血藤莖部粗抽物誘導人類血癌細胞 HL-60 細胞凋

一、以 EtBr 染色法檢測細胞凋亡之型態特徵

本實驗是將經過 CMEMM 處理 72 小時之 HL-60 細胞，藉由 EtBr 螢 光染色來觀察細胞核之型態改變。如 Figure 5 所示，經 25 μg/ml CMEMM 處理之細胞，其細胞核型態與對照組相似；而經 50 μg/ml 或 75 μg/ml CMEMM 處理之細胞，其細胞核呈現皺縮 (condensed nuclei)、斷裂 (fragmented chromatin) 或凋亡小體 (apoptotic bodies)，與對照組圓形且完 整的細胞核明顯不同。

二、以 annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測凋亡細胞之比率

以 annexin V-FITC/PI 雙染色法分析經 CMEMM 處理之 HL-60 細胞，

結果如 Figure 6 所示，CMEMM 會提高 annexin V-positive 凋亡細胞的比 率，且有劑量及時間的依存關係。經過 72 小時的反應過程，HL-60 細胞 以 75 μg/ml CMEMM 處 理 者 ， 細 胞 早 期 凋 亡 (annexin V-positive, PI-negtive) 的比率由 8.5%提升至 64.8%，細胞壞死 (annexin V-positive, PI-positive) 的比率由 7.1%提升至 23.4%，而相同條件下對照組則幾無變 化 (細胞早期凋亡比率：1.3%至 2.5%；細胞壞死比率 0.6% 至 1.8%)。

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三、以流式細胞儀檢測細胞內之活化態 caspase-3

由於 caspase-3 為 caspase 家族主要成員之一，此類的 cysteine protease 可裂解 protein substrate 並產生特異性的凋亡型態 (characteristic apoptotic morphology) ，因此 caspase-3 的活化可以做為細胞凋亡的指標。而為了 瞭解 caspase-3 的活化是否與 CMEMM 所誘導的 HL-60 細胞凋亡有關，本 實 驗 以 具 專 一 性 的 活 化 態 caspase-3 抗 體 (active caspase-3-specific antibody) 做為探針，利用流式細胞儀檢測分析。結果如 Figure 7 所示， 於 24 小時的反應時間下，CMEMM 會誘導 HL-60 細胞內之活化態 caspase-3 提升，且有劑量的依存關係。其中，以75 μg/ml CMEMM 處理之 HL-60 細胞，其活化態 caspase-3 的比率由 2.8%提升至 42.5%。

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第五節 血藤莖部粗抽物 (CMEMM) 對於裸鼠異位移 植腫瘤實驗之影響

為了瞭解在活體動物模式中，CMEMM 是否也可以抑制 HL-60 細胞 的生長，本實驗先將 HL-60 細胞注入裸鼠，待腫瘤生成後，每天以腹腔 注射的方式，分別將劑量 100 mg/kg 或 500 mg/kg 之 CMEMM 注入裸鼠，

並以給予 PBS 者做為對照組，為期 21 天。結果如 Figure 8 所示，以每日 所測量之腫瘤體積指數 (relative tumor volume) 來看，處理 100 mg/kg CMEMM 之組別與對照組的趨勢相同，而處理 500 mg/kg CMEMM 之組 別相較於對照組由給藥第 5 天起即有顯著差異。實驗結束時，100 mg/kg CMEMM 組與對照組之腫瘤體積指數分別為 16.8 及 16.6，而 500 mg/kg CMEMM 組腫瘤體積指數為 9.4。此外，以最終腫瘤與體重比值 (final tumor-to-body weight) 來看，處理 500 mg/kg CMEMM 之組別相較於對照 組有顯著差異，顯示 CMEMM 抑制腫瘤生長的同時並未使裸鼠體重減 輕。而實驗期間各組均未發生老鼠死亡的情形，且後續的病理切片觀察 (H&E stain) 中，肝臟、腎臟及脾臟皆未發現有病變的情形。

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第六節 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血 癌細胞 HL-60，Jurkat 及 Molt-3 生長之影響

為評估 CMEMM 與 ATO 並用時對於 HL-60，Jurkat 及 Molt-3 細胞生 長之影響，將上述細胞分別以 25 μg/ml，50 μg/ml，75 μg/ml 之 CMEMM 以及 2.5 μM，5 μM 之 ATO 單獨或是合併處理。經過 24 及 48 小時反應時 間後，各組別之生長情形如 Figure 9 所示，CMEMM 合併使用 ATO 明顯 可以增強對於細胞生長抑制的效果。

以 CalcuSyn 軟體分析藥物交互作用的結果如 Table 4 所示，不同濃度 之 CMEMM 與 ATO 並用對於 HL-60 細胞的生長抑制作用均屬於協同效 果，但對於 Jurkat 及 Molt-3 細胞的生長抑制則依組合的不同而呈現協同、

加成或拮抗效果。

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第七節 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於對於人 類血癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞內活性氧化物 之影響

由於 ATO 或某些 DNA damaging agent 可以透過 ROS 的生成來誘導 細胞凋亡，因此本實驗以 DHE 做為探針，檢測 ROS 在 CMEMM 與 ATO 誘導之細胞凋亡是否產生變化。結果如 Figure 10 所示，在 CMEMM 與 ATO 合併處理 48 小時的過程中，HL-60 細胞於處理時間 16 小時開始，

細胞內 ROS 之生成量隨著時間漸漸上升，而 Jurkat 細胞則是從處理時間 8 小時開始顯著提升。

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第八節 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用對於人類血 癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞週期中 sub-G

期比 率之影響

由於 CMEMM 與 ATO 並用時，可以協同性地增加對於 HL-60 及 Jurkat 細胞生長抑制的作用，所以本實驗進一步以流式細胞儀分析經藥物處理之 細胞週期的變化。結果如 Figure 11 所示，當處理時間為 24 小時，細胞只 有處理 2.5 μM 之 ATO 者，其處於 sub-G1期細胞的比率都很低 (小於 3%)，

而同時再加入 50 μg/ml 之 CMEMM 處理者，sub-G1期的比率將會顯著提 升。若處理時間延長至 48 小時，則 Jurkat 細胞處於 sub-G1期增加的比率 明顯高於 HL-60 細胞。

此外，倘若 CMEMM 與 ATO 並用時再加入抗氧化劑 NAC，當處理 時間為 24 小時，HL-60 細胞處於 sub-G1期細胞的比率將由 8.12%降低為 4.12%，Jurkat 細胞處於 sub-G1期細胞的比率將由 13.27%降低為 2.75%；

若處理時間延長至 48 小時，則抑制幅度更為明顯，HL-60 細胞處於 sub-G1

期細胞的比率將由 10.14%降低為 4.11%，Jurkat 細胞處於 sub-G1期細胞的 比率將由 22.59%降低為 2.37%。顯示 NAC 可以抑制 CMEMM 與 ATO 並 用所造成的 sub-G1期比率增加。

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第九節 血藤莖部粗抽物與三氧化二砷並用誘導人類血 癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細胞凋亡現象之探討

一、以 DAPI 染色法檢測細胞凋亡之型態特徵

本實驗是將單獨處理 50 μg/ml CMEMM、2.5 μM ATO 或是並用處理 之細胞，藉由 DAPI 螢光染色來觀察細胞核之型態改變。如 Figure 12 所 示，於處理時間 24 小時，CMEMM 和 ATO 並用處理之 HL-60 及 Jurkat 細 胞 明 顯 比 單 獨 處 理 者 具 有 細 胞 核 皺 縮 (condensed nuclei) 、 斷 裂 (fragmented chromatin) 或凋亡小體 (apoptotic bodies) 的現象。當處理時 間延長至 48 小時，則並用處理所造成 HL-60 及 Jurkat 細胞的凋亡形態特 徵將更為明顯，而 Molt-3 細胞也開始出現凋亡形態特徵。

二、以 annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測凋亡細胞之比率

為了進一步確認在 CMEMM 與 ATO 並用造成細胞凋亡的現象中，

ROS 是否扮演重要的角色，本實驗在 annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測凋 亡細胞比率的同時，另外加入一些抗氧化劑如 NAC、BHT 或 α-tocopherol 加以測試。結果如 Figure 13 所示，經過 24 小時的處理時間，單獨處理 50 μg/ml CMEMM 或 2.5 μM ATO 之 HL-60 細胞，其 annexin V-positive 凋 亡細胞的比率分別為 3.65%及 2.18%，但兩者並用處理時此比例會顯著提

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升至 25.36%，而若同時再加入抗氧化劑 NAC 或 BHT 處理，則 annexin V-positive 的比率則分別會減少至 2.51%或 12.79%。而相同的處理時間 下，單獨處理 50 μg/ml CMEMM 或 2.5 μM ATO 之 Jurkat 細胞，其 annexin V-positive 的比率分別為 3.89%及 6.86%，兩者並用處理時此比例則顯著 提升至 23.81%，若同時再加入抗氧化劑 NAC 或 α-tocopherol 處理，則 annexin V-positive 的比率則分別會減少至 7.70%或 8.55%。以上結果顯 示，CMEMM 與 ATO 並用在所 HL-60 及 Jurkat 細胞所誘導的凋亡現象，

顯然與氧化壓力的形成有關。

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第十節 利用西方墨點法探討血藤莖部粗抽物與三氧化 二砷並用誘導人類血癌細胞 HL-60 及 Jurkat 細 胞凋亡之相關蛋白質表現

為了進一步探討 CMEMM 與 ATO 並用所誘導細胞凋亡的可能機轉，

本實驗以西方墨點法檢測粒線體路徑相關蛋白質的表現。如 Figure 14 所 示，經過 24 小時以 CMEMM 與 ATO 並用處理之 HL-60 及 Jurkat 細胞，

其活化態的 caspase-3 和 caspase-9 (cleaved caspase-3, caspase-9)以及被切 斷的 PARP (cleaved PARP) 蛋白質表現量都比單獨處理者為高。此外，若 同時加入 NAC 於 CMEMM 和 ATO 並用處理者，這些蛋白質的表現量將 明顯受到抑制，且幾乎與未處理藥物者相同。本實驗結果顯示，CMEMM 與 ATO 並用所誘導細胞凋亡與粒線體路徑有關，並且可以被抗氧化劑 NAC 所調控。

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59 2010; Yao et al., 2009)。所以未來臨床應用上，最佳化的劑量組合將會是 CMEMM 和 ATO 合併療法重要的一環，值得進一步探討。

此外，藥物交互作用分析係基於 median-effect equation 的 mass-action

60 顯著的觀察到協同性地增加 annexin V-positive 的細胞比率 (Figure 13)。

ATO 會刺激細胞內生成 ROS 是眾所周知的事實，一些體外試驗的研 究報導指出，ATO 所誘導的血癌細胞凋亡可能是透過活性氧化物途徑，

例如：NADPH oxidase (Wang et al., 2008), mitochondrial electron transport chain (Pelicano et al., 2003) 或是抑制抗氧化酵素如 thioredoxin reductase 有前氧化物的環境中 (pro-oxidant environment)，將會增強血癌細胞凋亡 的現象。

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有關血藤化學成分方面，本實驗室先前已由莖部分離出多個具有活性 之異黃酮類成分 (Table 2)，而本研究以 calycosin、afrormosin 及 genistein 為指標成分，建立 CMEMM 之 HPLC 指紋圖譜 (Figure 2)，可供後續研究 (Sanchez et al., 2008)，由於先前的本實驗室對於 genistein 在血藤乾燥莖部 的含量分析結果為 0.001% (陳亭亭, 2005)，因此可以合理的推斷，genistein 並非 CMEMM 去增強 ATO 誘導 HL-60 及 Jurkat 細胞凋亡的主要成分，

CMEMM 與 ATO 協同性地抗血癌效果可能是透過多個具有抗癌作用的異 黃酮成分 (calycosin、afrormosin、genistein 及 medicarpin) 所產生。

而為進一步探討 CMEMM 與 ATO 並用所誘導的細胞凋亡是否透過

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caspase-dependent 的路徑，在細胞週期試驗中，也嘗試加入 pan-caspase inhibitor 如 z-VAD-fmk 來觀察雕亡現象是否受到影響。而實驗結果發現，

在處理時間 24 小時的反應中，25 μM 的 z-VAD-fmk 可以顯著地減少 Jurkat 細胞因 50 μg/ml CMEMM 與 2.5 μM ATO 作用所引起 sub-G1期的蓄積；但 是在同樣的條件下，z-VAD-fmk 對於 HL-60 細胞卻顯然無法抑制 sub-G1

的比率 (Figure 15)。然而，經由 annexin V-FITC/PI 的實驗結果可以發現，

HL-60 細胞受 CMEMM 與 ATO 並用所誘導的 necrotic cell 為 13.17%，明 顯比 Jurkat 細胞的 2.22%為高 (Figure 13)，因此推測 z-VAD-fmk 對於 HL-60 細胞無法抑制其 DNA 斷裂的原因，可能是因為 HL-60 部分的細胞 已走向細胞壞死的方式。此外，25 μM 之 z-VAD-fmk 對於 HL-60 的細胞 是否濃度過低而不足以作用，或者 z-VAD-fmk 加入時間點過早，以致於 還沒開始作用就被細胞的酵素所分解，這些也都是 z-VAD-fmk 對於 HL-60 細胞反應不明顯的可能原因，至於是否與 caspase-independent 路徑有關則 有待進一步評估。

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物血藤的民俗用法，提供未來 CMEMM 與 ATO 並用於血癌治療上的研究 基礎，提升台灣藥用植物的應用價值，也開啟臨床治療上將化療藥物與中 草藥並用的可能性。

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