中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/41247
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(2) 目. 錄. 目錄............................................................................................................. I 表目錄....................................................................................................... V 圖目錄...................................................................................................... VI 略字表................................................................................................... VIII 中文摘要................................................................................................... X 英文摘要................................................................................................. XII 第一章 緒言............................................................................................ 1 第二章 總論............................................................................................ 3 第一節 血藤 ............................................................................... 3 一、血藤之本草學考察 ................................................... 3 二、血藤之藥用植物學考察 ........................................... 5 三、血藤之藥理學考察 ................................................... 8 四、血藤之化學成分考察 ............................................... 9 第二節 血癌 ............................................................................. 10 一、血癌的症狀 ............................................................. 10 二、血癌的分類 ............................................................. 10 三、血癌的治療與進展 ................................................. 12 第三節 細胞凋亡 ..................................................................... 16 一、細胞凋亡的定義 ..................................................... 16 二、細胞凋亡與細胞壞死 ............................................. 16 三、細胞凋亡的調控機轉 ............................................. 17 四、活性氧化物與細胞凋亡 ......................................... 22 I.
(3) 第四節 三氧化二砷 ................................................................. 23 一、砷化物的醫療史 ..................................................... 23 二、三氧化二砷在癌症治療的作用機制 ..................... 24 第三章 實驗設計.................................................................................. 26 第一節 研究目的 ..................................................................... 26 第二節 實驗架構 ..................................................................... 26 第四章 實驗材料與方法 ..................................................................... 27 第一節 實驗材料 ..................................................................... 27 一、試劑 ......................................................................... 27 二、抗體 ......................................................................... 28 三、細胞株 ..................................................................... 29 四、實驗動物 ................................................................. 29 五、儀器設備 ................................................................. 29 第二節 實驗方法 ..................................................................... 31 一、植物材料之採集 ..................................................... 31 二、血藤莖部粗抽物之製備 ......................................... 31 三、高效液相層析法 ..................................................... 32 四、細胞培養 ................................................................. 32 五、藥物處理 ................................................................. 35 六、細胞生長試驗 ......................................................... 35 七、細胞核染色法 ......................................................... 36 八、細胞週期分析 ......................................................... 37 九、Annexin V / PI 雙染色法 ....................................... 38 II.
(4) 十、Active caspase-3 分析 ............................................ 39 十一、細胞內活性氧化物測定 ..................................... 40 十二、細胞蛋白質萃取 ................................................. 40 十三、蛋白質含量測定 ................................................. 41 十四、西方墨點法 ......................................................... 41 十五、裸鼠異位移植腫瘤實驗 ..................................... 42 十六、藥物合併作用分析 ............................................. 43 十七、統計方法 ............................................................. 43 第五章 實驗結果.................................................................................. 45 第一節 血藤莖部粗抽物之 HPLC 指紋圖譜 ......................... 45 第二節 血藤莖部粗抽物對於人類血癌細胞 HL-60 生長之 影響 ............................................................................. 46 第三節 血藤莖部粗抽物對於人類血癌細胞 HL-60 細胞週 期中 sub-G1 比率之影響 ............................................ 47 第四節 血藤莖部粗抽物誘導人類血癌細胞 HL-60 細胞凋 亡現象之探討 ............................................................. 48 一、以 EtBr 染色法檢測細胞凋亡之型態特徵............ 48 二、以 annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測凋亡細胞之 比率 ......................................................................... 48 三、以流式細胞儀檢測細胞內之活化態 caspase-3..... 49 第五節. 血藤莖部粗抽物對於裸鼠異位移植腫瘤實驗之影 響 ................................................................................. 50. 第六節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血癌 細胞 HL-60，Jurkat 及 Molt-3 生長之影響 ............. 51 III.
(5) 第七節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血癌 細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞內活性氧化物之影響 .... 52. 第八節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血癌 細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞週期中 sub-G1 期比率之 影響 ............................................................................. 53. 第九節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用誘導人類血癌 細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞凋亡現象之探討 ............ 54 一、以 DAPI 染色法檢測細胞凋亡之型態特徵 ......... 54 二、以 annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測凋亡細胞之 比率 ......................................................................... 54. 第十節. 利用西方墨點法探討血藤莖部粗抽物與三氧化二 砷並用誘導人類血癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞凋 亡之相關蛋白質表現 ................................................. 56. 第六章 討論.......................................................................................... 57 第七章 結論與展望 ............................................................................. 63 參考文獻.................................................................................................. 65 附錄.......................................................................................................... 96 附錄 1. 經史證類大觀本草之血藤植物圖 ................................... 96 附錄 2. 植物名實圖考之血藤植物圖 ........................................... 97 附錄 3. 血藤 (Mucuna macrocarpa) 植物外觀圖 ....................... 98 附錄 4. 血藤 (Mucuna macrocarpa) 植物型態特徵圖 ............... 99 附錄 5. 細胞凋亡主要分子傳遞路徑圖 ..................................... 100 附錄 6. 西方墨點法所使用之各種溶液配方 ............................. 101 附錄 7. 藥物合併作用分析之 CI 意義對照表 ........................... 105. IV.
(6) 表目錄 Table 1: Biological activities for extracts of Mucuna macrocarpa ......... 74 Table 2: Presence of compounds in Mucuna macrocarpa....................... 75 Table 3: Chromatographic conditions ...................................................... 76 Table 4: CI values for the combination of arsenic trioxide and crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa in leukemia cell lines after 24 h of treatment ...................................................... 77. V.
(7) 圖目錄 Figure 1: Scheme of the study on antileukemic effects of crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa .......................... 78 Figure 2: Phytochemical analyses of crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa .............................................................. 79 Figure 3: Antiproliferative effects of crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa on HL-60 cells..................................... 80 Figure 4: Cell cycle progression in crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa-treated cells ......................................... 81 Figure 5: Nuclear morphological changes induced by crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa ............................................. 82 Figure 6: Annexin V-FITC/PI analyses of crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa-treated cells ......................................... 83 Figure 7. Activation of caspase-3 in crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa-treated cells ......................................... 84 Figure 8. In vivo antiproliferative effect of crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa on human leukemia HL-60 xenografts ............................................................................................... 85 Figure 9: Antiproliferative effects of combined application of arsenic trioxide and crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa on human leukemia cells ................................... 86 Figure 10: Changes in the level of intracellular reactive oxygen species in leukemia cells exposed to arsenic trioxide and/or crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa .......................... 87 Figure 11: Cell cycle progression in leukemia cells exposed to arsenic trioxide and/or crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa ............................................................................ 89 VI.
(8) Figure 12: Nuclear morphological changes induced by arsenic trioxide and/or crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa ..... 91 Figure 13: Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) analyses of arsenic trioxide and/or crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa-treated cells. ...................................................... 92 Figure 14: Expressions of apoptosis-related proteins in leukemia cells treated with arsenic trioxide, crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa and/or N-acetyl cysteine...................... 94 Figure 15: Effects of a pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk) in cell cycle progression of leukemia cells exposed to arsenic trioxide (ATO) and crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa (CMEMM) ........................................................ 95. VII.
(9) 略字表 AML: acute myelocytic leukemia ALL: acute lymphocytic leukemia APL: acute promyelocytic leukemia ANOVA: analysis of variance Ara-C: 1-β-arabinofuranosylcytosine ATO: arsenic trioxide ATRA: all-trans retinoic acid BCA: bicinchoninic acid BSA: bovine serum albumin BHT: butylated hydroxytoluene CI: combination index CLL: chronic lymphocytic leukemia CMEMM: crude methanolic extract of Mucuna macrocarpa CML: chronic myelocytic leukemia DHE: dihydroethidium DNA: deoxyribonucleic acid DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole DMSO: dimethyl sulfoxide ECL: enhanced chemiluminescent EtBr: ethidium bromide FBS: fetal bovine serium FITC: fluorescein isothiocyanate H&E: hematoxylin and eosin HPLC: high performance liquid chromatography IC50: the concentration of 50% inhibition NAC: N-acetyl cysteine VIII.
(10) PARP: poly-ADP ribose polymerase PBS: phosphate-buffered saline PI: propidium iodide PML-RARα: promyelocytic leukemia gene product-retinoic acid receptor α ROS: reactive oxygen species RPMI: Roswell Park Memorial Institute SE: standard error TBS: Tris-buffered saline. IX.
(11) 摘. 要. 血藤 (Mucuna macrocarpa Wallich) 為豆科血藤屬植物，遍布 於台灣及東南亞中低海拔山區，民間以其莖部入藥，治療身體循環 不佳或是血液相關疾病，屬活血化瘀劑。本研究的目的在於探討血 藤是否具有抗血癌的功效，以其驗證民俗用法並提升應用價值。首 先，利用體外細胞培養模式測試血藤莖部粗抽物 (CMEMM) 對於 人類血癌細胞如 HL-60, Jurkat 和 Molt-3 的影響。實驗結果顯示， 劑量範圍在 25 µg/ml 至 75 µg/ml 之 CMEMM 對於 HL-60 細胞有抑 制生長的效果，且有時間及劑量的依存關係，其 72 小時之半數抑 制濃度 (IC50) 為 36.4 μg/ml。而 CMEMM 誘導 HL-60 細胞凋亡的 現象可經由細胞核凋亡性形態特徵的出現、細胞處於 sub-G1 期比 率的增加、annexin V-positive 比率的提升，以及細胞內活化態 caspase-3 的提升等結果證實。此外，CMEMM 於活體動物模式中 亦有顯著抑制腫瘤生長的效果，且實驗過程中對於老鼠不具毒性。 為拓展臨床上的應用價值，本研究進一步評估 CMEMM 與血癌 治療用藥三氧化二砷 (ATO) 並用的治療效果。實驗結果發現，劑 量為 50 μg/ml 之 CMEMM 與 2.5 μM 之 ATO 並用時可協同性地抑 制 HL-60 和 Jurkat 細胞生長，而 CMEMM 與 ATO 並用所誘導的細 胞 凋 亡 ， 亦 由 增 加 細 胞 處 於 sub-G1 期 的 比 率 、 提 升 annexin X.
(12) V-positive 的比率，以及出現細胞核凋亡性形態特徵等結果得到驗 證，且發現此現象可能與粒線體路徑中 caspase-3 和 caspase-9 等細 胞凋亡相關性蛋白質被活化所致。此外，CMEMM 與 ATO 並用會 提高細胞內活性氧化物的生成，而當抗氧化劑如 N-acetyl cysteine (NAC), butylated hydroxytoluene 或 α-tocopherol 介入時，此細胞凋 亡現象將顯著地受到抑制，其機制與抗氧化劑如 NAC 會抑制粒線 體路徑中 caspase-3 和 caspase-9 等蛋白質有關。 綜合上述結果，本論文證實台灣藥用植物血藤之抗血癌活性及 其機制，並以合併使用血癌治療用藥三氧化二砷的效果，提供未來 臨床研究的基礎，亦開啟血癌治療上以中草藥與化療藥物並用來提 升治療效果的可能性。. XI.
(13) Abstract Mucuna macrocarpa Wallich (Leguminosae) is believed to hold blood circulation activating effects, and has been used as a folk remedy in Taiwan and Southeast Asia for the treatment of various hematologic and circulatory related ailments. The objective of this study was to investigate whether crude methanolic extract of M. macrocarpa (CMEMM) possessed antileukemic effects on human leukemia cell lines such as HL-60, Jurkat and Molt-3. CMEMM was prepared from dried stems of this plant, and its apoptosis-inducing effects were investigated using HL-60 cells in vitro and in vivo first. With treatment of 25 to 75 µg/ml CMEMM, the in vitro antiproliferative effect on HL-60 cells increased in a concentrationand time-dependent manner during the 72 h treatment period. The concentration of CMEMM that exhibited a 50% growth inhibition (IC50) for 72 h exposure was 36.4 μg/ml. Apoptosis triggered by CMEMM in HL-60 cells was confirmed by characteristic apoptotic nuclear fragmentation, concentration-dependent accumulation of sub-G1 phase in cell cycle analyses, increased percentages of annexin V-positive apoptotic cells, and concentration-dependent elevation of active caspase-3. Furthermore, the in vivo effect of tumor growth suppression by CMEMM (500 mg/kg/day i.p.) was observed in mouse xenografts. To broaden the therapeutic potential of CMEMM, further study was to examine the potential of enhancing the antileukemic activity of arsenic trioxide (ATO) using combination treatment. Human leukemia XII.
(14) cells HL-60, Jurkat and Molt-3 were treated with various doses of CMEMM, ATO and combinations thereof for 24 and 48 h. Results indicated the combination of 50 μg/ml CMEMM and 2.5 μM ATO synergistically inhibited cell proliferation in HL-60 and Jurkat cells. Apoptosis triggered by CMEMM/ATO treatment was confirmed by accumulation of cells in the sub-G1 phase in cell cycle analyses, characteristic. apoptotic. nuclear. fragmentation. and. increased. percentage of annexin V-positive apoptotic cells. Such combination treatments also led to elevation of reactive oxygen species (ROS). The anti-oxidants N-acetyl cysteine (NAC), butylated hydroxytoluene, and α-tocopherol prevented cells from CMEMM/ATO-induced apoptosis. The CMEMM/ATO-induced activation of caspase-3 and -9 can be blocked by NAC. In. conclusion,. these. CMEMM/ATO-combination. results treatment. suggest exerts. that. synergistic. apoptosis-inducing effects in human leukemic cells through a ROS-dependent. mechanism. and. antileukemic approach in the future.. XIII. may. provide. a. promising.
(15) 第一章 緒言 血癌 (leukemia) 俗稱白血病，為血液或骨髓的惡性疾病，依據民國 98 年衛生署統計資料，白血病占台灣癌症主要死因第十一位，而小兒白 血病又占小兒癌症發生率第一位，近年來發病人數有逐漸增加之趨勢 (行 政院衛生署, 2009)。急性前骨髓性白血病 (acute promyelocytic leukemia, APL) 是急性骨髓性白血病 (acute myeloid leukemia, AML) 的一種亞 型，其特徵是病患第 15 號及第 17 號染色體片段會發生交錯異位，產生 PML/RARα 重組蛋白，進而影響白血球的分化。雖然此類的病患可透過 化療藥物 anthracyclines 與分化促進劑全反式維甲酸 (all-trans retinoic acid, ATRA) 或三氧化二砷 (arsenic trioxide, ATO) 得到緩解，但 ATRA 對於幼 童常伴隨維甲酸症候群等不良反應發生，而藥物耐藥性的發生使得復發率 高達 30~40% (Burry and Seki, 2002)。因此，對於白血病仍然急需發展新 的藥物或治療方式。. 血藤 (Mucuna macrocarpa Wallich) 為豆科植物，遍布於台灣及東南 亞海拔高度100~1500公尺之山區 (Editorial Committee of the Flora of Taiwan, 1993)，民間以其乾燥莖部做為活血化瘀劑使用，用於治療貧血、 咳血、月經不調、腰膝痠痛、手腳麻木等身體血液循環不佳之症狀 (Editorial Board of Zhong Hua Ben Cao, 1999)，或用於糖尿病治療 (Lin, 1.
(16) 1992)。血藤已被報導之化學成分包括胺基酸 (amino acids)、脂肪酸 (lipids) 及三萜類 (triterpenoids)，而本實驗室先前之研究亦發現血藤莖部含有異 黃酮類 (isoflavonoids) 之活性成分 (陳亭亭, 2005; 盧冠宏, 2003)，其中 medicarpin、afrormosin、calycosin及genistein等具有抗氧化、抗菌以及抗 癌等作用。而血藤已被報導之藥理活性有利尿及解痙攣等，但有關抗癌之 活性仍未見報導。而我們初步的研究發現血藤莖部粗抽物對於人類血癌細 胞HL-60具有顯著的生長抑制，因此本研究的目的在於探討血藤抗血癌效 果的機制，以及與血癌治療用藥三氧化二砷合併使用的效果，藉此提升台 灣藥用植物之利用價值，並提供未來臨床血癌治療上，以中草藥與化療藥 物並用來提升治療效果的新思維。. 2.
(17) 第二章 總論 第一節. 血藤. 一、血藤之本草學考察 (1) 歷代諸家本草所錄之血藤植物原文 1. 經史證類大觀本草 (宋〃唐慎微, 1971) 圖經曰：「血藤，生亯州。葉如鄱蘭葉，根如大拇指，其色黃，五月 採，行血治氣塊，彼土人用之。」 (附錄 1). 2. 植物名實圖考 (清〃吳其濬, 1983) 植物名實圖考蔓草卷之二十一： 「血藤產九江山坡。蔓生勁莖，赭色， 一枝一鬚。副枝生葉，如菊花葉柔厚有花叉，而末不尖，面綠，背白。春 時枝梢開花如簇金粟，與千年健同名血藤」 。 (附錄 2). (2) 產地之考訂 (臧勵酥, 1987) 圖經： 「血藤，生亯州」。亯州即今江西上饒。 植物名實圖考： 「血藤產九江山坡」。九江即今江西九江。. 3.
(18) (3) 血藤本草系統圖 (郭啟文, 2004). 嘉祐補注本草 (唐 659AD). 圖經本草【血藤】 (宋 1602 AD). 經史證類備急本草 (宋 1098AD). 植物名實圖考【血藤】(清 1848AD). 4.
(19) 二、血藤之藥用植物學考察 (1) 血藤之植物學分類 (甘偉松, 1993) 被子植物門 Angiospermae 雙子葉綱 Dicotyledoneae 離瓣花亞綱 Choripetalae 雙花被類 Dialypetalae 薔薇目 Rosales 豆科 Leguminosae 血藤屬 Mucuna. (2) 豆科 (Leguminosae) 血藤屬 (Mucuna) 植物之特徵 (劉和義 et al., 2000) 一年生或多年生藤本，莖汁紅色。三出葉。總狀花序。花萼寬鐘形，5 齒裂，上方二面合生，最下方一片明顯較長。花瓣蝶形。莢果通常具刺毛。 台灣有 4 種，其特性分述如種檢所表。. 5.
(20) (3) 血藤屬 (Mucuna) 植物之種檢索表 (Editorial Committee of the Flora of Taiwan, 1993) 1.莖被有白色伏毛；每個莖節有 3 朵花；豆莢不平坦，白色毛狀……… ……………………………………………..…M. pruriens var. utilis 虎爪豆 1.莖被有銹色柔毛或無毛；每個莖節有 2 朵花；豆莢平坦，銹色毛狀或無 毛。 2.小葉無小托葉；豆莢長於 20 公分，沿縫線處無翼…………………… .…….…………………………………………………M. macrocarpa 血藤 2.小葉有小托葉；豆莢短於 15 公分，沿縫線處有翼。 3.頂小葉橢圓至長菱形；豆莢平滑且無毛……………………………… .....…...………………………………………M. membranacea 蘭嶼血藤 3.頂小葉卵橢圓或卵圓形；豆莢不平滑且無毛………………………… ..……..…………………………………M. gigantea ssp. tashiroi 大血藤. (4) 血藤 (M. macrocarpa) 之植物形態 (劉和義 et al., 2000) 大型木質攀緣植物，枝條被銹色柔毛。三出複葉，頂小葉橢圓形，長 12-15 cm，寬 6-7 cm，背面被毛，先端尾狀突尖。總狀花序，花軸上有 15-30 朵花，花軸可達 40 cm 長；小花柄約 2.5 cm 長；花萼約 1 cm 長； 花冠深紫色約 5 cm 長。豆莢平坦，大部分 7-15 cm 長，5 cm 寬，密被柔 毛，種子 6-12 顆。血藤植物外觀及型態特徵圖分別如附錄 3 及附錄 4。 6.
(21) (5) 血藤之基原、分佈與功用 1. 學名：Mucuna macrocarpa Wallich 2. 科名：豆科 Leguminosae 3. 別名：黑血藤、長莢油麻藤 (Editorial Board of Zhong Hua Ben Cao, 1999)，老鴉花藤、大血藤、嘿良龍 (江蘇新醫學院, 1992) 4. 分佈：台灣、廣東、海南、廣西、貴州、雲南等地 (Editorial Board of Zhong Hua Ben Cao, 1999) 5. 藥性：味苦、澀，性涼 (Editorial Board of Zhong Hua Ben Cao, 1999) 6. 效用：莖可強筋壯骨，調經補血。用於小兒麻痺後遺症，月經不調， 風濕筋骨痛 (甘偉松, 1993)。 7. 附方 (Editorial Board of Zhong Hua Ben Cao, 1999) 治小兒麻痺後遺症：血藤 60 g，研細。加粗糠炒熱，外包環跳穴或肩髃 穴，3 天換藥 1 次。 治月經不調：血藤 15 g 泡酒 500 mL。每次 10 mL，每日服 2 次。. 7.
(22) 三、血藤之藥理學考察 有關血藤 (Mucuna macrocarpa) 藥理之文獻，依據美國伊利諾大學 NAPRALERT 資料庫以及 PubMed 資料庫的搜尋結果，其民俗用法 (ethnomedical usage) 及生物活性 (biological activities) 相關文獻整理如 下： 血藤之民俗用法方面，血藤之乾燥全植物，在中國大陸地區有作為藥 物使用 (Pei, 1985)；而在台灣則是用乾燥莖部治療糖尿病 (Lin, 1992)。. 血藤之生物活性方面，有文獻指出其乾燥莖部之乙醇與水抽出物有利 尿及解痙活性。其中對大鼠以胃管給藥，劑量為 510.7 mg/kg，顯示具有 利尿活性 (Bhakuni et al., 1988)，而其他活性測試如鎮痛、抗原蟲、抗病 毒等，結果皆不具活性，詳如 Table 1 所示。. 8.
(23) 四、血藤之化學成分考察. 血藤植物之化學成分方面，透過美國伊利諾大學 NAPRALERT 資料 庫檢索，文獻中已知分離得到的成分有 l-dopa (陳勇 et al., 1993), lupenone, friedelin,. △5,22-stigmasten-3-ol,. -sitosterol,. tetracosanoic. acid. 2,3-. dihydroxypropyl ester, pentacosanoic acid 2-3-dihydroxy-propyl ester, hexacosanoic acid 2-3-dihydroxy-propyl ester (胡旺云 et al., 1994)。而本實 驗 室 先 前 的 研 究 發 現 血 藤 莖 部 含 有 tetracosanoic acid, mixture of -sitosterol and stigmasterol, medicarpin, afrormosin, genistein, calycosin, sucrose,. D-pinitol,. -sitosterol-3-O--D-glucoside,. tetracosanoic. acid. 2,3-dihydroxypropyl ester ， 而 葉 部 含 有 mixture of -sitosterol and stigmasterol, betulin, medicarpin (陳亭亭, 2005; 盧冠宏, 2003)，詳見 Table 2。. 9.
(24) 第二節. 血癌. 一、血癌的症狀 血癌的成因起源於分化不完全之不成熟血球浸潤在骨髓，使正常的白 血球數量減少，而患者由於成熟白血球驟減而易受感染，呈現發燒、畏寒 及其他類似流行性感冒的症狀，亦因為紅血球減少而容易出現貧血，臉色 蒼白、虛弱、疲倦、沒有食慾且體重減輕。又因其血小板量不足而容易造 成出血、瘀青、牙齦腫脹等現象。此外，尚有脾臟腫大、骨頭或關節疼痛 以及個體活動力降低等病症出現 (Groves et al., 1994)。. 二、 血癌的分類 血癌依細胞的來源及形態特徵，在臨床上可分為骨髓性及淋巴性兩大 類，而依病程進展的快慢又可分為急性及慢性，各種類型詳述如下： (1) 急性骨髓性白血病 (Acute myelocytic leukemia, AML) 好發於成年人，約有80%的病人超過25歲。急性骨髓性白血病在細胞 型態學上可依據French-American-British (FAB) co-operative group的分類 標準 (FAB classification)，再細分為M1到M7型，其中M1型是「急性未成 熟骨髓芽球性白血病」(myeloblasts without maturation)，M2型是「急性成 熟骨髓芽球性白血病」(myeloblasts with maturation)，M3型是「急性多顆 10.
(25) 粒前骨髓細胞性白血病」(hypergranular promyelocytic leukemia)，M4型是 「急性骨髓單核球性白血病」(myelomonocytic leukemia)，M5型是「急性 單核球性白血病」(monocytic leukemia)，並且分為不成熟型M5a (poorly differentiated monocytic leukemia) 及 成 熟 型 M5b (well differentiated monocytic leukemia) 兩 種 亞 型 ， M6 型 是 「 急 性 紅 血 球 性 白 血 病 」 (erythroleukemia)，而M7型是「急性巨核細胞性白血病」(megakaryocytic leukemia)。. (2) 慢性骨髓性白血病 (Chronic myelocytic leukemia, CML) 與費城染色體 (Philadelphia chromosome) 的異常有關，好發於20歲到 45歲的成年人 (Wong and Witte, 2001)。. (3) 急性淋巴球性白血病 (Acute lymphocytic leukemia, ALL) 好發於兒童，急性淋巴球性白血病依癌細胞形態特徵，又可再分為L1, L2, L3型，其中L1及L2型分別為小型及大型的lymphoblast，且都以T細胞 為主，但L3型則為B細胞 (Pui, 1997)。. (4) 慢性淋巴球性白血病 (Chronic lymphocytic leukemia, CLL) 好發於50 歲以上的老年人。淋巴球可分為B細胞及T細胞淋巴球，故 可再分為慢性B淋巴球性白血病以及慢性T淋巴球性白血病。. 11.
(26) 三、血癌的治療與進展 有關癌症的治療，於二十世紀主要是以外科手術、放射線治療及化學 治療為主，但常因嚴重的副作用使得治療的效果不彰，使得癌症無法有效 的根治，因而陸續有免疫療法、賀爾蒙療法或基因療法等出現。然而，急 性白血病在目前臨床上的治療，仍以化學療法為主，待病情轉緩，才可以 進行骨髓移植或放射線療法。由於化學療法毒性太大且疾病復發機會大， 常常在治療上無法獲得很大的功效，讓病人不易接受。因此，如何提供有 效且不具毒性的治療方法仍是醫學界面臨的重要課題，而目前可供選擇的 治療方式如下 (陳長安 及 謝瑞坤, 2009; 陳博明, 1999)：. (1) 化學治療 以化學藥物來治療癌症簡稱「化療」。化療可使用一種化學藥物或結 合多種藥物來進行。目前治療白血病的化療藥物很多，依白血病種類用藥 的差異性又可分為：. 1. 急性骨髓性白血病 急性前骨髓性白血病屬於急性骨髓性白血病第三型 (AML-M3)，目前 使用口服的ATRA (all-trans retinoic acid) 可透過在RAR (retinoic acid receptor) 的作用，促進血癌細胞進行分化，雖然治療效果顯著，但也容 易產生抗藥性或造成身體嚴重不適 (Cornic and Chomienne, 1995)。而其它 12.
(27) 6型 (M1, M2, M4, M5, M6及M7) 之急性骨髓性白血病，均可使用 1-β-arabinofuranosylcytosine (Ara-C) 加上daunorubicin來治療，約70％可達 緩解效果。. 2. 慢性骨髓性白血病 以Ara-C加上daunorubicin為主，再配合干擾素的使用，可得緩解。而高 劑量的化治合併骨髓移植是唯一可以根治的療法。. 3. 急性淋巴性白血病 一般使用的藥物包括Ara-C, daunorubicin, vincristine, cyclosporphamide, L-asparaginase, methptrecate及prednisolone。當疾病緩解後，考慮鞏固性的 化學治療，以口服化療藥物進行維持性治療。然而，急性淋巴性白血病通 常會亰犯至中樞神經系統，所以必頇加上頭部的放射線治療及骨髓腔內的 化學治療。. 4. 慢性淋巴性白血病 早期沒有特殊症狀並不需要急於治療，而當症狀出現後，再考慮給予 Ara-C, daunorubicin, vincristine, cyclosporphamide及prednisolone等藥物治 療。. (2) 放射線治療 13.
(28) 又稱「放射療法」，常與化學治療一起使用，對大多數癌症均具有療 效，可使惡性腫瘤縮小，或摧毀手術後殘餘的癌細胞。但高能量的放射線 在摧毀癌細胞時，也同樣會傷害身體的正常細胞，此為放射治療過程中極 為嚴重的副作用。此外，還包括：疲倦、皮膟發癢、皮膟乾燥、掉髮、噁 心腹瀉、白血球及血小板數降低等副作用。白血病的放射線治療，主要有 兩種給予方式，對於有癌細胞聚集的部位，例如腦部或脾臟，可直接給予 放射治療；而其餘的病人則是接受全身放射線治療，且通常在骨髓移植之 前給予。. (3) 骨髓移植 骨髓移植是將他人或自己身上健康的骨髓移植到功能受損的骨髓中。 白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、睪丸癌或乳癌等，都可以 接受骨髓移植的治療。骨髓移植的類型包括：. 1. 自體骨髓移植 由病人本身未受癌細胞亰犯的骨髓抽出，儲存在零下196℃液態氮中， 待病人癌症發作時，給予治療。. 2. 異體骨髓移植 將他人得來的骨髓輸入癌症病患體內，而提供骨髓者以同卵雙胞胎， 或組織抗原相符的家人尤佳。近年來，因為骨髓資料庫的建立，提供沒有 14.
(29) 適當骨髓來源者很好的治療機會，若捐贈者與病患的human leukocyte antigen比對一致，則骨髓移植排斥的機會大為降低，移植成功的機率也相 對提高。. 15.
(30) 第三節. 細胞凋亡. 一、細胞凋亡的定義 細胞凋亡 (apoptosis) 是一種細胞計畫性死亡的過程 (programmed dell death)，和細胞增殖一樣都屬生命基本現象，是維持體内細胞數量動 態平衡的基本措施，但也在許多疾病的發展上扮演著重要的角色，特別是 癌症 (Thompson, 1995)。Apoptosis 一詞源自於希臘文，原本字意是指樹 葉凋落或掉落，有 “墮落、死亡” 之意，而在拉丁文中 “apopto-“ 是枯萎、 凋零之意，因而用來表示細胞進行 apoptosis 時的型態，意指細胞死亡。 細胞凋亡的進行源自於細胞內在基因表現的調控，當正常細胞受到傷害或 發生基因突變時，會引起細胞凋亡的機轉，讓細胞自行死亡 (Reed, 1999)。在多細胞有機生物裡，細胞凋亡扮演著調節及維持細胞數目的重 要角色，而生物體之恆定也仰賴細胞凋亡與細胞增生間的平衡來控制 (Raff et al., 1993)。因此，若細胞凋亡程式受到抑制或其中調控的基因受 損，將會使細胞無法走向計畫性死亡，導致細胞循著錯誤的訊息繁衍下 去，最終造成細胞不正常增殖甚至癌化的發生。. 二、細胞凋亡與細胞壞死 細胞凋亡的發生包含著特定的生物反應變化，其過程主要可以分為凋 16.
(31) 亡早期及晚期兩個階段。在凋亡早期，細胞外型會有變化、細胞膜內層的 磷脂質 (phosphatidylserine) 會外翻 (Fadok et al., 1992)、染色質濃縮，且 細胞開始萎縮。而細胞凋亡晚期時，特徵性的變化主要在於細胞核，如細 胞核皺縮、DNA 斷裂，並出現被細胞膜包覆的凋亡小體 (apoptotic body)。 而後巨噬細胞會來吞噬這些雕亡小體，但卻不會產生發炎反應。. 而細胞壞死 (necrosis) 是當細胞受到物理性、化學性或是嚴重病理性 刺激時的生理反應，一開始細胞會因大量水分進入而腫脹，接著引起發炎 反應並導致細胞破裂，而細胞內破碎的胞器及染色質片段會隨著細胞液外 流，並釋出發炎因子，而這也造成周圍的細胞開始產生發炎反應。因此， 若以誘導細胞凋亡的方式來治療癌症，將可減少藥物所引發的副作用甚至 併發症，所以一般認為細胞凋亡是一種較佳的抗癌機制 (Matsuda et al., 1996)。. 三、細胞凋亡的調控機轉 細胞凋亡的分子傳遞路徑主要可分為內在路徑－粒線體路徑 (mitochondrial pathway) 以及外在路徑－死亡受體路徑 (death receptor pathway) 兩種，兩種路徑的訊息傳遞詳述如下 (附錄 5)：. (1) 內在路徑－粒線體路徑 17.
(32) 當細胞受到藥物、放射性輻射、氧氣不足等刺激，或是 DNA 損傷時， 首先細胞質的粒線體膜電位會下降，位於粒線體外層的 Bcl-2 會調控細胞 的存活，而 cytochrome c 會由粒線體膜間隙釋放至細胞質中，與 Apaf-1 及 pro-caspase-9 結合並刺激 apoptosome 的形成，之後 ATP 會活化 caspase-9 並促使下游的 caspase 活化，最後導致細胞凋亡 (Parone et al., 2002; Shi, 2001)。. 1. Caspase家族蛋白 Caspase (cysteine aspartyl-specific protease) 是一種具有專一性且有 cysteine活化態殘基的蛋白酶，可在標的蛋白N端的aspartate殘基與C端的 small hydrophobic residue間切割而變成活化態。未活化的caspase有三個主 要domain：amino-terminal prodomain、small subunit (10-12 KDa)以及 large subunit (17-20 KDa)。這些未活化Caspase 需要其他的Caspase進行特定的 蛋白分解作用，使這些domain形成活化態。未活化的caspase可分為兩類， 一種是initiator caspase，例如caspase-2, -8, -9, -10，可啟動活化apoptotic executioners，使其能執行apoptosis，稱為promoter；另一種effector caspase， 例如caspase-3, -6, -7，其功能為執行細胞凋亡，裂解下游蛋白 (Shi, 2002)。. 當細胞凋亡發生時，在粒線體路徑中會有特定訊息，如cytochrome c 釋出與Apaf-1結合，會傳遞給caspase-9使其活化，接著再活化下游的 18.
(33) caspase-3, -6, -7，造成膜蛋白分解，並使具修復DNA作用的PARP裂解而 失 去 修 復 功 能 。 另 外 ， caspase 也 切 除 inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease (ICAD) 釋出CAD導致DNA fragmentation，誘導走向細 胞凋亡 (Ashe and Berry, 2003)。. 2. Bcl-2家族蛋白 Bcl-2家族蛋白主要可分為促使凋亡蛋白分子 (pro-apoptotic protein) 及抑制凋亡蛋白分子 (anti-apoptotic protein) 兩類 (Reed, 1998) ，在細胞 凋亡中扮演著細胞存活調控的重要角色。促使凋亡蛋白分子的成員有Bad, Bak, Bax, Bid, Bik, Bim, Blk, Bok及Bcl-Xs等，若大量表現會促進細胞凋 亡；而抑制凋亡蛋白的成員有Bcl-xL, Bcl-2, Bcl-w, Boo, Mcl-1, A1/Bfl-1， 若表現過量時會阻斷各種不同壓力所誘發的細胞凋亡 (Reed et al., 1998)。. Bcl-2家族這兩大類的蛋白結構相當類似，皆含有四個類似的 Bcl homology domain (BH1, 2, 3, 4)，彼此以同質二元體 (homodimer) 或異質 二 元 體 (heterodimer) 形 式 結 合 來 調 控 細 胞 凋 亡 (Jurgensmeier et al., 1998)。抑制凋亡蛋白如Bcl-2，正常狀態是位在粒線體膜上、核膜上或內 質網膜上；而促使凋亡蛋白Bax, Bad和Bid等則是在細胞質中，當接收到 凋亡訊息傳遞時，就會轉位 (translocation) 至粒線體膜上，改變粒線體膜 電位，造成膜的通透性改變 (Kroemer and Reed, 2000)。其他促使凋亡蛋 19.
(34) 白表現時，Bax的結構會改變，使Bax利於結合到粒線體外膜上，進行傳 遞凋亡訊號。再者是Bid被Caspase-8活化裂解成tBid，而tBid會結合在粒線 體膜上。另外，Bad受到凋亡訊息刺激，則產生去磷酸化，使Bad移至粒 線 體 上 。 以 上 作 用 會 促 使 粒 線 體 膜 內 的 蛋 白 ， 像 是 cytochrome c 、 Smac/DIABLO 等 釋 放 至 細 胞 質 (Kroemer et al., 1995) 。 而 apoptosis inducing factor (AIF)、endonuclease G會直接進入細胞核，促進apoptosis 的作用。因此Bcl-2家族蛋白扮演著channel protein的角色在粒線體膜上穿 梭 (Wood and Newcomb, 2000)。. 3. 細胞凋亡誘導因子 (AIF) AIF屬於caspase-independent cell death effector，其分子量約57 KDa， 存在粒線體內膜中，具有抑制Bcl-2的能力 (Kannan and Jain., 2000)。當粒 線體的通道發生變化時，會從粒線體膜間隙釋出，經過細胞質之後到核 膜，然後誘導染色質濃縮，最後產生50 Kb之DNA片段 (Kannan and Jain, 2000)。. 4. 內核酸酶 (endonuclease G) Endonuclease G具有多種生理活性，包括DNA修補及粒線體DNA複製 等，同時也具有核酸酶 (nuclease) 的功能，可參與細胞凋亡。Endonuclease G被活化後會由粒線體膜間隙進行轉位進入細胞核，執行核酸酶的功能， 20.
(35) 將DNA分解 (Miller et al., 1999)。. (2) 外在路徑－死亡受體路徑 1. Fas (CD95) /FasL Fas 是 細 胞 表 面 的 醣 基 化 穿 膜 蛋 白 ， 屬 於 腫 瘤 壞 死 因 子 (tumor necrosis factor, TNF ) receptor superfamily中的第一型膜蛋白，分子量約45 KDa。而FasL (Fas ligand) 是第二型膜蛋白，分子量約40 KDa，可維持細 胞與B細胞的平衡，並清除有害細胞如發炎細胞或其他癌化細胞。當Fas 與 FasL結合時，會使細胞內引發一系列的訊息傳遞 ，吸引細胞內的 Fas-associated death domain (FADD) 過來與細胞質中的death domain (DD) 結合，之後啟動凋亡訊號傳遞，活化下游因子caspase-8，活化態的caspase-8 經由一連串的過程會活化下游的caspase-3與capsase-7，或是使Bcl-2家族中 的Bid裂解成為tBid，而促使cytochrome c活化caspase-9和caspase-3。. (2) Tumor necrosis factor receptor-1 (TNFR1) TNF是由感染反應活化的T cell與macrophage所製造出來的，其接受器 為TNFR1及TNFR2。當TNF與TNFR1結合時，會吸引TNFR-associated death domain (TRADD) 與receptor domain結合，並活化下游因子caspase-8 而導 致細胞凋亡。另外，TNF也可與TNFR2結合，啟動免疫反應使 receptor interacting protein (RIP) 與TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) 的結 21.
(36) 合，進而活化NF-κB促使細胞存活。. 四、活性氧化物與細胞凋亡 ROS (例如 superoxide 或是 hydrogen peroxide) 在細胞裡是屬於會產 生毒性的代謝產物，雖然適量的 ROS 不具毒性且參與訊息的傳導，但 ROS 過度生成或蓄積將會對細胞內的蛋白質或核酸產生傷害。然而，細胞體內 也 有 代 謝 ROS 的 機 制 ， 例 如 GSH (glutathione), SOD (superoxidase dismutase), GPx (glautathione peroxidase) 及 catalase 均對 ROS 的代謝扮演 著重要的角色，也藉此維持細胞內 ROS 的平衡 (Chang et al., 2009; D'Autreaux and Toledano, 2007)。而過去的研究指出，若癌細胞中 ROS 過 度增加將會導致細胞凋亡的產生，例如：過量的過氧化氫會使粒線體膜電 位發生改變、cytochrome c 從粒線體被釋出，而後活化下游的 caspase，最 終導致細胞凋亡，因此經由 ROS 路徑來誘導癌細胞走向細胞凋亡，已是 普遍認同的抗癌機制 (Simon et al., 2000)。. 22.
(37) 第四節. 三氧化二砷. 一、砷化物的醫療史 砷 (arsenic) 為自然界中的元素，常以硫化物、氧化物或砷酸鹽類 (arsenate) 的形式存在，而砷化物又可分為有機砷及無機砷，有機砷係三 價或五價砷與碳原子結合，而無機砷主要有雄黃 (realgar, As2S2, red)、雌 黃 (orpiment, As2S3, yellow) 及三氧化二砷 (arsenic trioxide, As2O3, white) 等三種，其中雄黃和雌黃屬於有毒且化性不穩定的化合物，而三氧化二砷 則是炙燒硫化砷的產物，也是中藥砒霜的主要成分 (Evens et al., 2004)。. 據文獻記載，砷化物做為醫藥使用已超過兩千四百年，而在當時砷 就已經被認為同時具有藥物及毒藥兩種不同的性質。在砷的醫療歷史上， 最早開始為希臘人Hippocrates以硫化砷來治療皮膟潰瘍，而後砷被廣泛應 用在各種疾病上，包括用於治療瘧疾、鎮靜劑、發汗劑、抗牛皮癬、抗氣 喘和抗癌等不同疾病上 (Zhu et al., 2002)。西元1970年，在中國的人體試 驗中發現命名為癌靈1號 (Ailing-1) 的三氧化二砷溶液中 (1 mg/ml As2O3 與0.01 mg/ml Hg2Cl2)，對於急性前骨髓細胞白血病 (APL) 的病人有非常 好的療效。臨床研究也證實不管是復發性或者是對其它化學治療效果不好 的APL病人，三氧化二砷都可以得到不錯的治療效果。因此在西元2000 ®. 年美國食品藥物管制局 (FDA) 核准了商品化的三氧化二砷 (Trisenox ) 23.
(38) (Cohen et al., 2001)，用於治療復發型或者是對於all-trans retinoic acid和 anthracycline有抗藥性的APL病人。. 二、三氧化二砷在癌症治療的作用機制 三氧化二砷的抗癌機轉尚未完全明瞭，但至今已知三氧化二砷可以藉 由下列幾種路徑達到療效： (1) 使PML-RARα融合蛋白分解 部分APL病人的白血球細胞會表現此種融合蛋白，此融合蛋白會阻止 骨髓細胞正常分化的基因表現，並抑制細胞的死亡，造成分化不正常的細 胞增生。據文獻報導，三氧化二砷可以促進PML-RARα fusion protein進入 nuclear body內分解，促使細胞進行分化而達到治療效果 (Zhu et al., 2002)。. (2) 抑制細胞週期的進行 細胞週期的進行可分為G1, S, G2, M四個階段，正常細胞都必頇先做完 每一階段的工作且沒有錯誤才可以通過管制點 (checkpoint) 進入下一階 段，而癌細胞異於正常細胞的地方，就在於不斷的增生複製卻又難以進行 分化。有研究顯示三氧化二砷會增加cyclin B的表現，導致細胞週期停在 G2/M階段，進而使細胞增生受到抑制 (Choi et al., 2002)。. 24.
(39) (3) 誘導細胞凋亡 三氧化二砷可以藉由增加細胞內的過氧化氫，造成粒線體內膜電位差 改變，促使cytochrome c釋出，進一步活化下游caspase的活性，最後導致 細胞凋亡。除此之外，文獻指出三氧化二砷誘導細胞凋亡的效果和細胞內 glutathione (GSH) 的 多 寡 有 密 切 的 關 係 。 實 驗 發 現 當 利 用 buthionine sulfoximine (BSO) 降低細胞內GSH量的時候，三氧化二砷的誘導細胞凋 亡的作用大幅地提高。反之，給予N-acetyl cysteine (NAC，為GSH的前驅 物) 時，三氧化二砷的作用則明顯受到抑制 (Miller et al., 2002)。此外陸 續有學者發現，細胞內GSH量較低的時候，蓄積在細胞內的砷濃度就較 高，這是因為GSH可以和三價砷結合而排出細胞外，因此當細胞內GSH 量較高的時候，會造成三價砷在細胞內的濃度較低，而使得三氧化二砷的 效果降低 (Leslie et al., 2004; Salerno et al., 2002)。. 25.
(40) 第三章 實驗設計 第一節 研究目的 本研究之目的在於探討血藤抗血癌效果的機制，以及與血癌治療用藥 三氧化二砷合併使用的效果，藉此提升台灣藥用植物之利用價值。. 第二節 實驗架構 本研究首先進行血藤植物之本草學、藥用植物學、藥理學及化學成分 等文獻考察，取得經基原確認之植物後進行切片、陰乾及萃取等程序，製 備成血藤莖部粗抽物，接著利用 HL-60 人類血癌細胞株，測試經血藤莖 部粗抽物處理後之細胞生長、細胞週期以及細胞凋亡等相關 in vitro 試 驗，並利用裸鼠進行 in vivo 活性評估。. 之後再將血藤莖部粗抽物與三氧化二砷合併用於 HL-60, Jurkat 及 Molt-3 等人類血癌細胞株，測試藥物合併使用的抗血癌效果，並分析藥物 交互作用的形式為協同、加成或是拮抗作用，最後利用活性氧化物分析及 西方墨點法，探討藥物合併使用的可能機制。血藤抗血癌活性評估的實驗 架構圖如 Figure 1 所示。. 26.
(41) 第四章 實驗材料與方法. 第一節. 實驗材料. 一、試劑 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) , Cat. No. D9564, 購自 Sigma (St. Louis, MO, USA) Arsenic trioxide , Cat. No. A1010, 購自 Sigma (St. Louis, MO, USA) Acetic acid, Cat. No. 1.01830, 購自 Merck (Darmstadt, Germany) Active Caspase-3 FITC Mab Apoptosis Kit, Cat. No. 550480 , 購自 BD Pharmingen (San Diego, CA, USA). ANNEX100F Kit (annexin V: FITC assay kit), 購 自 AbD Serotec (Kidlington, UK). BCA kit, Cat. No.23227 , 購自 PIERCE (Rockford, IL, USA) Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit, Cat. No. 340242, 購自 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) Dihydroethidium (DHE), Cat. No. D7008, 購自 Sigma (St. Louis, MO, USA) Dimethyl sulfoxide (DMSO), Cat. No. D2650, 購自 Sigma (St. Louis, MO, USA) Enhanced chemiluminescent (ECL) detection reagent, 購自 PerkinElmer (Waltham, MA, USA) Ethidium bromide (EtBr), Cat. No. E7637 , 購自 Sigma (St. Louis, MO, 27.
(42) USA) Fetal bovine serum (FBS), Cat. No. 16170-078, 購自 Gibco (Grand Island, NY, USA) Gentamycin, Cat. No. 15750-078, 購自 Gibco (Grand Island, NY, USA) M-PER mammalian protein extraction reagent, Cat. No. 78501, 購自 PIERCE (Rockford, IL, USA) Methanol, Cat. No. 1.07018, 購自 Merck (Darmstadt, Germany). N-acetyl cysteine , Cat. No. A9165, 購自 Sigma (St. Louis, MO, USA) Phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4), Cat. No. 70011, 購自 Gibco (Grand Island, NY, USA) Protease inhibitors cocktail, Cat. No. 539134, 購 自 Calbiochem (Darmstadt, Germany) RPMI-1640 medium, Cat. No. 31800-022, 購自 Gibco (Grand Island, NY, USA) Trypan blue dye solution, Cat. No. 15250-061, 購自 Gibco (Grand Island, NY, USA) z-VAD-fmk, Cat. No. 219007, 購自 Calbiochem (Darmstadt, Germany). 二、抗體 Mouse monoclonal antibody against caspase-3, 購 自 Imgenex (San Diego, CA, USA) Rabbit polyclonal antibodies against caspase-9, 購自 Imgenex (San Diego, CA, USA) Rabbit polyclonal antibodies against β-actin, 購自 Sigma (St. Louis, MO, 28.
(43) USA) Rabbit polyclonal antibodies against poly-ADP ribose polymerase (PARP), 購自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). 三、細胞株 人類血癌細胞株 HL-60 (acute promyelocytic leukemia), Jurkat (acute T-lymphoblastic leukemia), Molt-3 (acute T-lymphoblastic leukemia) 購 自 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). 四、實驗動物 雄性裸鼠 (BALB/c nude mice) , 購自國家實驗動物中心 (Taiwan). 五、儀器設備 Cytospin (Shandon Cytospin Cytocentrifuge, Cheshire, UK) XBridge RP-18 endcapped column (5 mm pore size, 250 × 4.6 mm, inner diameter, Waters, USA) Syringe Filter 0.45 μm pore size (PVDF, MILLIPORE, USA) Waters Alliance 2695 separations module (Waters, USA) Waters 996 photodiode array Detector (Waters, USA) 水浴槽 (Kansin Instruments, Taiwan) 超音波震盪器 (Model 3200, Branson, USA) 培養箱 (Model 370, Thermo Forma, USA) 29.
(44) 無菌操作台 (造鑫, Taiwan) 迴轉式大型減壓濃縮機 (Rotavapor R-153DW, Buchi, Switzerland) 迴轉式小型減壓濃縮機 (Rotavapor R200 Series, Buchi, Switzerland) 真空控制器組 (VC-7600/VP-60D, Panchum, Taiwan) 恆溫冷卻循環裝置 (CA-1100, Eyela, Japan) 冷卻循環機 (CC-3000, Panchum, Taiwan) 無油式真空幫浦 (VP-60D, 泛群科技有限公司, Taiwan) 溶劑過濾器組 (HPLC Filtration System, MILLIPORE, USA) 超純水製造機 (TK-5/FM-120D/ZROS6016Y/ZMQS600, Millipore Milli-Q, USA) 電子分析天平 (Toledo AT201, Mettler, Switzerland) 流式細胞儀 (FACScan, Becton Dickinson, USA). 30.
(45) 第二節 實驗方法 一、植物材料之採集 本研究之植物材料血藤 (Mucuna macrocarpa) 係經本實驗室張永勳 老師 (本校藥學院中國藥學暨中藥資源學系教授) 協助採集及鑑定。血藤 植物於民國 95 年 7 月採集於台灣南投縣魚池鄉，並參照台灣維管束植物 簡誌及中華本草等相關書籍比對所採集植物之外部型態，而確認其基原， 藥材樣本並儲存於本實驗室。. 二、血藤莖部粗抽物之製備 淨選採集之血藤植物以留下藤莖的部分，以切片機將莖部切成約 3 mm 厚度之薄片，於通風的環境下室溫陰乾一週後，將藥材移至不鏽鋼 桶中以 methanol 浸泡 48 小時，取出萃取液並加入新的 methanol 再次浸 泡，相同的浸泡時間後，再重複上述動作，一共進行 3 次。將所有萃取液 以濾紙過濾後合併，所得濾液在 40℃下以減壓濃縮機濃縮至乾，之後移 至凍晶乾燥機處理 24 小時，即得血藤莖部甲醇粗抽物 (Crude methanolic extract of the stems of Mucuna macrocarpa, CMEMM)，並置於-20℃冰箱中 貯藏。陰乾後之血藤重 1.09 kg，經甲醇萃取濃縮後萃取物重 151 g，故萃 取率約 13.9% 31.
(46) 三、高效液相層析法 此項實驗係以血藤已知之活性成分 calycosin、afrormosin、genistein 及 medicarpin 等異黃酮類化合物做為指標成分，進行高效液相層析法分 析。層析條件的探索係以上述 4 個活性成分為標準品來進行，先將標準品 及檢品 (CMEMM) 溶於 methanol 或 DMSO，並分別配製為 0.1 mg/ml 及 10 mg/ml 之濃度，再以 0.45 μm 濾膜過濾，然後注入 20 μl 至高效液相層 析儀 (Waters Alliance 2695 separations module 及 Waters 996 photodiode array Detector) 進行分析。層析管柱以使用 XBridge RP-18 endcapped column (5 mm pore size, 250 × 4.6 mm, inner diameter)，移動相 (mobile phase) 沖提方式為等度沖提 (isocratic)，而為取得最佳之層析分離效果， 逐一測試不同之移動相溶媒比例、檢測波長、流速及層析時間等層析條件 組合，如 Table 3。. 四、細胞培養 (1) 培養液的配製 將 9.5 g 之 RPMI-1640 粉狀培養基溶於約 900 ml 二次水中，加入 2 g sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)，攪拌混合均勻，調整 pH 至 7.2 到 7.4 之間，然後加二次水使容量成為 1 升，再利用 pump 將此溶液以 0.22 μm 32.
(47) 無菌濾膜過濾，最後添加 10% fetal bovine serum (FBS) 及 0.01 mg/ml gentamycin，此溶液即為 RPMI-1640 培養液。. (2) 細胞株及培養條件 人類急性骨髓血癌細胞 HL-60 以及人類急性淋巴血癌細胞 Jurkat 和 Molt-3，皆使用 RPMI-1640 培養液培養於恆溫 37°C 並含 5% CO2 與過濾 空氣之潮濕培養箱中。. (3) 繼代培養 培養過程使細胞密度維持在 0.2~1 × 106 cells/ml。當細胞密度超過此 範圍時進行繼代培養，步驟為將含有細胞之培養液收集至離心管中，以 1200 rpm (270 ×g) 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，再將細胞打散加入 新鮮培養液中繼續培養。. (4) 細胞計數 將含有細胞之培養液移至離心管，以 1200 rpm (270 ×g) 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，再將細胞打散加入新鮮培養液，取出適量體積 (10~20 μl) 與等體積之 trypan blue 混合均勻，然後取 10 μl 之混合液注入血球計 數器 (hemocytometer)，蓋上蓋玻片再移至顯微鏡下計數。以手持計數器 的方式，目視記錄下圖所示血球計數器四個角落之細胞總數 (N)，由於每 個角落為邊長 1 mm 之正方形，而蓋上蓋玻片會形成厚度為 0.1 mm 的空 33.
(48) 間，故可代入下列公式計算細胞密度。. 1. 2. 4. 3. 細胞密度 (cells/ml) = N / 4 × 2 × 104. (5) 冷凍細胞 冷凍細胞前先確認細胞生長狀況良好再開始進行。首先配製冷凍保護 液，將 RPMI-1640 培養液及 dimethyl sulfoxide (DMSO) 以 9 : 1 的比例混 勻備用。將含有細胞之培養液收集至離心管中，以 1200 rpm (270 ×g) 室 溫下離心 5 分鐘，移除上清液，再將細胞打散加入冷凍保護液，使細胞密 度為 1~5 × 106 cells/ml，以 1 ml 為單位分裝至冷凍小管中，然後將冷凍 小管放入裝有 isopropanol (IPA) 並已預先回溫至室溫之漸凍盒中，移至 -80℃冰箱至少 4 小時後，最後將冷凍小管取出保存於液態氮中。. (6) 解凍細胞 將冷凍小管由液態氮桶中取出後，迅速移至 37°C 的水浴槽中急速解 凍約 30 秒，將含有細胞之冷凍保護液吸至已含有培養液的離心管中稀 釋，以 1200 rpm (270 ×g) 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，再將細胞打 34.
(49) 散加入新鮮 RPMI-1640 培養液培養。. 五、 藥物處理 精確稱取 75 mg 之 CMEMM 於 1.5 ml eppendorf 中，加入 1 ml DMSO 後，移至超音波震盪器震盪 1~2 小時使粉末完全溶解，此為 CMEMM 母 液 (stock solution)，儲存於零下 20℃。另精確稱取 1.98 mg 之 arsenic trioxide (ATO) 於 1.5 ml eppendorf 中，加入 1 ml 0.1 N NaOH 後，以 vortex 震搖使粉末完全溶解，此為 ATO 母液，儲存於-20℃。依據不同實驗設計， 使用前再以新鮮培養液稀釋至所需濃度進行，各濃度之 CMEMM 藥液 (25, 50 or 75 μg/ml) 所含 DMSO 皆不高於 0.1%，而各濃度之 ATO 藥液 (2.5 or 5 μM) 所含 NaOH 則不高於 5 × 10-5 N。將 HL-60, Jurkat 和 Molt-3 細胞 置換為各濃度 CMEMM 或 ATO 藥液後，以 1 × 105 cells/ml 細胞密度移 回培養箱繼續培養，在不同時間點 (24, 48 or 72 h) 收集細胞進行分析， 並以只處理 0.1% DMSO 者為對照組。. 六、細胞生長試驗 細胞生長之測定以錐蟲藍排除法 (trypan blue exclusion assay) 進 行，試驗原理為 trypan blue 染劑可將細胞膜已受損之細胞染成藍色，故透 過細胞計數的方式，經由顯微鏡下觀察所見藍色細胞為死細胞；反之，細 35.
(50) 胞膜完整之健康細胞不會被 trypan blue 染劑所穿透，經由顯微鏡下觀察 不被染色者為活細胞。. 將藥物處理過之細胞，分別於 24、48 或 72 小時後收集至離心管中， 以 1200 rpm (270 ×g) 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，拍散細胞並加入 1 ml PBS (1X) 將細胞混勻。取等量之細胞懸浮液與 0.4% trypan blue solution 充分混合，取 10 μl 加入血球計數器中，移至顯微鏡下觀察，死細 胞呈現藍色，而活細胞會呈透明，可分別計算活細胞及死細胞之總數量及 細胞存活率。. 七、細胞週期分析 細胞週期分析係以 propidium iodide (PI) 對細胞之 DNA 進行螢光染 色，再利用流式細胞儀進行分析。試驗原理為細胞週期正常運作時，DNA 含量會發生週期性的變化，G2 期的 DNA 含量為 G1 期的 2 倍，S 期的 DNA 含量則居於兩者之間，而若細胞進行凋亡反應時，DNA 斷裂後產生的亞 二倍體 (hypodiploid) 則會增加，故 sub-G1 期可視為細胞凋亡的一種象 徵。由於 PI 是一種會與 DNA 雙股螺旋上氫鍵結合的核酸染劑，當 PI 被 偵測到的訊號愈強時，即代表 DNA 的含量愈多，因此可藉由分析 sub-G1 期或細胞週期各時期之 DNA 百分比，來觀察藥物對細胞週期的影響。. 36.
(51) 本實驗係以 Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit，依照 Becton Dickinson 廠商提供之實驗步驟進行染色。將藥物處理過之細胞，分別於 24、48 或 72 小時後收集至流式細胞儀專用試管 (Falcon cat. 352054) 中， 以 300 ×g 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，拍散細胞，再以 1 ml Buffer Solution (主要含 sucrose，trisodium citrate 以及 DMSO，貯存及 wash 細胞 用) wash 兩次，回溶於 1 ml Buffer Solution。然後改以 400 ×g 室溫下離 心 5 分鐘，移除上清液，加入 250 μl Solution A (含有 trypsin 的 spermine tetrahydrochloride detergent buffer，用於 digest 細胞膜及細胞骨架)，以手 輕拍混勻，室溫下靜置 10 分鐘。再加入 200 μl Solution B (含有 trypsin inhibitor 及 RNAase 的 citrate buffer，用中止 trypsin 反應及 digest RNA)， 以手輕拍混勻，室溫下靜置 10 分鐘，再加入 200 μl Solution C (含有 PI 及 spermine tetrahydrochloride 的 citrate stabilizing buffer，用於 DNA 螢光 染色)，以手輕拍混勻，將樣品移至冰上，避光靜置 10 分鐘後，以 FACScan 流式細胞儀分析。FACScan 係利用 argon ion laser (15 mV) 波長 488 nm 光 束射向細胞，並透過波長 585 nm 之濾片收集 PI 被激發後所產生的紅色螢 光訊號，最後以 CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 與 ModFit (Verity Software House, Topsham, ME, USA) 兩套軟體來分析結果 兩套軟體來分析結果。. 八、細胞核染色法 37.
(52) 將藥物處理過之細胞，分別於 24、48 或 72 小時後收集至離心管中， 以 PBS (1X) wash 兩次後，利用 Cytospin 離心機將細胞固定於玻片上， 滴入適量 (約 30~50 μl) 之 methanol/acetic acid (3/1, V/V) 混合液或 10 % formalin solution 為固定液，待風乾後，滴入適量 (約 30~50 μl) EtBr 或 DAPI 進行細胞核染色，再用封片膞將蓋玻片與載玻片黏合，利用螢光顯 微鏡鏡檢。. 九、Annexin V-FITC / PI 雙染色法 在正常細胞中，磷脂絲胺酸 (phosphatidylserine, PS) 只分布在細胞膜 脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂絲氨酸會由脂膜內 側翻向外側。而 annexin V 是一種 Ca2＋依賴性的磷脂結合蛋白，其與磷脂 絲氨酸有高度親和力，可透過細胞外側暴露的磷脂絲氨酸與凋亡早期細胞 的胞膜結合，因此 annexin. V 可作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標，以. 具有 FITC 螢光素標記之 annexin V 作為探針，可透過流式細胞儀檢測細 胞凋亡的發生。另外，利用 PI 不會通過完整細胞膜的特性，同時進行雙 染色則可進一步區分活細胞與死細胞，因此 annexin. V-FITC / PI 雙染色. 法可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。. 本實驗係以 ANNEX100F Kit (annexin V: FITC assay kit)，依照 AbD 38.
(53) Serotec 廠商提供之實驗步驟進行染色。將藥物處理過之細胞，分別於 24、 48 或 72 小時後收集至流式細胞儀專用試管中，以 300 ×g 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，拍散細胞，再以 1 ml PBS (1X) wash 一次後，回溶於 已稀釋至 1X 之 Binding buffer，並調整細胞密度至 2-5 × 105 cells/ml。加 入 5 μl Annexin V:FITC 於 195 μl 之上述細胞液，以手輕拍混勻，於室溫 下避光靜置 10 分鐘。然後以 Binding buffer (1X) wash 一次並回溶於 190 μl，加入 10 μl PI solution 後，利用 FACScan 流式細胞儀檢測，並以 CellQuest 軟體分析。. 十、Active caspase-3 分析 細胞中活化態的 caspase-3 可視為進行細胞凋亡的一種指標，本實驗 係以 Active Caspase-3 FITC Mab Apoptosis Kit，依照 BD Pharmingen 廠商 提供之實驗步驟進行染色。將藥物處理過之細胞，於 24 小時後收集至流 式細胞儀專用試管中，以 300 ×g 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，拍散 細胞，再以 1 ml PBS (1X) wash 兩次後，回溶於 BD Cytofix/CytopermTM solution，並調整細胞密度至 1 × 106 cells/ 0.5 ml。將檢品移至冰上靜置 20 分鐘後，離心去除上清液，並以已稀釋至 1X 之 BD Perm/Wash bufferTM wash 兩次，然後將細胞回溶於含有 caspase-3 抗體之 Perm/Wash bufferTM (混和比例如下表所示)，於室溫下靜置 30 分鐘。最後以 1 ml BD Perm/Wash 39.
(54) bufferTM (1X) wash 一次，並用 0.5 ml 回溶細胞後，然後以 FACScan 流式 細胞儀檢測，以 CellQuest 軟體進行資料分析。. 十一、細胞內活性氧化物測定. 本 實 驗 係 以 DHE 做 為 探 針 來 檢 測 細 胞 內 之 超 氧 陰 離 子 (superoxide)。將藥物處理過之細胞，分別於指定之時間收集至流式細胞 儀專用試管中，以 300 ×g 室溫下離心 5 分鐘，移除上清液，拍散細胞， 再以 1 ml PBS wash 一次，回溶於濃度為 10 μM 之 DHE-containing RPMI-1640 medium (不含 phenol red)，將試管移至 37℃水浴槽放置 30 分 鐘，之後將試管移至冰上，靜置 10 分鐘後上 FACScan 流式細胞儀分析。. 十二、細胞蛋白質萃取. 將藥物處理過之細胞收集至離心管中，以270 ×g 於4°C離心5分鐘， 將移除上清液並拍散細胞，用PBS wash細胞兩次，再加入適量 (30-50 μl) 的 complete lysis buffer (每 1 ml M-PER mammalian protein extraction reagent含有0.5% Proteinase inhibitors cocktail) 並與細胞均勻混合，移置冰 40.
(55) 上30分鐘。之後以14000 ×g 於4℃離心20分鐘，最後收集上清液即為細胞 蛋白質溶液，將其保存於-80℃冰箱備用。. 十三、蛋白質含量測定 蛋白質於鹼性環境下可將雙價的銅離子 (Cu2+) 還原成單價的亞銅離 子 (Cu+)，而 bicinchoninic acid (BCA) 會與亞銅離子螯合，產物成藍紫 色，因此本實驗使用 BCA kit 來分析蛋白質含量。BCA reagent kit 含 reagent A (BCA) 及 reagent B (CuSO4)，事先將 reagent A 及 reagent B 以 49：1 比 例均勻混合，在 96-well plate 中與標準品 bovine serum albumin (BSA)或蛋 白質樣品以 9：1 比例混合，於 37°C 暖房靜置反應 30 分鐘，最後利用分 光光度計在波長 562 nm 檢測其吸光值，藉由 BSA 繪製之標準曲線，以內 插法可求得樣品中蛋白質含量。. 十四、西方墨點法 首先，使用BioRad迷你電泳裝置，製備10%或12.5%之separating gel 與 5% stacking gel 進 行 sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 電泳。將已定量之蛋白質與4X sample loading buffer混合均勻，放入100℃沸水中煮5分鐘，隨後立即放置冰上冷卻，再 依序loading至每個well中。固定電壓在60 volts進行電泳 (約0.5至1小時)， 41.
(56) 當band跑至separating gel時，再將電壓調至120 volts進行電泳 (約1至1.5 小時)。電泳結束後將gel取出，用BioRad transfer system固定電流400 mA 通 電 1 小 時 ， 將 gel 上 的 蛋 白 質 轉 印 至 nitrocellulose membrane (NC membrane)，完成後將NC membrane放進5% blocking buffer (5% non-fat milk in TTBS)，進行blocking 1小時。接著針對實驗欲觀察的蛋白，用一 級抗體和NC membrane上的蛋白質結合，再以二級抗體和一級抗體結合， 接著與enhanced chemiluminescence (ECL) 進行呈色反應。用底片壓片 後，使用沖片機進行沖片，即可在底片上觀察蛋白質表現的變化。本實驗 所使用的各種溶液之配方如附錄6。. 十五、裸鼠異位移植腫瘤實驗 本實驗是經過台北榮民總醫院動物實驗委員會核可通過，核可文號為 No. 97-148。首先，將購得之 22 隻裸鼠 (週齡 5 週，體重 20 g 至 24 g) ， 飼養於無病原環境之場所，室溫維持 25 ± 2°C，燈光每日以 12 小時亮與 12 小時暗的方式循環，使用之鼠籠需經過滅菌，而飼料與飲用水皆經過 滅菌再給予。飼養一週後，將 HL-60 細胞以皮下注射的方式注入裸鼠兩 邊的大腿外側，每邊的細胞數為 1 × 106 cells (in 0.5 ml PBS)。當所有老鼠 長出可觸知大小的腫瘤時 (腫瘤直徑約 4 mm 至 6 mm，時間約 3 週)，將 裸鼠隨機分成三組，每組 7 到 8 隻，分別以腹腔注射的方式給予劑量為 42.
(57) 100 mg/kg/day 之 CMEMM, 500 mg/kg/day 之 CMEMM 以及滅菌水，每天 給予 1 次，同時以數位游標卡尺測腫瘤大小以及體重，腫瘤大小的計算係 依據公式：tumor volume (mm3) = 0.4 × L × W2，L 和 W 分別為腫瘤之最長 邊與最短邊。連續給藥 21 天後，將所有裸鼠犧牲並取下腫瘤，記錄最後 體重與腫瘤重量以計算% ratio of final tumor-to-body weight (Ho et al., 2006)，然後將腫瘤與其他器官，如肝臟、腎臟及脾臟，分別取適當大小 進行固定及石蠟包埋，最後將蠟塊切片，以 H&E (hematoxylin and eosin) 染色後，請病理科醫師進行病理學分析。. 十六、藥物合併作用分析 本分析的目的在於判斷藥物合併的交互作用是屬於協同性、加成性或 者拮抗性，實驗數據取自 CMEMM 與 ATO 並用處理後之細胞生長試驗， 利用 CalcuSyn V2 軟體 (購自 Biosoft, Cambridge, United Kingdom) 計算 各劑量組合之 Combination Index (CI)。當 CI 小於 1 時屬於協同作用，CI 等於 1 時屬於加成作用，而 CI 大於 1 時則是拮抗作用，更進一步的 CI 意義判讀則參照附錄 7。. 十七、統計方法 進行統計分析時，實驗數據取自具有再現性至少三次之獨立實驗 (動 43.
(58) 物實驗除外) ，每次實驗中各處理均至少二重複，並以平均值加減標準誤 (mean ± SE) 表示。實驗組與對照組間平均值差異的分析，係以變異數分 析 (one-way analysis of variance) 進行，並以 Student–Newman–Keuls 做事 後檢定，當 P < 0.05 時視為具有統計上的意義，使用之統計軟體為 SPSS for Windows 10.0 version。. 44.
(59) 第五章 實驗結果 第一節. 血藤莖部粗抽物之 HPLC 指紋圖譜. 為尋求分離效果最佳之層析條件，本實驗先將 4 種異黃酮類 calycosin、afrormosin、genistein 及 medicarpin 之混合標準品以 Table 3 之 層析條件 A 至 E 逐一進行測試，其中層析條件 D 及 E 的對於 4 種標準品 成分之分離效果較佳。再以此二條件注入 CMEMM 檢品測試，結果以層 析條件 E 可明顯分離出 calycosin、afrormosin、genistein 等三成分，其標 準品及 CEMMM 之層析圖譜如 Figure 2。. 45.
(60) 第二節. 血藤莖部粗抽物對於人類血癌細胞 HL-60 生長 之影響. 如 Figure 3 所示，CMEMM 對於 HL-60 細胞的生長抑制有劑量及時 間的依存關係，以 50 μg/ml 或 75 μg/ml CMEMM 處理之細胞可以看到顯 著的生長抑制作用 (P < 0.05)，而反應時間在 48 及 72 小時組別的趨勢一 致。抑制效果最明顯是出現在 72 小時的反應時間，隨著 CMEMM 劑量由 25 μg/ml 增加至 75 μg/ml，生長抑制的百分率也由 22.7%提升至 81.0%。 72 小時之 CMEMM 半數抑制濃度 (50% growth inhibition, IC50) 為 36.4 μg/ml。. 46.
(61) 第三節. 血藤莖部粗抽物對於人類血癌細胞 HL-60 細胞 週期中 sub-G1 期比率之影響. 以流式細胞儀分析經 CMEMM 處理之 HL-60 細胞週期，結果如 Figure 4 所示，CMEMM 會提高 HL-60 細胞於 sub-G1 期 (hypodiploid 亞二倍體) 比率，且有劑量依存之關係。在 24 至 72 小時的反應過程中，HL-60 細胞 以 75 μg/ml CMEMM 處理者，其細胞處於 sub-G1 期比率明顯由 25.4% 提 升至 54.7%，而相同條件下對照組則幾無變化 (0.4%至 0.7%)。. 47.
(62) 第四節. 血藤莖部粗抽物誘導人類血癌細胞 HL-60 細胞 凋亡現象之探討. 一、以 EtBr 染色法檢測細胞凋亡之型態特徵 本實驗是將經過 CMEMM 處理 72 小時之 HL-60 細胞，藉由 EtBr 螢 光染色來觀察細胞核之型態改變。如 Figure 5 所示，經 25 μg/ml CMEMM 處理之細胞，其細胞核型態與對照組相似；而經 50 μg/ml 或 75 μg/ml CMEMM 處理之細胞，其細胞核呈現皺縮 (condensed nuclei)、斷裂 (fragmented chromatin) 或凋亡小體 (apoptotic bodies)，與對照組圓形且完 整的細胞核明顯不同。. 二、以 annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測凋亡細胞之比率 以 annexin V-FITC/PI 雙染色法分析經 CMEMM 處理之 HL-60 細胞， 結果如 Figure 6 所示，CMEMM 會提高 annexin V-positive 凋亡細胞的比 率，且有劑量及時間的依存關係。經過 72 小時的反應過程，HL-60 細胞 以 75 μg/ml CMEMM 處 理 者 ， 細 胞 早 期 凋 亡 (annexin V-positive, PI-negtive) 的比率由 8.5%提升至 64.8%，細胞壞死 (annexin V-positive, PI-positive) 的比率由 7.1%提升至 23.4%，而相同條件下對照組則幾無變 化 (細胞早期凋亡比率：1.3%至 2.5%；細胞壞死比率 0.6% 至 1.8%)。 48.
(63) 三、以流式細胞儀檢測細胞內之活化態 caspase-3 由於 caspase-3 為 caspase 家族主要成員之一，此類的 cysteine protease 可裂解 protein substrate 並產生特異性的凋亡型態 (characteristic apoptotic morphology) ，因此 caspase-3 的活化可以做為細胞凋亡的指標。而為了 瞭解 caspase-3 的活化是否與 CMEMM 所誘導的 HL-60 細胞凋亡有關，本 實 驗 以 具 專 一 性 的 活 化 態 caspase-3 抗 體 (active caspase-3-specific antibody) 做為探針，利用流式細胞儀檢測分析。結果如 Figure 7 所示， 於 24 小時的反應時間下，CMEMM 會誘導 HL-60 細胞內之活化態 caspase-3 提升，且有劑量的依存關係。其中，以 75 μg/ml CMEMM 處理之 HL-60 細胞，其活化態 caspase-3 的比率由 2.8%提升至 42.5%。. 49.
(64) 第五節. 血藤莖部粗抽物 (CMEMM) 對於裸鼠異位移 植腫瘤實驗之影響. 為了瞭解在活體動物模式中，CMEMM 是否也可以抑制 HL-60 細胞 的生長，本實驗先將 HL-60 細胞注入裸鼠，待腫瘤生成後，每天以腹腔 注射的方式，分別將劑量 100 mg/kg 或 500 mg/kg 之 CMEMM 注入裸鼠， 並以給予 PBS 者做為對照組，為期 21 天。結果如 Figure 8 所示，以每日 所測量之腫瘤體積指數 (relative tumor volume) 來看，處理 100 mg/kg CMEMM 之組別與對照組的趨勢相同，而處理 500 mg/kg CMEMM 之組 別相較於對照組由給藥第 5 天起即有顯著差異。實驗結束時，100 mg/kg CMEMM 組與對照組之腫瘤體積指數分別為 16.8 及 16.6，而 500 mg/kg CMEMM 組腫瘤體積指數為 9.4。此外，以最終腫瘤與體重比值 (final tumor-to-body weight) 來看，處理 500 mg/kg CMEMM 之組別相較於對照 組有顯著差異，顯示 CMEMM 抑制腫瘤生長的同時並未使裸鼠體重減 輕。而實驗期間各組均未發生老鼠死亡的情形，且後續的病理切片觀察 (H&E stain) 中，肝臟、腎臟及脾臟皆未發現有病變的情形。. 50.
(65) 第六節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血 癌細胞 HL-60，Jurkat 及 Molt-3 生長之影響. 為評估 CMEMM 與 ATO 並用時對於 HL-60，Jurkat 及 Molt-3 細胞生 長之影響，將上述細胞分別以 25 μg/ml，50 μg/ml，75 μg/ml 之 CMEMM 以及 2.5 μM，5 μM 之 ATO 單獨或是合併處理。經過 24 及 48 小時反應時 間後，各組別之生長情形如 Figure 9 所示，CMEMM 合併使用 ATO 明顯 可以增強對於細胞生長抑制的效果。 以 CalcuSyn 軟體分析藥物交互作用的結果如 Table 4 所示，不同濃度 之 CMEMM 與 ATO 並用對於 HL-60 細胞的生長抑制作用均屬於協同效 果，但對於 Jurkat 及 Molt-3 細胞的生長抑制則依組合的不同而呈現協同、 加成或拮抗效果。. 51.
(66) 第七節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於對於人 類血癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞內活性氧化物 之影響. 由於 ATO 或某些 DNA damaging agent 可以透過 ROS 的生成來誘導 細胞凋亡，因此本實驗以 DHE 做為探針，檢測 ROS 在 CMEMM 與 ATO 誘導之細胞凋亡是否產生變化。結果如 Figure 10 所示，在 CMEMM 與 ATO 合併處理 48 小時的過程中，HL-60 細胞於處理時間 16 小時開始， 細胞內 ROS 之生成量隨著時間漸漸上升，而 Jurkat 細胞則是從處理時間 8 小時開始顯著提升。. 52.
(67) 第八節. 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血 癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞週期中 sub-G1 期比 率之影響. 由於 CMEMM 與 ATO 並用時，可以協同性地增加對於 HL-60 及 Jurkat 細胞生長抑制的作用，所以本實驗進一步以流式細胞儀分析經藥物處理之 細胞週期的變化。結果如 Figure 11 所示，當處理時間為 24 小時，細胞只 有處理 2.5 μM 之 ATO 者，其處於 sub-G1 期細胞的比率都很低 (小於 3%)， 而同時再加入 50 μg/ml 之 CMEMM 處理者，sub-G1 期的比率將會顯著提 升。若處理時間延長至 48 小時，則 Jurkat 細胞處於 sub-G1 期增加的比率 明顯高於 HL-60 細胞。. 此外，倘若 CMEMM 與 ATO 並用時再加入抗氧化劑 NAC，當處理 時間為 24 小時，HL-60 細胞處於 sub-G1 期細胞的比率將由 8.12%降低為 4.12%，Jurkat 細胞處於 sub-G1 期細胞的比率將由 13.27%降低為 2.75%； 若處理時間延長至 48 小時，則抑制幅度更為明顯，HL-60 細胞處於 sub-G1 期細胞的比率將由 10.14%降低為 4.11%，Jurkat 細胞處於 sub-G1 期細胞的 比率將由 22.59%降低為 2.37%。顯示 NAC 可以抑制 CMEMM 與 ATO 並 用所造成的 sub-G1 期比率增加。. 53.
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