因子實驗規劃結果 ................................................................76 VI.

(11) 4-5 生物菌數結果...............................................................................86 4-6 生物降解過程中之 EC、PH 之變化.............................................89 4-7 品質保證與品質管制 (QA/QC) ....................................................92 4-7-1 檢量線配製............................................................................92 4-7-2 方法偵測極限 (Method detection limit).................................92 4-7-3 空白分析 (Blank) ..................................................................92 4-7-5 重覆分析 (Duplicate )...........................................................93 4-7-6 添加樣品分析 (spike sample analysis).................................93 第五章結論與建議 ..............................................................................97 5-1 結論 .............................................................................................97 5-2 建議 .............................................................................................99 第六章參考文獻.................................................................................100. VII.

(12) 圖目錄圖 2-3-1、有機污染物之宿命 ...................................................................9 圖 2-8-1、現地生物處理與其他處理方式費用之比較 ...........................21 圖 3-1-1、柴油溶液揮發觀察圖 .............................................................29 圖 3-1-2、實驗流程................................................................................30 圖 3-2-1、正三角形土壤質地分類圖 ......................................................35 圖 3-3-1、網格狀之系統採樣方式..........................................................38 圖 3-4-1、烷類標準品 (ASTM D5307) 之層析圖譜 ..............................41 圖 3-7-1、柴油降解實驗之反應槽剖面圖 ..............................................47 圖 3-8-1、堆肥反應槽 ............................................................................50 圖 3-8-2、堆肥實驗流程圖.....................................................................51 圖 3-9-1、反應曲面法流程圖 .................................................................54 圖 3-9-2、二因子中央合成設計之組成圖解：左上為因子部份區集、右上為軸部份區集`.........................................................................56 圖 4-3-1、TPHD 在區集 31℃ 下不同摻合比降解率之變化 (A) 在不同摻合比下和含水率下之變化 (B) 在土壤與水分含量為 1:0.55 和 67﹪ 時之三重覆分析.............................................................68 圖 4-3-2、TPHD 在區集 15℃ 下不同摻合比降解率之變化 (A) 在不同摻合比下和含水率下之變化 (B) 在土壤與水分含量為 1:0.55 和 67﹪ 時之三重覆分析.............................................................69 圖 4-3-3、TPHD 之殘差與常態分佈 .......................................................73 圖 4-3-4、殘差與配適值的圖 .................................................................74 圖 4-3-5、TPHD 之反應曲面法結果 (A) 反應曲面圖 (B) 等高線圖 ......75 圖 4-4-1、TPHD 濃度隨時間降解之過程 (A)各摻合比之實驗組 (B)控制組 ................................................................................................81 圖 4-4-2、實驗組 (1:0.1) 之 TPHD 降解層析圖譜 (A)起始濃度 (B)最終濃度 ............................................................................................82 圖 4-4-3、堆肥組之 TPHD 降解層析圖譜 (A) 起始濃度 (B) 最終濃度.83 圖 4-4-4、土壤組之 TPHD 降解層析圖譜 (A) 起始濃度 (B) 最終濃度.84 圖 4-4-5、滅菌組之 TPHD 降解層析圖譜 (A) 起始濃度 (B) 最終濃度.85 圖 4-5-1、利用 DAPI 染色配合螢光顯微鏡所觀察到之微生物總菌數圖 ................................................................................................87 圖 4-5-2、TPHD 降解過程之總菌數分佈圖 (A)不同摻合比下之實驗 (B) 單獨土壤、單獨堆肥和滅菌實驗 .............................................88 圖 4-6-1、實驗過程中之 pH 值監測 (A) 不同摻合比下之實驗 (B) 單獨土壤、單獨堆肥和滅菌實驗 ....................................................90 圖 4-6-2、實驗過程中之 EC 值監測 (A) 不同摻合比下之實驗 (B) 單獨 VIII.

(13) 土壤、單獨堆肥和滅菌實驗 ....................................................91 圖 4-7-1、柴油標準品之檢量線圖..........................................................94. IX.

(14) 表目錄表 2-7-1、生物復育之影響因子 ............................................................18 表 2-8-1、石油碳氫化合物於土壤與堆肥混合 21 天之質量平衡 ..........23 表 3-4-1、柴油烷類標準品 (n-alkanes) 各成分之組成 .........................41 表 3-7-1、實驗使用之儀器設備及藥品...................................................48 表 3-9-1、中央合成設計水準與編碼 ......................................................55 表 3-10-1、單一因子之實驗規劃 ...........................................................58 表 4-1-1、土壤與堆肥之基本性質分析...................................................61 表 4-3-1、堆肥添加實驗之 TPHD 在 30 天之降解和預測一階動力模式之各項參數 (31℃ 下之因子部分區集).......................................65 表 4-3-2、堆肥添加實驗之 TPHD 在 30 天之降解和預測一階動力模式之各項參數 (15℃ 下之軸部分區集) ..........................................66 表 4-3-3、可旋轉之正交區集中央合成設計 ...........................................67 表 4-3-4、迴歸係數預測 TPHD 降解率之結果 .......................................70 表 4-3-5、TPHD 之變異數分析...............................................................70 表 4-3-6、預測 TPHD 之迴歸係數 ........................................................71 表 4-4-1、土壤受柴油污染降解過程之 TPHD (mg/kg) 實驗組 ..............79 表 4-4-2、土壤受柴油污染降解過程之 TPHD (mg/kg) 控制組 ..............80 表 4-7-1、重金屬分析與陽離子交換實驗之線性相關係數......................94 表 4-7-2、方法偵測極限 (A) TPHD 實驗 (B) 重金屬與陽離子交換實驗 95 表 4-7-3、空白分析、添加回收率與再現性 (A) TPHD 實驗 (B) 金屬與陽離子交換實驗之空白分析、添加回收率與再現性....................96. X.

(15) 第一章前言. 1-1 研究緣起. 隨著工商業的發展，石化燃料已成為當今各國之必需能源，而且其需求量也逐年提高，也使得石化產品之汽油、柴油及其他化學成品等高污染性的有機化合物在眝存和運輸方面變得十分頻繁，因此造成環境污染之機率亦相對提高。. 中國石油股份有限公司 (以下簡稱中油公司) 之新中管線於民國八十四年十月間測試通油時，在台一號省道之後龍溪橋路段發生管線油品漏油事件，該漏油事件中約洩漏高級柴油 220 公秉。然而，洩漏之高級柴油流入後龍溪水後流達至出海口處。由於氣候及潮汐作用之影響，使部份柴油回流至後龍溪與西湖溪之感潮河段中，全程約 7-8 公里，對於生態環境所造成的影響甚鉅。事件發生後，中油公司除採取緊急應變措施，清除浮油、清理洩漏源處之污染土壤，並立即委託台灣油礦探勘總處進行漏油處地下水文調查、設置監測井及油污抽除等初步調查與整治工作。. 而在事件發生三年後，中油公司和其相關單位對於沿岸河床所吸咐之油污並未有具體之處理措施，故在經過三年之自然衰減後，發現受污染程度最高的區堿，乃為西湖溪南岸支流採樣區和西湖溪西濱公路上支流墓地旁採樣區，其中最高達 2406 ppm，其餘更有不少地方超過 1000 ppm。以現今土壤污染管制法之總石油碳氫化合物 (Total petroleum hydrocarbons 以下均簡稱 TPHD) 濃度為 1000 ppm。. 在民國 92 年之後龍溪污染土壤計畫期間，經由民眾反映，於後龍溪 1.

(16) 及西湖溪之河床底質仍可見殘存之油污染，再由該年度計畫進行採樣、評估調查後確認得知主要污染區塊中柴油總石油碳氫化合物濃度經自然衰減作用，已低於 100 ppm，可知污染已獲得相當顯著之改善 (童翔新等， 1999)。. 1-2 動機及目的. 土壤污染是繼水污染、廢棄物污染及空氣污染問題後，必須再面臨的環保問題，但其污染防治工作卻是其中最為困難的。近年來，油污染事件頻傳，且由於土壤受油品污染的面積及體積通常都相當地大，復育工作通常困難重重。而若要改善受到油品污染的土壤，通常需依賴微生物的分解作用來移除，因此目前有許多增加微生物活性的方法，都可以有效地縮短土壤復育所需要的時間。例如利用大量地施予有機物刺激生物生長、控制較佳的含水率來提供微生物適合生長的條件、並以物理方式鬆土以增加空氣的供應量，或者是利用氮、磷等營養素加速微生物之生長及分解污染物之速率 (Alexander, 1994)。. 以廢水處理廠而言，在妥善處理率提高後，其場區污泥產生量大幅增加，加上廢棄物清理法重新修訂，污泥已從單純清運而必須進行妥善處理與處置。在此前提下，污泥處理與處置費用日益加重的情形下，常會造成處理業者極大的負擔，污泥減量於近年來才再次受到業界重視，而目前各產、官、學界針對如何藉由廠內污泥減量，才能夠有效降低廢水處理場操作成本和避免二次污染等問題，均有相當廣泛地研究成果發表。. 近年來許多研究針對特定的有機污染物，利用堆肥化過程加以降解，而達到了相當好的復育效果，例如可將污染的土壤與堆肥混合進行生物復 2.

(17) 育，Namkoong et al., (2002) 利用堆肥反應槽以堆肥摻合受柴油污染的土壤，結果發現於 30 天後可有效降解 98.4％，這主要是因為堆肥富含多樣化之微生物相及多量之有機質。. 本次研究乃進行模擬受柴油污染土壤現地復育之方式並利用污水廠之污泥予以堆肥後做為受柴油污染土壤的營養鹽和改良劑，再依中央合成設計 (CCD) 與反應曲面法 (RSM) 作為實驗統計分析之工具，以摻合比 (濕重) 與水分含量作為實驗因子，再加上以溫度為正交區集設計，經由 MINITAB 統計軟體產生一反應曲面並探討獨立變數與反應變數之間的數學模式關係，探討其迴歸係數及變異數分析等相關數據並進行控制組之實驗分析。利用污泥堆肥之原因，乃是堆肥會產生穩定化，類似腐植土之產品，可以用來改良土壤，而且其粘性也會降低，在施用上不會造成困擾，加上堆肥裡面之有機質不但可以有效地改善土壤的物理性質，降低土壤的塑性及凝結性與增加土壤的保水能力，且能維持土壤的良好結構、增加陽離子交換能力並降低微量元素的流失，然而經消化後的穩定污泥還可以安全的放置在土地表面，而不會有臭味及病虫害傳播的顧慮 (Cecil, et al., 2001)。. 3.

(18) 第二章文獻回顧. 2-1 石油碳氫化合物之組成. 石油碳氫化合物 (Petroleum hydrocarbons) 含有相當複雜之混合成分，一般而言，可分為四個部份：飽和烴 (saturates)、芳香烴 (aromatics)、樹脂 (N, S, O) 和瀝青質 (asphaltene)。. 在飽和烴部分 (saturates fraction)，分為直鏈烷類 (normal alkanes)，支鏈烷類 (isoalkanes) 和環烷類 (naphthenes)。在芳香烴部分則是分為揮發性單一芳香族如苯 (benzene)、甲苯 (toluene)、二甲苯 (xylenes) 等，多環芳香族碳氫化合物 (polyaromatic hydrocarbons)、 (naphthenoaromatics)、芳香族硫化物如 thiophenes 和 dibenzothiophenes。在樹脂 (N, S, O) 和瀝青質 (asphaltene) 部分包含了極性分子如氮、硫和氧。其中，樹脂乃為可真實溶解於油中之無定形固體，而瀝青質 (asphaltene) 則為延散在油中之大分子膠體。綜合上述，這四部份在不同油類中之相對比例分配往往需依賴許多因子，如其來源、地質歷史、年代、移動和原油的改變等 (Balba et al., 1998；Shell International Ltd, 1983)。. 2-2 柴油之基本性質. 柴油乃為由原油中蒸餾出來的重質碳氫化合物，其組成大約含 30％的直鏈烷類 (n-alkanes)、45％的烷類異構物和環烷類 (iso- and cycloalkanes)，以及 24％芳香族碳氫化合物 (aromatic)，另外還有極少量的異戊二化合物 (isoprenoids)、硫化物、氮化物及氧化物等，本研究所 4.

(19) 使用之柴油係購至中油公司之標準柴油，其性質如表 2-2-1 (Zytner, et al., 2001；Lee, et al.,1992)。. 柴油有機物 (diesel range organics，DRO) 在經過 GC-FID 分析圖譜和烷類標準品分析相互比較後，可發現其相當於烷類從 C10 到 C23 的範圍，其涵蓋的化合物沸點，約在 170℃ 到 275℃ 間，如圖 2-2-1 所示。. 5.

(20) 圖 2-2-1 、柴油 (中油) 標準溶液層析圖譜. 表 2-2-1、中國柴油標準性質 (中國石油公司出品；黃靖雄，1996) 性質. 試驗法. 普通柴油. 高級柴油. 揮發性. 蒸餾試驗法 90﹪時 (℉). 675 以下. 550 以下. 閃火點. (℉). 125 以上. 115 以上. 著火性. 十六烷值法 (CN 法). 40 以上. 47 以上. 粘度. 賽氏秒法 (SUS 於 100℉). 45 以下. 38 以下. 流動點. 華氏度法 (℉). 30 以下. 15 以下. 含硫量. 重量百分數法 (﹪重量). 1.25 以下. 0.5 以下. 殘碳量. 10﹪殘碳量法 (﹪重量). 0.35 以下. 0.15 以下. 殘灰量. 重量百分數法 (﹪重量). 0.02 以下. 0.01 以下. 水及沈澱物體積百分數法 (﹪體積). 0.1 以下. 微量. 腐蝕性. NO.1 以下. NO.1 以下. 銅試片法. 6.

(21) 2-3 柴油在環境中之宿命. 柴油在環境中之移動、命運及分布途徑，常根據溶解度、蒸氣壓、化合物在系統中作用過程及化合物之安定性等，分別有光分解、揮發、逕流損失、土壤吸附、淋洗、生物分解及化學分解等，如圖 2-3-1 所示。. (1) 光分解. 當柴油受到陽光照射時，由於其強大之紫外線光會將柴油支鏈、或是環烷類化合物之化學結構破壞，但是由於土壤的透光率很低，一般該反應只發生在土壤表面上，作用較小，且只能處理未被混入土中之污染物質及在乾旱時，因毛細現象溶出至地表之污染物質。. (2) 揮發作用. 柴油乃屬於半揮發性有機物，其進入土壤後有一部分會被吸附，而另一部分會游離而不被吸附，兩者間會呈平衡狀態，平衡後被吸附與游離二者之比例，即取決於柴油在土壤表面上之吸附作用常數。其未被土壤吸附之柴油因平衡破壞，重新平衡而再游離出部分揮發性有機物，如此一來，土壤中揮發性部分之柴油可逐漸揮發至大氣中。而柴油之揮發作用大小，常取決於其蒸氣壓、環境的溫度，及視土壤性質和水分含量等狀況而定，而空氣吹過土壤表面時，亦會加速揮發作用。. (3) 逕流損失. 由於柴油不易溶於水，故其在水相中的遷移主要係吸附在土壤顆粒物 7.

(22) 上，再經由逕流或侵蝕所產生的機械遷移，而造成柴油之損失，由於污染過後之柴油，大多數係沈積在土壤表層內，故一般不易造成地下水污染，但容易因沖刷作用而造水域的嚴重污染。. (4) 土壤之吸附作用. 柴油在土壤中之吸附行為有離子交換、配位基交換、凡得瓦力作用、疏水性結合及氫鍵結合等作用機制。這些作用係取決於柴油和土壤顆粒物之化學結構與本身之性質，上述五種之作用方式在土壤表面的吸附上均可單獨或是結合進行。. (5) 生物分解作用. 柴油在微生物代謝過程中，柴油污染物質可以被當作碳源和能源進行代謝作用，經由微生物體內之酵素，可分解污染物質之主要反應包括： β-oxidation 作用、開環作用、還原作用及水解作用等。亦即可以經由上述作用而產生變質 (Transformation)。此種變質乃指柴油之環烷類或是芳香族碳氫化合物等其化學分子形式由原來之污染物質轉變成另一種化合物或進一步經由礦化作用而消失。有機污染物在經過微生物逐漸分解後，生成二氧化碳、水及一些簡單的無機化合物，生物分解污染物質之速度取決於其生物活性。. (6) 化學分解作用. 柴油在土壤中之化學分解作用主要有水解、氧化、異構化、離子化等作用，其中以水解及氧化作用最重要，這些分解作用，係將有機污染物質 8.

(23) 經過一步或多步的化學變化反應，將複雜的化學結構逐步變為簡單的無機化合物，而有些污染物質可能因為和土壤接觸才會加速分解，沒有土壤反而不易分解，該作用即非屬於微生物分解作用。. 圖 2-3-1、有機污染物之宿命 (王一雄等，1995). 9.

(24) 2-3-1 有機污染物在土壤及地下水中的傳輸. 有機污染物在土壤中之傳輸移動，不像在水中或空氣中，可以四面八方任意擴散，而乃是由擴散作用 (Diffusion) 與整體移動二種過程，而污染物在土壤中移動之總量為擴散作用與整體移動二種過程之總和。有機污染物之擴散作用會受到土壤中之固體物質如無機礦物與有機質之阻礙，因此有機污染物在土壤中之擴散分散，受到土壤系統中之複雜性之影響很大。而主要影響有機污染物之因子有土壤水分含量、土壤吸附作用、土體密度及土壤溫度等。有機污染物在土壤剖面上之移動，包括由於土壤的機械耕種與細微粒子被水分運送，另有由土壤表面沖刷造成之地面逕流而運送，水分流動所生成之有機污染物，在土壤剖面中之整體運送狀況，主要乃決定於水流之方向和速率，和有機污染被土壤吸附的特性 (王一雄等， 1997) 。. 2-4 柴油污染對環境之危害. 柴油對環境之危害常因儲油槽遭受腐蝕而破裂產生漏油、油管破裂、廢油品任意傾倒或意外洩漏等情事而造成洩漏進入土壤或地下水中影響環境，加上外在環境物化特性的改變而使污染物經由脫附、揮發、擴散等作用，使土壤傳輸至地表空氣中，由此可知柴油對環境之污染範圍相當廣泛 (Alexander, 1994)，而在柴油進入土壤後，各種不同之生物都有可能會受到影響，例如土壤微生物、動物、植物等，甚至人類會因食用受污染之動植物而可能遭受到更大之危害。. 10.

(25) 2-5 柴油污染和無機物污染對生物之影響. 生物在生長時會因為忍受力之不同而對污染物有不同之忍耐力，有些生物由於忍耐力較弱，亦即對污染物較敏感，就容易受到傷害，而有的生物具有抗污染物之能力，通常較不容易受到危害，而一旦污染濃度增加至超過生物之忍受程度時，將易導致生物死亡。在本研究中，土壤污染物除了有機污染物柴油外，還有土壤和堆肥本身之無機污染物如重金屬、無機氮、無機磷和鹽分污染等，不管是有機污染物或是無機污染物都會對生物造成影響，故針對有機污染物與無機污染物方面之影響將於結果中討論。. 2-5-1 柴油污染對土壤微生物之影響. 土壤微生物在過多之柴油濃度存在下，將會對土壤微生物的形態、數目和活性等造成相當的影響，而影響的程度和狀況，將取決於柴油之濃度、污染方式及土壤性質與氣候因子，被柴油污染影響土壤微生物之情況有：. (1) 不影響或輕微的影響. 即較低柴油濃度在土壤中，對土壤微生物可能不會造成影響或僅有些微之影響。. (2) 直接的影響或間接的影響. 柴油對土壤微生物所產生之直接影響係因土壤性質之影響或誘發原本無活性的潛伏微生物活性，而間接影響係以間接方式影響其他土壤微生 11.

(26) 物活性而造成之影響。. (3) 刺激性的影響或抑制性的影響. 柴油因富含有多種碳氫化合物，故可當作土壤微生物之碳源，而促進微生物之活性，但也可能對土壤微生物造成毒害而抑制其生長。. (4) 非專一性的影響. 柴油主要乃是由碳氫化合物所組成，故能分解碳氫化合物之微生物種類相當地多，因此可以發現本研究所針對多數甚至全部種類之微生物都會有影響 (Del and Franca, 2001)。. (5) 暫時性的影響或持續性的影響. 此一現象將視土壤受柴油污染濃度多寡而定，亦即當柴油污染濃度過量時有可能永久的殺死土壤微生物，而足量之柴油濃度可能暫時的抑制土壤微生物活性。. 2-5-2 無機物污染對生物之影響. 由於河川乃因經常或間歇被河水淹沒，故常衍生豐富之濕地生態資源，其中有許多生長在濕地之植物，常會因為污染情事的發生加上保持維護不易，而導致生長受到威脅。. 在土壤中的無機物主要可分為植物生長之必要元素 (Essential 12.

(27) elements) 和非為植物生長之必要元素 (Non-essential)，而植物若從土壤中獲取過量或是不必要之元素，都會對其產生毒害。無機污染物在土壤中會因為錯合、吸附、沈澱、氧化還原作用加上土壤 pH、有機質含量、陽離子交換能力等作用，而使得植物也由這些途徑受到了影響 (王一雄等， 2001)。一般無機物影響方面主要有重金屬、無機氮、無機磷和鹽分污染等。而針對這些無機物污染部分，對於植物生長之影響分別敘述如下：. (1) 重金屬和微量元素之影響. 在重金屬方面，由於各種重金屬對各種植物之毒害程度不同，故使得植物因忍耐度之差異而有不同之毒害症狀，較易分解之重金屬乃稱為生物有效性重金屬 (bioavailability of heavy metal)，其可藉由添加磷肥、腐植質、有機質及提高 pH 值等，在土壤中將其分解，而重金屬對微生物的毒害性由大至小可以排列成 Cr(Ⅵ)＞Cu＞Cd＞Ni＞Pb＞Zn (Volker et al., 2002)。. (2) 無機氮和無機磷之影響. 在無機氮、無機磷方面，可以知道氮是植物生長所需消耗之大量元素，但是一旦吸收過多會造成營養過剩甚至其它不良影響，而無機磷乃為植物生長之必要元素，常為植物之率限制因子，且磷常以磷酸鹽之形式進入土壤中，也因此而容易與鈣、鎂、鐵等形成難溶性化合物而導致上述營養元素之缺乏。. (3) 鹽分污染之影響 13.

(28) 在鹽分污染方面，土壤中若鹽分過高，將易導致產生過高之滲透壓 (High osmotic pressure)，阻止植物吸收水分，進而妨礙其生長甚至造成枯萎。故一般在鹽分污染方面，係以土壤飽和抽出液之電導度 (Electrical conductivity，EC) 表示，亦即定義為大於 4 mmho/cm (或 ds/cm) 稱之為鹽土。. 2-6 柴油對人類健康之影響. 柴油中的苯及芳香烴是致癌性物質，硫會導致車輛的觸媒轉化器中毒及排放的有害粒狀物質。因此將柴油低硫化、低芳香烴化乃是未來的環保趨勢。另外，油品中的脂肪族碳氫化合物亦會對人體造成危害，其進入人體之主要路徑為肺及皮膚等，主要會造成頭痛、反胃、過敏及神經系統受損等病狀，加上脂肪族碳氫化合物為良好的溶劑，當人體吸入肺後會造成肺泡及細胞膜受損。由於芳香族碳氫化合物乃是油品中較毒之成分，人體一旦經由呼吸系統吸入或是經由皮膚接觸等途徑攝取，將造成骨骼細胞損傷、白血球減少、貧血、頭痛等病症 (童翔新等，1999)。. 2-7 影響土壤微生物活性因子. 柴油在土壤環境中之宿命和行徑，受到土壤微生物之影響相當地大，土壤微生物族群構成一個生化上的複雜系統，且能分解大多數之柴油，土壤微生物族群之活性常受到土壤有機物含量、水分含量、透氣性、溫度及. 14.

(29) 酸鹼度之影響，而微生物之活性往往影響其在土壤環境中分解油品之能力 (陳谷汎等，2002)。影響微生物在土壤中分解柴油之主要因子之討論如下：. (1) 土壤有機物含量. 土壤中之有機物能促進及穩定土壤之團粒作用，增加土壤通氣及提高透水性，減少逕流或沖蝕之害、增加陽離子交換能力以降低微量元素的流。土壤有機質具有極大之表面積，可吸附大量之油品，而吸附油品之方式，為同時具有表面吸附與深入內層吸附，對油品之吸收量大增，故其吸附作用和土壤有機質之關係相當密切。. (2) 土壤水分含量. 當土壤水分過多時，將使得土壤孔隙被水分填滿，形成缺氧狀態，易導致微生物活性不佳，而土壤水分過少時，乾燥的土壤內會因為有機污染物被土壤吸附，而沒有擴散作用，故隨著水分含量之增加，水分競爭土壤表面之吸附中心，造成部分油品被水分子取代而自土壤中脫附，即迅速地增加污染物之擴散作用，這是由於水分子具有極性，使水成為離子性溶質之優良溶劑，大部分的油品與粘土礦物間之作用，都涉及以水當作媒體，許多污染物之蒸氣壓很低，必須在土壤水中以擴散作用或整體移動方式接近粘土礦物之表面。. (3) 土壤透氣性. 一般而言，粗質的土壤通氣情況通常會比細質的土壤要來的好，而若土壤的有機質含量多也會較土壤較疏鬆的好，但越深層的土壤則因壓實的 15.

(30) 關係而使通氣較不良，王一雄等 (1995) 提出的數據中顯示，在土層深度 3～8cm 可以展現出較大的微生物群和微生物活性，在自然界中好氧性微生物為較大部分，所以在通氣良好的土壤環境中，將能展現出較大之微生物活性，且在分解土壤有機物方面會有較佳的效果 (Rhykerd et al., 1999)。. (4) 溫度. 溫度為影響微生物生長速率之重要因子，土壤的溫度會影響土壤中微生物之活動與繁殖，其中最重要的是影響微生物之活性。在低溫時，微生物之活性會較低，故造成整個生物分解速率降低，而高溫時，微生物代謝碳氫化合物的速率會加快，由 Q10 定理得知，溫度每上升 10℃，微生物的代謝速率會增加兩倍。. (5) 土壤酸鹼度. pH 會影響重金屬等無機物之沈澱和溶解作用，也因而影響了污染物在土壤中之移動性。對於不同屬種的微生物而言，均有其最適當的土壤酸鹼度範圍，然而大部分微生物生長之最適酸鹼度為 pH 6 至 7.5 之中性偏微酸性之範圍 (王一雄，1997)。. 童翔新等 (1999) 認為 pH 在大多數之生物復育中，其調整大多沒有必要，除非是受污染場址之 pH 特別極端或因生物降解使得 pH 造成明顯之變化，才需做調整。. (6) 其它 16.

(31) 綜合上述，並針對其它生物降解之影響因子，如表 2-7-1 所述。. 17.

(32) 表 2-7-1、生物復育之影響因子 (Bopathy, 2000) _______________________________________________________ 影響生物復育之主要因子 _______________________________________________________ 微生物生長直到達到臨界生物質量突變和水平基因的轉換豐富的微生物群代謝毒物之產生. 環境優先物質的消耗營養鹽的缺乏環境條件的抑制. 物質污染物濃度太低污染物之化學結構污染物之毒性污染物之溶解度. 生物好氧或厭氧過程好氧/減少潛能有效的電子接受者埸址中微生物群的存在 18.

(33) 生長基質與共代謝污染物的種類濃度碳源存在交替微生物之相互影響 (競爭，交替，和掠奪). 污染物的物化生物有效性吸收平衡不可逆的吸收合併至腐植質. 質量轉換的限制氧的傳輸和溶解營養鹽的傳輸溶解度/可溶混性/和水 _________________________________________________________. 19.

(34) 2-8 污染場址之復育技術. 隨著土壤復育技術之發展，近年來已成為了相當成熟的科技，從文獻上得知以澳洲及紐西蘭之經驗，在一個面積分布範圍廣大之污染場址上，且沒有很高污染物質濃度的時候，即在管制標準兩倍以內，利用翻轉法為合適之整治方法，另外，翻轉法比排土客土及淋洗法具有優勢，這是因為以台灣環境現況要找尋適合的棄土放置場實屬不易，且利用化學淋洗的方法在成本考量上將較不具經濟效益，故以該方法做為本研究之復育方法，乃為較適當之考量，如果在高濃度污染區域 (hot spot) 時，亦即超過法規標準之三倍以上時稱之，亦可考慮利用其他整治方式進行整治 (葉琮裕、王瑞斌，2002)。. 而依據復育目的主要可以區分為控制方法與清除方法，控制方法主要係利用工程技術，以有效減少或避免污染物質進入土壤中，該方法在施行時往往須配合清除技術，才能達到預期效果。一般而言，土壤復育技術大致可歸類為以下三種：. (1) 生物處理方法. 該法主要乃利用微生物而去除污染物質，亦即將污染物降解或是轉移成低毒性或是無毒性之程度，其原理乃是在含有污染物質的環境下進行好氧或厭氧分解，配合充分的水分和利用微生物生存及成長所需之營養鹽及碳源來提供微生物生長之營養基質和分解污染物之微生物來源，而藉此來降低或是消除環境污染物，若以經濟成本考量，生物處理方法將比其他物化處理方法來得要低廉且不易破壞環境等之優點，如圖 2-8-1 所示。 20.

(35) 圖 2-8-1、現地生物處理與其他處理方式費用之比較 (Glass, 1995). (2) 物理或化學處理方法. 該法係使污染物表現出各種不同型態及種類，進而運用萃取、提出、化學除毒等機制，加以去除，如：沈澱與化學吸附作用、氧化或還原作用、固體之吸附作用及微生物的新陳代謝作用等。. (3) 工程處理法. 即利用傳統工程機具進行客土、排土、翻轉等方式進行復育。目前國內針對受油污染之土壤主要乃採取自然衰減方式 (natural attenuation) 處理，而在實施生物復育工作時，若能配合上述翻耕方法使有機污染物在土壤內重新分布則不失為更相當有效率之辦法。一般而言，針對油污染事件，較引人注目的技術乃生物處理方法，因為它可以適用在現地 (in-situ) 處理，也可以適用於離地 (ex-situ) 處理兩 21.

(36) 大類。. 2-8-1 現地處理 (In-situ treatment). 即對於受污染之土壤或地下水所在地加以處理，一般而言，現階段之土壤復育技術之發展以現地處理較受重視，主要優點是因為對操作人員之危害性甚少、且可保存地上建築物、經處理後，周圍之土地尚可利用、所需成本也較經濟，但是也有必須擴大場址的調查與監測、清除方式需考量程序控制及土壤種類之影響、且必須考量分離及控制方法等缺點 (張添晉等，1997)。. 一般而言，現地處理包含有許多不同技術，大部分相同的方式亦即增加氧氣的有效性，如生物氣提法 (bioventing)、添加過氧化氫 (H2O2) 注入井內，或是利用添加營養鹽方式，如客土、翻土法再配合添加土壤改良劑、膨鬆劑 (bulking agents) 如木屑、稻草等，該方法乃為本研究所採用之方式，而其應用於現地處理之質量平衡如表 2-8-1 所示，由表中可知以堆肥混合受污染土壤其主要分解產物為二氧化碳 (CO2)。而有些案例，係植種特殊能降解該污染物質之微生物進行生物降解 (Zytner et al., 2001)。. 22.

(37) 表 2-8-1、石油碳氫化合物於土壤與堆肥混合 21 天之質量平衡 (Hupe, 1996) 各部份組成. 起始碳濃度部份 (％). TPHD 之萃取揮發. 8 4. 轉換成 CO2. 59. 難分解有機物微生物質量. 24 4. 2-8-2 離地處理 (ex-situ treatment). 離地處理 (ex-situ treatment)，也就是將受污染之土壤或地下水搬離至其它地方再加以處理。不過，離場處理比就地處理有較快、較容易控制且能處理更多種污染物及土壤種類之優點，但也因為離地處理之關係，故所花費之整治成本會較高。如上節所述，就地處理則比離場處理較為方便且較為經濟，加上若是處理通透性較高的土壤會有較佳的效果。. 而以生物處理方進行離地處理，Cassidy et al., (1997) 和 Puskas et al. (1995) 利用生物反應槽，其包含和現地處理相同之處理方式，但是係將土壤挖掘並轉移至反應槽內進行，利用反應槽之處理優點為可以利用均勻攪拌之方式達到氧氣和營養鹽之均勻散布，且可以在處理時適時地提高溫度，而達到相當良好之降解效果。Jorgensen, et al. (2000) 則利用堆肥以生物堆方式分別處理受礦油和柴油污染之土壤，結果礦油濃度由 2400 mg/kg 降解至 700 mg/kg 約 70％，而柴油濃度由 700 mg/kg 降解至 200 mg/kg 約 71％之效果。. 23.

(38) 2-9 實驗設計方法介紹. 對於多變數因子實驗系統之因子影響效應探討及最適化研究，常常會有不同因子與因子間交互影響效應存在；如果使用傳統的「一組實驗探討一個因子」之實驗設計方法，在固定其他因子，只改變一個因子水準下來進行探討，常會因各變數間所存在的交互影響效應，而無法得到真正的最佳條件組合。中央合成設計 (Central composite design) 與反應曲面法 (Response Surface Methodology, RSM) 為一結合數學應用、統計分析與實驗設計之技術，探討獨立變數與反應變數之間的數學模式關係，經由所關心的實驗區域內以有系統的方式進行實驗，進而求得所需要的反應值及變數值。. 2-9-1 中央合成設計. 一般而言，在實驗過程中，以因子設計 (factorial designs) 是最具效率的實驗，也就是除了可以暸解因子之主效應關係外，還可以減少實驗之組數。故常用之線性統計模型為:. y = µ + τ i + β j + (τβ ) ij + ∈ij. 其中 µ 是總平均效應，τ i 是列因子第 i 個水準的效應， β j 是行因子第 j 個水準的效應，(τβ )ij 是 τ i 和 β j 之間的交互作用效應，和 ∈ij 是隨機誤差項。然而當我們在探討因子之間的主效應是否顯著時，常常也需考慮到其交互作用是否也會影響整個實驗結果，除非無交互作用的模型是適當的，故此時必需要考慮曲率的效應，也就是必須以一個更完整的二 24.

(39) 階模型設計來觀測實驗範圍之變化，而為了配適二階模型，即可利用中央合成設計 (Central composite design)，一般來說，中央合成設計即包含了一個 2k 因子 (或解析度 Ⅴ 的部份因子) 設計，2k 個軸點試驗，和 nc 個中心點試驗。而本研究採用中央合成設計的另一方面考量，是因為其具有容納區集劃分的能力，亦即可以用區集的方式進行中央合成設計，進行更靈活的安排實驗設計 (Montgomery, 1998)。. 2-9-2 反應曲面法和區集劃分. 反應曲面法乃為有助於研究問題模型的建立以及利用數學方式統計的手法，將反應時和變數的影響找到最佳化的反應，一般而言，其函數可以由下列表示： y = f ( x1 , x 2 ) + ∈. 其中 ∈ 代表反應 y 中所觀察到的雜音或誤差。而該函數所代表的曲面就稱之為反應曲面。然而在大多數之反應曲面問題中，反應和獨立變數間關係之形式常常是未知的，因此需利用反應曲面來找出對於 y 和獨立變數間適當的近似函數關係。. 當利用反應曲面設計時，對於會擾亂的變數需要考慮以區集劃分來去除其影響，為了使區集效應不會影響反應曲面模型的參數估計值，在 2k 設計中使用 2r 個區集設計，這些設計的中心點應均勻分布給區集，如此的設計被稱之為正交地區集 (block orthogonally)，而二階設計要能正交地區集，有兩個條件必須滿足，這兩個條件分別是. 1.. 每個區集必須是一個一階正交設計；亦即 25.

(40) nb. ∑x u =1. iu. x ju = 0. i ≠ j = 0,1,L, k. 對所有的 b. 其中 xiu 和 x ju 為實驗的第 u 個試驗中的第 i 個和第 j 個變數的水準及 xou =1 對所有的 u 。 2.. 各變數的總平方和中由各區集所貢獻的部份的比例必須等於區集裡觀測值個數與總觀測值個數的比例；亦即 nb. ∑x. 2 iu. ∑x. 2 iu. u =1 N u =1. =. nb N. i = 1,2,L, k. 對所有的 b. 其中 N 是試驗總次數。. 在本研究中，由於所考慮的溫度因素係為自然環境下無法人為控制之因子，故將溫度以區集劃分來去除其影響，根據中華民國統計月報之資料調查近二年之平均最高溫和最低溫，再利用實驗室之恆溫箱控制在上述溫度以模擬在最高溫和最低溫時降解過程，最後在實驗結果探討其差異 (Prochazka, et al., 2003；Montgomery, 1998)。. 26.

(41) 第三章實驗設備及實驗方法. 3-1 研究流程. 本研究為了要進行受柴油污染之模擬研究，首先進行相關文獻蒐集，以決定共有哪些因子會影響生物降解，而為了要暸解因子之間之相互關係，並期望能在減少實驗組數之情形下，於是利用中央合成設計實驗方法並配合反應曲面，將實驗後之結果，對於因子之相互影響關係，以 F 檢定方式判斷影響因子之顯著效果，以做為降解結果之依據。. 在進行實驗設計前先進行土壤與堆肥之基本性質分析，以便能掌握土壤和堆肥之特性和決定影響因子之範圍，才能針對有興趣之範圍進行實驗設計。. 本研究室所使用模擬受柴油污染之土壤，乃是採自西湖溪之未受污染土壤，這是針對後龍溪污染事件所影響的河川中測得柴油濃度最高的地方，故以此地點之土壤做為具代表性之土壤，而堆肥係由台北市民生污水處理廠 (目前已關廠) 下水污泥經過醱酵過程所產生之營養鹽，期望能從本實驗之結果在往後類似柴油污染事件能有效率地解決污染問題。. 為了模擬受柴油污染之土壤，做法係將風乾過篩後之土壤取 4kg 於反應槽中，然後將柴油 (2500mg/kg) 均勻噴灑在土壤上，並仔細地攪拌使柴油能在土壤中分佈均勻，由於柴油乃半揮發性有機物，為了避免揮發部分的柴油造成最終降解效果之誤判，故先做了一個月的揮發實驗，亦即將柴油裝在燒杯內，以秤重方式觀察柴油揮發部分一個月，結果發現柴油揮發部分在第一周的揮發量占整個揮發量的 80％，如圖 3-1-1 所示。故 27.

(42) 將攪拌均勻之土壤靜置一周後使其揮發穩定後，再依不同摻合比加入堆肥，予以攪拌均勻及採樣分析以作為評估柴油污染之初始污染濃度，再按照中央合成設計所規定的組數，針對不同實驗組之不同控制條件，以均勻灑水方式，添加水分使其達到欲監測之含水率，再放至恆溫箱中設定欲監測之溫度，以完成實驗條件之控制。. 除了每日翻堆以保持土壤良好的通氣狀態外，在水分控制方面，利用秤重方式以補充因揮發而損失之水分 (在此乃將柴油之揮發、降解、氧化等作用忽略不計，土壤減少之重量主要乃為水分蒸發所導致)，並定期採樣以氣相層析儀分析 TPHD 濃度，再依據實驗設計後之結果，判斷影響因子之相互作用是否顯著，和檢定其模型的適當性，以進行最後再確認之實驗。實驗設計之分析項目乃以測定 TPHD 為主，而在最後之確定實驗再進行 TPHD 和總菌數、EC 值、pH 值等並進行探討，以求能充分地暸解生物降解之成效。本研究之流程如圖 3-1-2 所示。. 在控制組方面，為了要進一步確定柴油降解反應是否主要由生物降解所造成，故進行測定單獨土壤 (soil only) 實驗組、單獨堆肥 (compost only) 實驗組和滅菌 (biocide) 組，在滅菌組方面，乃針對降解率較高的實驗組之摻合比，再利用疊氮化鈉 (NaN3) 做為生物的抑制劑,這是由於疊氮化鈉具有除霉性、殺菌性的特性，故選擇將疊氮化鈉做為滅菌組之抑制劑，滅菌方法係將 25g 疊氮化鈉 (NaN3) 加入 100ml 之蒸餾水，並將攪拌均後，再以噴灑方式作成滅菌組 (Taylor and Viraraghavan, 1999)。. 28.

(43) solution weight (g). 89 88.5 88 87.5 87 86.5 86 0. 5. 10. 15. Time (days) 圖 3-1-1、柴油溶液揮發觀察圖. 29. 20.

(44) 圖 3-1-2、實驗流程. 30.

(45) 3-2 實驗方法. 3-2-1 土壤和堆肥之基本性質分析. 本次實驗所使用的土壤乃是採自西湖溪西濱公路橋南岸下游小支流的土壤做為代表性的土壤，並於採集回來的土樣除去石礫、樹根、雜草及其它外來大型物等，經風乾後，磨碎使其通過 2mm 篩，而之所以過 2mm 篩，是因為土粒直徑在 2mm 以上者，一般統稱為石礫，而在 2mm 以下者才算為真正的土壤粒子 (王一雄，1997)，故需經由過篩後，再將之置放於保存箱中室溫保存。. 另外欲摻合之營養鹽乃採自台北市民生污水處理廠 (目前已停廠) 污泥經堆肥化後之成品。為了使其均勻度相同，故也經風乾後先行磨碎後過 2mm 篩，再放置於保存箱中室溫中保存。. 最後將上述之土壤和堆肥進行土壤 pH 值、含水率、有機質含量、陽離子交換容量、土壤質地分析等基本性質分析。. 3-2-2 土壤 pH 值. 土壤 pH 值之測定乃是根據環保署所研訂的土壤污染物檢測標準方法 (NIEA S410.60T)，取 20g 的土壤樣品於 50mL 的燒杯內，加入 20ml 的去離子水，並在 30 分鐘內攪拌懸浮液數次之後靜置約一小時，使其懸浮泥土沈澱，再利用校正後之 pH 計進行測定。如果所測得 pH 值大於 7，則需假設為石灰質土壤而進行前處理，即取 10g 的土壤樣品於 50mL 的燒杯中，加入 20mL 的 0.01M 之氯化鈣溶液，並在 30 分鐘內攪拌懸 31.

(46) 浮液數次，之後靜置約 30 分鐘，使其懸浮泥土沈澱，再利用校正後之 pH 計進行測定，而報告結果為在 0.01 M 氯化鈣水溶液中測得之土壤酸鹼值。. 3-2-3 土壤電導度測定. 導電度計在測定前，宜以標準 KCl 溶液加以訂正，以確保樣品測定之準確性。導電度計所用之電極常數常將決定測定值之精確度，而在本實驗中乃以 1:1 土水比所得萃取液測定其結果。. 一般土壤含鹽量高，導電度 (EC) 超過 2 ms/cm 鹽分所形成之滲透壓與水勢能相加，會使植物之張力提前達到可忍耐度 (土壤分析手冊， 1995)。. 3-2-4 含水率. 含水率的測定方法是由環保署所研訂的土壤污染物檢測標準方法 (NIEA S280.61C)，方法為取乾淨附蓋稱量瓶置於烘箱內，以 105 ± 5 ℃ 乾燥，然後蓋上蓋子移至乾燥器內冷卻至少 45 分鐘，測定稱量瓶的重量（m0），精秤至 10 mg。以藥杓將 30 至 40 g 土壤置入稱量瓶中，加蓋精秤稱量瓶及土壤重（m1）準確至 10 mg。將土壤、稱量瓶及瓶蓋放入 105 ℃ 烘箱中，直至恆重。稱量瓶加蓋於乾燥器中冷卻器中冷卻至少 45 分鐘。取出加蓋稱量瓶，旋即精秤乾燥後土壤及稱量瓶重量（m2）準確至 10 mg。. 以下式乾重量為基礎計算水分含量百分比，重量百分比精確至 0.1 32.

(47) ％：水分含量 W H O (m / m, ％) = 2. m1 − m 2 × 100 m 2 − m0. m0：含蓋稱量瓶空重（g） m1：含蓋稱量瓶及風乾土或田間含水土壤重（g） m2：含蓋稱量瓶及烘乾土重（g）. 3-2-5 田間容水量. 田間容水量 (Field capacity) 係指土壤中之水份，經重力而下降，至不再移動的水分含是。方法是將通過 40 號篩之風乾土樣，取出約 50 克，置於蒸發皿中，加少許清水拌和之，使成球狀，然後用拌和刀輕輕壓平之。再用滴管滴水一滴於壓平之土面上，如水點在 30 秒鐘內被土壤吸收，應再加少許清水拌和之。重複以上手續，直至水滴恰在 30 秒鐘內仍不被吸收，而擴散於壓平之面上呈光潤狀態者，此時之土壤水分含量即為田間之容水量，含水量測定方法和含水率相同 (易任，1986)。. 3-2-6 有機碳含量. 有機碳含量乃是採用 Walkley-Black 的方法，秤取 1.00 g 的風乾土壤樣品置於 500mL 三角燒瓶內，加入 1N K2CrO7 10mL 及 20mL 的濃硫酸，輕搖後靜置冷卻後，加入 100mL 的去離子水、 5mL 的 H3PO4 及 2 滴 Diphenylamine 指示劑，再以 0.5N FeSO4 滴定之；滴定顏色由灰藍色開始滴定至綠色而達到滴定終點 (土壤分析手冊，1995)。. 33.

(48) 3-2-7 土壤質地分析. 土壤質地是指土壤中大小粒子之分佈。更明確言之，是指土壤中砂粒、坋粒及黏粒含量之相對比例。由於土壤質地為影響土壤中物理化學反應之重要性質，故土壤質地乃是土壤基本性質分析中不可或缺之一項。本方法乃採用比重計法，即將土壤樣品經化學和物理之前處理，使土壤粒子分散。分散後之土壤粒子懸濁液於沈降筒內自然沈降，在一定時間，將一特製之比重計放入懸濁液內，測定土壤懸濁液之比重，然後可以依照史脫克斯定律 (Stokes` law) 之基本原理，將比重計讀數經由計算求得土壤樣品中砂粒、坋粒及黏粒之含量百分率，進換算而得到土壤中砂粒、坋粒及黏粒含量之相對比例，再由查圖 3-2-1，而判斷出土壤質地之性質 (土壤分析手冊，1995)。通常質地會影響土壤之通氣與排水，粗質地之土壤排水通氣好，但吸水能力較差；粘質地之土壤則易造成排水差、通氣不好，但吸水能力反而較差之情況。. 34.

(49) 圖 3-2-1、正三角形土壤質地分類圖. 35.

(50) 3-2-8 陽離子交換容量. 陽離子交換容量之測定乃是依據環保署所研訂的土壤污染物檢測標準方法 (NIEA S202.60A)。其方法乃先稱取 4.00g (精秤至 0.01g) 的風乾土壤，放置於離心管中，加入 33ml 1M 醋酸鈉溶液，試管加蓋，用振盪器振盪 5 分鐘，然後離心至溶液澄清為止。接著移出並丟棄上澄液，重覆上述步驟三次。加入 33ml 99% 異丙醇或 95% 乙醇，加蓋，用振盪器振盪 5 分鐘，然後離心至溶液澄清為止。然後丟棄上澄液，重覆上述步驟二次。加入 33ml 中性 1M 醋酸銨溶液，加蓋，用振盪器振盪 5 分鐘後，離心至溶液澄清為止，將洗滌液倒入 100ml A 級量瓶中。再重覆上述步驟二次，結合洗滌液以中性 1M 醋酸銨溶液定量至 100ml，用原子吸收或發射光譜儀或相當的方法測定鈉離子。. 最後，以下列式子計算陽離子交換容量：陽離子交換容量 (meq/100g)=. C ×V × 100 W (1 + R ). C: 鈉離子濃度 (M) V: 結合洗滌液以中性 1M 醋酸銨溶液稀釋後之最終體積 (mL) W: 稱取經風乾之土壤重 (g) R: 風乾土壤之水分含量. 3-2-9 重金屬分析. 本研究係根據環保署所研訂的土壤污染物檢測標準方法 (NIEA S321.63B) 檢測方法，並配合火焰式原子吸收光譜儀進行分析，其方法乃是秤取適量已經風乾處理之土壤樣品，將已預處理的土壤樣品以鹽酸和硝 36.

(51) 酸混合，在室溫下靜置萃取 16 小時，再加熱至沸騰並迴流 2 小時。萃出消化液經定量，再以適宜的原子光譜分析儀分析其濃度，並經下列式子求出各重金屬濃度。. 其中 A：檢量線求得之濃度 (mg/l) V：樣品經過濾或離心後定量之最終體積 (L) f：上機測試時之稀釋倍數 W：風乾土壤之取樣量 WH2O：土壤之水分含量. 37.

(52) 3-3 受柴油污染土壤採樣及萃取方法. 在實驗過程中，每天將土樣用鏟子垂直翻轉以利保持好氧狀態下之分解及以稱重方式噴灑因揮發而損失之水分 (在此乃假設土樣所減少之損失主要乃水分揮發所致，柴油之揮發和其氧化分解作用等，由於損失較少故忽略不計)，以維持土樣的含水量，而採樣時，係利用系統採樣 (systematic grid sampling) 之方式，如圖 3-3-1 所示，系統採樣方法為提供於場址條件上較公正簡單的統計方法, 通常比其他採樣計畫還優先考慮利用於預測污染場址的平均濃度、污染總量、分佈形態等 (Gilbert，1987)。. 將反應槽之土樣取六等分後以粗吸管插入反應槽之土樣中，重覆取樣後並混合攪拌以達均勻取樣目的，再秤取足量之土壤後，依照環保署所研訂之索式萃取法 (NIEA M165.00C)，該法除了適用於分離及濃縮不溶於水樣品的製備，還可確保萃取萃取溶劑與樣品基質密切接觸。將土壤置於圓筒濾紙中，加入無水硫酸鈉使其乾燥後，並以二氯甲烷和丙酮作為萃取溶劑，於一圓底瓶中，放入萃取溶劑及 1 或 2 粒乾淨沸石，將圓底瓶接至萃取設備，進行樣品萃取，以每小時 4 至 6 循環（cycles / hr）萃取 16 小時。最後以 K – D 濃縮裝置放入熱水浴中濃縮並以溶劑調整最終體積為 1.0 至 2.0 mL。. ●. ●. ●. ●. ●. ●. 圖 3-3-1、網格狀之系統採樣方式.. 38.

(53) 3-4 實驗中總石油碳氫化合物之 (TPHD) 分析. 本實驗土壤中總石油碳氫化合物 (TPHD) 之分析主要採用國內環保署公告之土壤及事業廢棄物中非鹵有機物檢測方法－氣相層析儀/火焰離子化偵測法（GC/FID）方法 (NIEA M611.00C) 為土壤中柴油 (TPHD) 之分析方法，茲將分析方法之重點整理如下：. 3-4-1 設備及材料. (1) 氣相層析/火燄離子化偵測器 (GC/FID) (2) DB-5 管柱 (30-m length×0.53-mm internal diameter×1.5-µm film). 3-4-2 分析步驟. (1)直接注射以注射器將萃取定容後之樣品直接注入 GC-FID 中。. (2)氣相層析條件載流氣體 (He) 流速：5 至 7 mL/分鐘補充氣體 (He) 流速：30 mL/分鐘注射埠溫度：200 ℃ 偵測器溫度：340 ℃ 升溫設定起始溫度：45 ℃，維持 3 分鐘升溫速度：45 ℃ 以每分鐘 12 ℃ 升溫至 275 ℃ 最終溫度：275 ℃，維持 12 分鐘 39.

(54) 3-4-3 氣相層析分析. 分析柴油類有機物 (DRO) 時，係將 C10 到 C23 範圍內析出所有的波峰面積加總，亦即在 C10 到C23 的滯留時間之間畫一水平的基線積分而得，如圖 4-6-2，而柴油類有機物 (DRO) 的層析條件會使管柱中的物質有相當程度的滲出，造成層析圖中的基線上昇，故在分析 DRO 時，將執行此一圖譜面積扣除，並於每 12 小時內分析一二氯甲烷的空白，將樣品面積扣除此一空白面積後所得的面積差即為 DRO 的濃度，而進行氣相層析儀或氣相層析質譜儀之分析時，必須執行品管 (QC) 查核樣品分析來確認分析系統的功能。. 3-4-4 柴油成份分析. 為了要暸解柴油總石油碳氫化合物 (TPHD) 之成份組成，經由購置之烷類標準品 (ASTM D5307 Crude Oil Quantitative std.) 與文獻 (Jonge et al., 1997) 進行柴油成份的確認，如圖 3-4-1、表 3-4-1 所示。由圖可知本實驗之柴TPHD之濃度範圍為 C10-C23 (沸點範圍乃 170 ℃~275 ℃ 之間 )，其中 Pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane, C19H40) 和 Phytane (2,6,10,14-tetramethylhexadecane, C20H42) 乃分別緊鄰 C17 和 C18 出現之支鏈化合物，為生物難分解之化合物，常可依此判斷生物降解過程中是否具有共代謝反應 (Puskas et al., 1995)。. 40.

(55) 圖 3-4-1、烷類標準品 (ASTM D5307) 之層析圖譜. 表 3-4-1、柴油烷類標準品 (n-alkanes) 各成分之組成 Hydrocarbons. Target TPH. C10C22. Decane. C11C24. Undecane. C12C26. Dodecane. C13C28. Tridecane. C14C30. Tetradecane. C15C32. Pentadecane. C16C34. Hexadecane. C17C36 Pristane C18C38 Phytane C20C42. Heptadecane 2,6,10,14-tetramethylpentadecane. Octadecane 2,6,10,14-tetramethylhexadecane. Elcosane. C24C50. Tetracosane. (ASTM D5307 Crude Oil quantitative std.； Wang, et al., 1997). 41.

(56) 3-5 品質保證與品質管制 (QA/QC). 本研究在為求保證分析結果的品質能符合某設定好之標準，利用一些步驟，應用統計學上的原理和方法，來評鑑或控制分析結果的準確度，以確保分析品質的可靠性、滿意度及經濟性。. 3-5-1 建立起始檢量線. 本方法係以注射針由索氏萃取法所得之固態樣品萃取液而導入系統，在導入模式須建立不同檢量線及設定氣相層析操作參數，使其在應用時，可供適當的儀器績效，而導入的方法係在實驗中以注射針取 239.8µl (取 240µl) 於中國石油加油站購買之標準柴油再以二氯甲烷 (dichloromethane) 定量至 100ml，依序列稀釋法分別配製 150、300、 600、1500、3000ppm 等五種不同濃度之標準液，以一定之注射量 (1 µl) 注入氣相層析儀中分析。. 3-5-2 檢量線的線性和確認. 若校正因子在工作範圍內之相對標準偏差 (RSD) 小於 20％，則可假設檢量線為通過原點之直線，而以平均校正因子代替檢量線作定量分析。若正因子在工作範圍內之相對標準偏差 (RSD) 大於 20％，則不能假設檢量線通過原點。. 檢量線與滯留時間至少須每 12 小時確認一次，即以量測碳氫化合物標準品的滯留時間來確認，若待測物感應 (或計算濃度) 之偏差在起始檢量線 ±15％以內，則可視起始檢量線仍為有效，而確認濃度係以 1500 42.

(57) ppm 之標準液做為檢量線之確認濃度。. 所有在檢量線確認分析中之目標待測物均必須落在先前已建立之滯留時窗內，若有任一待測物不在所建立的時窗內，則必須採取修正措施復原系統或重新製作該化合物之檢量線。. 溶劑空白和任何方法空白應與檢量線確認分析同時進行，以確定不致因實驗室污染而造成偽陽性之結果。. 3-5-3 柴油類有機物 (Diesel range organics，DRO) 之外標準品校正. DRO 之校正與單一待測物有顯著的不同，最特別的是在滯留時窗範圍內的整體圖譜面積，包括在各個單一波峰下無法解析的混合物，都應該視為校正的感應。將待測物配製五種濃度之檢量線標準液。其中之一外標準溶液濃度須相當於或低於定量極限 (以製備方法中之最後特定體積不稀釋為基準)。其餘的濃度須涵蓋實際樣品的預期濃度或在偵測器之工作範圍內。將待測物檢量線標準溶液導入氣相層析儀中，並依注射劑量對面積製成數據表。. 採用外標準品校正法分析的樣品，其分析序列前後均必須要有檢量線的確認，且其數據均須符合品管要求，若有樣品分析落在檢量線確認超出品管規範，即使最終檢量線符合品管要求，其間所分析之樣品均須重新分析。. 43.

(58) 3-5-4 方法偵測極限 (Method Detection Limit, MDL). 該法係指待測物在一含特定基質的樣品中，在 99％可信度 (Confidence) 內，可偵測到該待測物之最低量濃度。即利用一系列含待測成份之已知基質樣品經過反覆分析測得其方法偵測極限值。. 3-5-5 空白樣品分析 (Blank). 所有試劑空白或基質樣品添加樣品，須進行與真實樣品相同的處理及分析步驟。亦即在進行任何樣品之分析步驟前，須進行試劑空白分析，以確認所有玻璃、塑膠器皿及試劑中無干擾物質。執行每批樣品分析時，須同時進行一方法空白分析，以確認實驗室內無例行的污染。空白樣品必須經過與樣品相同的所有製備及測試步驟。每批樣品或至多 10 個樣品分析時，必須執行一個試劑空白。. 3-5-6 重覆樣品分析 (Duplicate). 在分析每批樣品 (至多 10 個樣品) 時，須執行一個重覆或是基質樣品添加重覆分析，同一樣品分析二次，所得測定值計算其相對百分比偏差 R 認定分析的精密度。藉此可確定在實驗分析過程的精密度。. 3-5-7 添加樣品分析 (Spike sample analysis). 添加樣品在分析每批樣品時，須執行一個基質樣品添加，再與原樣品經過相同程序處理分析計算其添加回收率，可檢測樣品的基質效應與檢測方法的誤差。以藉此了解檢測方法之適用性及樣品之基質干擾。 44.

(59) 3-6 生物菌數測定. 3-6-1 分析方法. 本研究乃採 4’ , 6 –diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色法配合螢光顯微鏡以進行生物菌數計數 (彭誌強，2002)，其原理係將 DAPI 螢光染料，藉由染料吸收較短波長，而放出長波長之光時，而鑑別出菌種或其生理特性。. 方法乃將採樣後之懸浮液以 1:3 的體積進行固定，再使用離心機於轉速 1000 rpm 下離心 3 分鐘，使之成為 pellet。加入 1ml PBS (pH 7.2) 使 pellet 再懸浮，並小心倒掉上層液，再將樣品保存於 50％ PBS-EtOH (vol/vol)。使用針筒 (5ml-27G) 慢慢抽打樣品，再用均質器小心抽打數次。於 4℃ 冷藏打散污泥。分別取 3µl 固定好的樣品點到 slide 的 well 上，室溫風乾。分別將 Slide 浸入 50、80、96％ (v/v) 的乙醇裡各脫水 2 分鐘。風乾後，將 Slide 保存於室溫下不受污染處，將 DAPI 染劑點至 well 上靜置約三十分鐘後，以無菌水洗滌，將其風乾後即完成微生物總菌固定之動作。. 3-6-2 觀察 (Visualization). 一般染色後應立即觀察以免螢光消失後造成觀察後之困擾，若不能立即觀察時，則需放置在乾燥盒內，以保持特異螢光。將 DAPI 染色當做總菌數，以螢光顯微鏡在視野下拍照並計數總菌數，平均同一樣品採取拍 10 組為平均值，其目的乃為降低樣本之標準偏差。. 45.

(60) 一般大部分知道可以分解原油 (crude oil) 和煉油 (refined oil) 之微生物主要包含了真核生物和原核生物兩大類，而由上述分類之微生物分別有 Nocardia，Pseudomonas，Acinetobacter，Flavobacterium， Micrococcus，Arthrobacter，Corynebacterium，Achromobacter， Rhodococcus，Alcaligenes，Mycobacterium，Bacillus，Aspergillus， Mucor，Fusarium，Penicillium，Rhodotorula，Candida 和 Sporobolomyces (Atlas, et al., 1992；Bossert, et al., 1984)，故本研究將參考上述微生物種類而進行計數。. 46.

(61) 3-7 實驗設備. 3-7-1 反應槽. 本次實驗反應槽之選擇乃採用透明壓克力材質製成。處理槽為一 42×33×10 cm 無蓋之方形槽體，其反應槽如下圖 3-7-1 所示。. 圖 3-7-1、柴油降解實驗之反應槽剖面圖. 47.

(62) 3-7 實驗設備及藥品. 本研究所使用之儀器設備及藥品如下表 3-7-1 所示。. 表 3-7-1、實驗使用之儀器設備及藥品主要分析儀器及藥品廠牌及規格高級柴油 (Diesel) 中國石油公司烷類標準品 (Crude Oil Quantitative Std.) SUPELCO - ASTM D5307 二氯甲烷 (Dichloromethane) Mallinckrodt 丙酮 (Acetone) PANREAC 無水硫酸鈉 (Sodium sulfate anhydre) PANREAC DAPI 染劑 (4’, 6-diamidino-2-phenylindole) SIGMA D9542 乙醇 (Ethanol) Shim akyu`s pure chemicals 圓筒濾紙 (Thimble filter) ADVANTEC 30×100 mm 3 ml 離心機 (Universal centrifuge) HERAEUS BIOFUGE PICO 10 ml 離心機 (Universal centrifuge) MIKRO 22R 火焰式原子吸收光譜儀 (flame atomic HITACHI Model Z-8100 absorption spectrometer) 氣相層析儀 (Gas Chromatography) HEWLETT-PCKARD 5890 螢光顯微鏡 (Fluorescence microscopy ) OLYMPUS COVER 018 高壓滅菌釜 (Vertical autoclave) EASTERN MEPICAC EA-635 酸鹼度計 (pH meter) SUNTEX microprocessor sp-2200 電導度計 (Conductiviyty meter) WTW CF330 電子分析天平 (Analytical balance) SARTORIUS BP2215 超音波震盪器 (Ultrasonic cleaner) BRANSON-5210 減壓濃縮機 (Rotavapor) EYELA ASPIRATOR A-3S 103℃ 高溫乾燥箱 (Hot air rapid drying oven) RISEN 分析篩 (Sieves) BUNSEKI FURUI 常溫恆溫培養箱 (Incubator) ADVANTEC C1-612 低溫恆溫培養箱 (Cooling cabinet) FIRSTEK SCIENTIFIC. 48.