台灣地區咖啡果小蠹 (Hypothenemus hampei) 分離之Isaria javanica CAES1 鑑定與致病性測試
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(2) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. 生物防治資材之重要性。 現行於咖啡果小蠹上曾記錄分離到之蟲生 真 菌， 包 括 白 殭 菌 Beauveria bassiana、 黑 殭 菌 Metarhizium anisopliae、Nomuraea rileyi、 Isaria amoenerosea (= Paecilomyces amoeneroseus)、Isaria farinosa (= Paecilomyces farinosus)、Isaria fumosorosea (= Paecilomyces fumosoroseus)、Isaria javanica (= Paecilomyces javanicus)、Purpureocillium lilacinum (= Paecilomyces lilacinus)、Lecanicillium lecanii (= Verticillium lecanii) 及 Hirsutella eleutheratorum 等 (Samson 1974; Vega et al. 1999; Bustillo et al. 2002; Wraight et al. 2018a; Wraight et al. 2018b)，其中，以白殭菌及黑殭菌之應用較為 普遍，目前國外已有部分運用白殭菌與黑殭菌 商品防治咖啡果小蠹之研究與應用 (De La Rosa-Reyes et al. 1995; De La Rosa et al. 1997; De La Rosa et al. 2000; Samuels et al. 2002; Ve r a e t a l. 2 0 11 ; B a l a k r i s h n a n & P r a k a s h 2014)。於國內，作者實驗室目前於台灣之咖 啡果小蠹上僅有分離到白殭菌之紀錄 (Liang & Wang 2018)，且尚無於田間實際運用微生物殺 蟲劑防治咖啡果小蠹之研究。本研究自嘉義縣 中埔鄉之咖啡園採集自然感染蟲生真菌而死亡 之咖啡果小蠹，於其上分離到一 Isaria 屬之真 菌。由於迄今尚無於台灣之咖啡果小蠹上分離 到 Isaria 屬真菌之紀錄，故本研究描述及記錄 此菌之型態及進行分子鑑定，以瞭解其種類及 培養特性，並觀察此菌於咖啡果小蠹上之產孢 過程，以作為未來利用此菌作為微生物防治之 參考。. 材料與方法 供試蟲源及蟲生真菌分離 本試驗所使用之咖啡果小蠹蟲源及蟲生真 菌，皆採集自嘉義縣中埔鄉無施用化學農藥的 咖啡果園。咖啡果小蠹根據 Chu et al. (2017) 所描述之人工飼養方式進行大量飼養，試驗時 選取活動力較佳之雌成蟲作為試驗蟲源。蟲生 真菌採集自咖啡果實臍部染病死亡的咖啡果小 蠹雌成蟲，將蟲體以滅菌的鑷子自果實上移出 後， 以 雙 面 膠 黏 貼 於 盛 裝 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 瓊 脂. 133. 培 養 基 [potato dextrose agar medium (PDA), Difco Inc., Detroit, MI, USA] 之塑膠培養皿上 蓋內側，使蟲體上之分生孢子自然落下至培養 基 上， 再 移 植 長 出 之 菌 落 至 新 的 PDA， 所 得 菌株編號為 CAES1。. 菌落形態及菌絲於不同溫度與培養基中 之生長速率 將分離株 CAES1 培養於 PDA 上，待其產 孢 後， 將 分 生 孢 子 分 散 於 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 中， 利 用 血 球 計 數 器 計 算 並 調 整 孢 子 濃 度 為 10 7 conidia mL -1。將直徑 6 mm 之無菌濾紙片 (Advantec Toyo Ltd., Tokyo, Japan) 置於沙氏葡萄 糖 瓊 脂 酵 母 培 養 基 [Sabouraud dextrose agar medium with yeast extract (SDAY)； 含 40 g L-1 dextrose、10 g L -1 peptone、10 g L -1 yeast extract 及 15 g L -1 agar]、 麥 芽 抽 出 物 瓊 脂 培 養 基 [malt extract agar medium (MEA)； 含 20 g L -1 malt extract、1 g L -1 peptone、20 g L -1 dextrose 及 15 g L -1 agar] 及 PDA 中央，滴加 5 μL CAES1 分生孢子懸浮液於其上，再將培 養 基 置 於 10、15、20、25、30 及 35℃之 恆 溫 黑暗培養箱中，14 d 後測量菌落直徑。每處理 共 6 重複。. 產孢構造 將 分 離 株 CAES1 培 養 於 PDA 上， 於 25℃、 黑 暗 之 生 長 箱 中 培 養 14 d 後， 挑 取 產 孢 構 造 懸 浮 於 0.1% Triton X-100 中， 置 於 玻 片上，以干涉位相差 [differential interference contrast (DIC), Nikon, Tokyo, Japan] 顯 微 鏡 觀察，並以 NIS-ElementsBR 3.0 軟體 (Nikon, Tokyo, Japan) 拍 照 後 以 ImageJ 軟 體 測 量 50 個以上之瓶梗及分生孢子大小。. 分子生物學鑑定 以簡易 NaOH 萃取方式抽取 CAES1 之 DNA (Wang et al. 1993)，作為聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction; PCR) 之 模 版， 並 利 用 引 子對 ITS4/ITS5 增幅核糖體內轉錄區間 (internal transcribed spacer; ITS) (600 bp)、983F/2218R 增 幅 translation elongation factor-1α gene (TEF1).
(3) 134. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. (1,000 bp)， 以 及 T1/T2、Bt1a/Bt1b、Bt2a/T222 和 T12/T22 增 幅 β-tubulin 基 因 片 段 (Glass & Donaldson 1995; O’Donnell & Cigelnik 1997; Rehner & Buckley 2005) (表 1)。PCR 反 應 使 用 Fast-RunTM Taq Master kit (波 仕 特 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司， 台 灣 台 北 市)， 添 加 物 包 括 5× Taq Master Mix 5 μL、 引 子 (10 pmole μL -1) 各 0.5 μL、ddH 2O 18 μL 及 DNA 模版 1 μL， 總 共 25 μL。 增 幅 ITS 序 列 之 PCR 條 件 則 為 94 ℃ 1 min，1 個 循 環；94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72℃ 2 min，35 個循環；72℃ 5 min， 1 個 循 環。TEF1 及 β-tubulin 則 透 過 遞 減 式 (touchdown) PCR 方式增幅，反應條件為 94℃ 2 min，1 個 循 環；94 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s ( 每 一 個 循 環 遞 減 1℃)、72 ℃ 60 s，9 個 循 環； 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，33 個循環； 72℃ 10 min，1 個循環 (Shimazu & Takatsuka 2010; Gallou et al. 2016)。PCR 產 物 委 託 源 資生物科技公司 (台灣台北市) 進行核酸定序 工 作， 再 將 所 得 之 序 列 與 美 國 國 家 生 物 科 技 資 訊 中 心 (National Center for Biotechnology Information; NCBI) 基因庫中所登錄之序列進 行比對。. 親緣關係樹之重建 由 於 以 NCBI 資 料 庫 比 對 之 結 果 顯 示，. CAES1 之 ITS 序 列 與 Isaria 相 似 度 最 高， 因 此本研究親緣關係樹之重建參考 Gallou et al. (2016) 進 行 Isaria 種 類 鑑 別 所 使 用 之 真 菌 的 ITS、TEF1 及 β-tubulin 序 列 (附 錄)， 將 基 因 序 列 以 Clustal X2 (Larkin et al. 2007) 進 行 序 列 比 對。 再 經 由 Genedoc 2.7 移 除 比 對 後 序 列 的 空 隔 (gap)， 之 後 以 jModelTest 2.1.10 (Darriba et al. 2012) 測 試 評 估 較 佳 之 重 建 親 緣 關 係 樹 模 型， 並 以 最 大 似 然 法 (maximum likelihood; ML) 進行親緣關係樹之模型重建。 其中，ITS 及 β-tubulin 以 General Time Reversible model 搭配 Gamma Distributed with Invariant Sites，TEF1 則以 Tamura 3-parameter model 搭 配 Gamma Distributed，並利用 Mega X (Kumar et al. 2018) 進 行 1,000 次 的 bootstrap 以 重 建 親緣關係樹。. I. javanica CAES1 於咖啡果小蠹的產孢 過程 以 I. javanica CAES1 分 生 孢 子 感 染 咖 啡 果小蠹的方法修改自 Vega et al. (2008) 之試驗 方式，將 I. javanica CAES1 培養於 PDA 上， 待 其 產 孢 後 (約 14 d)， 將 其 分 生 孢 子 分 散 於 0.1% Triton X-100 中， 並 利 用 血 球 計 數 器 計 算 並 調 整 孢 子 濃 度 為 10 8 conidia mL -1。 將 直 徑 6 mm 之無菌濾紙片放入 2 mL 無菌離心管. 表 1. 本試驗 polymerase chain reaction (PCR) 及定序使用之引子序列及其標的基因。 Table 1. Primer sets and corresponding amplification targets.. z. Target genez. Primer. ITS. ITS4. 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’. Primer DNA sequence. ITS5. 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’. TEF1. 983F. 5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’. 2218R. 5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’. β-tubulin. T1. 5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3’. T2. 5’-TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG-3’. Bt1a. 5’-TTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATG-3’. Bt1b. 5’-GACGAGATCGTTCATGTTGAACTC-3’. Bt2a. 5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’. T222. 5’-GACCGGGGAAACGGAGACAGG-3’. T12. 5’-AACAACTGGGCCAAGGGTCAC-3’. T22. 5’-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3’. ITS: internal transcribed spacer; TEF1: translation elongation factor-1α gene.. Size (bp). Reference. 613. Rehner & Buckley (2005). 1,034. Rehner & Buckley (2005). 647. O’Donnell & Cigelnik (1997). 530. Glass & Donaldson (1995). 762. Glass & Donaldson (1995) O’Donnell & Cigelnik (1997). 807. O’Donnell & Cigelnik (1997).
(4) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. 135. 中，滴加 10 μL 分生孢子懸浮液於濾紙片上， 對照組則以無菌水 (含 0.1% Triton X-100) 取 代孢子液。將人工飼養之咖啡果小蠹雌成蟲單 隻 夾 入 離 心 管 中， 再 置 於 25℃黑 暗 之 生 長 箱 中，之後每日記錄其死亡率。本試驗之試驗組 及對照組各處理 40 隻。另外，為計算感染後 的產孢時間，以上述相同方式處理 40 隻咖啡 果小蠹。其中，5 隻用於拍照記錄 I. javanica CAES1 感染咖啡果小蠹後之菌絲生長及產孢 過程，其餘 35 隻則用於記錄咖啡果小蠹死亡 後 I. javanica CAES1 於蟲體表面產生菌絲及 孢子所需之時間。真菌生長狀況以實體顯微鏡 (S8APO steromicrscope, Lecia, Wetzlar, Germany) 觀 察， 搭 配 EOS 700D (Canon, Tokyo, Japan) 數位相機及 EOSsight 即時影像測量拍 照軟體 (KLO. Co. Ltd, Taipei, Taiwan)，拍攝 I. javanica CAES1 於 咖 啡 果 小 蠹 死 亡 後 之 菌 絲 生長及產孢過程。. 結果 菌落及產孢構造型態 CAES1 於 SDAY、MEA 及 PDA 三 種 培 養基上之菌落均為白色，其中於 MEA 上菌絲 略呈灰色，PDA 上則為淡黃色。SDAY 上菌落 邊緣略呈波浪狀，背面黃褐色，PDA 及 MEA 上則菌落邊緣為毛絮狀，背面乳黃色 (圖 1)。 3 種培養基中，菌絲生長速率於 SDAY 上最快， 而在 6 種測試的溫度中，CAES1 於 10–30℃均 可生長，於 25℃生長速率最快。SDAY、MEA 及 PDA 培 養 14 d 後 之 菌 落 直 徑 分 別 為 57.1 mm ± 2.6 mm、46.2 mm ± 1.2 mm 及 47.6 mm ± 1.0 mm，而在 35℃下則 3 種培養基上均無法 觀察到可見之菌落 (圖 2)。 以光學顯微鏡檢視 CAES1 培養於 PDA 之 無 性 繁 殖 構 造， 其 營 養 菌 絲 平 滑、 透 明、 有 隔，寬約 1.9–3.3 µm。分生孢子梗寬約 2.0–3.0 µm， 分 隔 處 或 末 端 著 生 1–3 個 分 枝， 分 枝 末. (A). (B). (C). (D). (E). (F). 圖 1. Isaria javanica CAES1 於 (A、D) 沙氏葡萄糖瓊脂酵母培養基；(B、E) 麥芽抽出物瓊脂培養基；及 (C、 F) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養 14 d (25℃) 後之菌落外觀 (A–C，正面；D–F，背面)。 Fig. 1. Colony morphology of I. javanica CAES1 after 14 d at 25℃. Colonies on (A, D) Sabouraud dextrose agar medium with yeast extract; (B, E) malt extract agar; or (C, F) potato dextrose agar (A–C, top view; D–F, reverse view)..
(5) 136. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. Colony diameter (mm). 70 SDAY. 60. MEA. 50. PDA. 40 30 20 10 0. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Temperature (°C). 圖 2. Isaria javanica CAES1 在不同溫度下於 SDAY、MEA 及 PDA 培養 14 d 後之菌落直徑。 Fig. 2. Growth of I. javanica CAES1 at 14 d after culture on Sabouraud dextrose agar medium with yeast extract (SDAY), malt extract agar medium (MEA) and potato dextrose agar medium (PDA) at various temperatures.. 端著生 1–4 個瓶梗，或瓶梗直接著生於分生孢 子梗末端。瓶梗細胞長約 3.7–5.0–6.4 μm，寬 約 1.9–3.0–3.5 μm，基部橢圓形，頂端尖細 ( 圖 3A)。分生孢子串生，分生孢子呈橢圓形至長 橢 圓 形、 單 孢、 透 明、 外 壁 平 滑， 大 小 約 為 2.7–3.8–5.4 μm × 1.2–1.6–2.1 μm (圖 3B)。. 親緣關係樹之重建 本研究利用 ITS、TEF1 及 β-tubulin 以最 大 似 然 法 進 行 親 緣 關 係 樹 之 重 建， 結 果 顯 示 CAES1 於 3 種 基 因 所 建 構 的 親 緣 關 係 樹 皆 被 歸類於 I. javanica 的分支 (clade) 內 (圖 4–6)， bootstrap 值分別為 99、98 及 99，且皆與自咖 啡果小蠹分離到 I. javanica CBS134.22 菌株歸 於同一個分支，顯示 CAES1 應屬於 I. javanica 的台灣分離株。. (A). I. javanica CAES1 於咖啡果小蠹的產孢 過程 以 I. javanica CAES1 處 理 咖 啡 果 小 蠹， 結果顯示咖啡果小蠹於第 3 天開始出現死亡， 至 第 7 天 之 累 計 死 亡 率 達 100.0%， 對 照 組 則 均無死亡。觀察咖啡果小蠹死亡後 I. javanica CAES1 的 產 孢 過 程 (圖 7)， 發 現 咖 啡 果 小 蠹 死亡 0.83 d ± 0.15 d 後 CAES1 即可於蟲體表 面 產 生 細 小 菌 絲 (圖 7B–7C)， 此 些 菌 絲 會 形 成更粗的菌絲索，菌絲出現後平均約 1.94 d ± 0.14 d 即可於菌絲上觀察到分生孢子產生 (圖 7D–7E)。 整 體 而 言， 咖 啡 果 小 蠹 遭 受 此 菌 感 染死亡到此菌於蟲體表面產生分生孢子的時間 約為 2.77 d ± 0.17 d。. (B). 圖 3. Isaria javanica CAES1 之 (A) 產孢構造及 (B) 分生孢子 (比例尺 = 10 μm)。 Fig. 3. (A) Conidiogenous structures and (B) conidia of I. javanica CAES1 (bar = 10 μm)..
(6) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. 137. 100 83 73. 66. 100. 9965. 70 100 99 99 42. 98 99 100. 65 63 99. 99. 99 100. 100. 75. 0.10. 圖 4. 使用核糖體內轉錄區間 (ITS) 序列以最大似然法分析 Isaria javanica CAES1 的親緣關係。節點之 數字表示分析 1,000 次重複之 bootstrap 值。比例尺代表核苷酸序列置換比率。Hirsutella sp. OSC 28575、 Paecilomyces marquandii CBS 182.27、Metarhizium flavoviruda BCC 7672 及 Metarhizium robertsii ARSEF 727 之序列使用作為外群。 Fig. 4. The phylogenetic analysis of Isaria javanica CAES1 using internal transcribed spacer (ITS) sequence by maximum likelihood method. The numbers at nodes indicate consensus bootstrap values based on 1,000 replications. Scale bar = 0.10 substitution per nucleotide position. Sequences from Hirsutella sp. OSC 28575, Paecilomyces marquandii CBS 182.27, Metarhizium flavoviruda BCC 7672 and Metarhizium robertsii ARSEF 727 were used as outgroups.. 討論 過 去 文 獻 對 不 同 之 I. javanica 分 離 株 之 型態描述，瓶梗大小之描述彼此間不盡相同。 Samson (1974)、Tzean et al. (1997)、Shima-. zu & Takatsuka (2010)、Kang et al. (2018) 及 Mongkolsamrit et al. (2018) 描述之瓶梗形 狀 較 細 長， 長 度 分 別 為 8–14 μm、5.2–11.1 μm、4.6–13.5 μm、7.98 μm ± 2.81 μm 及 6–10.
(7) 138. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. 94. 99. 81 96. 100. 77. 100. 94 58. 46. 99. 98 53 99 64. 55 49. 99 66. 98. 100. 99. 99. 0.020. 圖 5. 使用 TEF1 以最大似然法分析 Isaria javanica CAES1 的親緣關係。節點之數字表示分析 1,000 次重 複 之 bootstrap 值。 比 例 尺 代 表 核 苷 酸 序 列 置 換 比 率。Paecilomyces marquandii CBS 182.27、Metarhizium flavoviruda BCC 7672 及 Metarhizium robertsii ARSEF 727 之序列使用作為外群。 Fig. 5. The phylogenetic analysis of Isaria javanica CAES1 using translation elongation factor-1α gene (TEF1) by maximum likelihood method. The numbers at nodes indicate consensus bootstrap values based on 1,000 replications. Scale bar = 0.05 substitution per nucleotide position. Sequences from Paecilomyces marquandii CBS 182.27, Metarhizium flavovirida BCC 7672 and Metarhizium flavovirida ARSEF 727 were used as outgroups.. μm， 而 Cabanillas et al. (2013) 及 Gallou et al. (2016) 描 述 之 瓶 梗 長 度 則 較 短， 各 分 離 株 平 均 之 瓶 梗 長 度 分 別 為 4.72–5.64 μm 及 4.81–5.73 μm，與本研究之 I. javanica CAES1 分離株較相近。文獻記錄之分生孢子大小彼此 間 亦 有 所 差 異， 例 如 Samson (1974)、Tzean et al. (1997)、Shimazu & Takatsuka (2010). 描 述 之 孢 子 長 寬 分 別 為 5.0–7.4 μm × 1.4–1.7 μm、3.2–5.6 μm × 1.6–2.8μm、3.0–6.3 μm × 1.4–3.2 μm，形狀則為紡錘形至橢圓形。本研 究 中 CAES1 分 生 孢 子 長 寬 為 2.7–3.8–5.4 μm × 1.2–1.6–2.1 μm，與多數文獻相符合，形狀 則較接近橢圓形。不同文獻關於 I. javanica 瓶 梗及分生孢子之大小描述不盡相同，其原因可.
(8) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. 139. 33 67. 95. 75 69 52 100 51. 93. 38 36. 18. 99 9 61. 94 73 98. 100. 0.050. 圖 6. 使用 β-tubulin 基因以最大似然法分析 Isaria javanica CAES1 的親緣關係。節點之數字表示分析 1,000 次重複之 bootstrap 值。比例尺代表核苷酸序列置換比率。Paecilomyces marquandii CBS 182.27、Metarhizium flavoviruda BCC7672 及 Metarhizium robertsii ARSEF727 之序列使用作為外群。 Fig. 6. The phylogenetic analysis of Isaria javanica CAES1 using β-tubulin by maximum likelihood method. The numbers at nodes indicate consensus bootstrap values based on 1,000 replications. Scale bar = 0.05 substitution per nucleotide position. Sequences from Paecilomyces marquandii CBS 182.27, Metarhizium flavovirida BCC 7672 and Metarhizium flavovirida ARSEF 727 were used as outgroups.. 能來自菌株差異，例如 Kang et al. (2018) 描 述 2 個 不 同 之 I. javanica 分 離 株， 其 分 生 孢 子 長 度 分 別 為 4.92 μm ± 1.76 μm 和 7.16 μm ± 1.41 μm， 且 彼 此 間 有 顯 著 差 異。 此 外， 不 同培養條件亦可能為造成形態有些微差異之原 因，例如 Mongkolsamrit et al. (2018) 描述之 I.. javanica 瓶梗大小，PDA 上為 9.0 μm × 2.0–2.5 μm，MEA 上則為 5–8 μm × 2–3 μm，分生孢 子大小於 PDA 上為 4.0 μm × 2.0–2.5 μm，MEA 上則為 5.0–6.5 μm × 2.5 μm。此外，I. javanica 之 有 性 世 代 為 Cordyceps javanica， 屬 於 蟲 草 菌 科 (Cordycipitaceae)， 會 於 感 染 之 蟲.
(9) 140. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. (A). (D). 1 mm. (B). 1 mm. (E). 1 mm. 50 μm. (C). 1 mm. 圖 7. Isaria javanica CAES1 感染咖啡果小蠹之菌絲生長及產孢情形。(A–D) 分別為死亡後第 0、1、2、3 d 之蟲體，(E) 為蟲體上產生之產孢構造及孢子。 Fig. 7. Outgrowth and sporulation of Isaria javanica CAES1 on coffee berry borers. (A–D) are cadavers on 0, 1, 2, and 3 d after the coffee berry borer was found dead, and (E) is conidiogenous structures and conidia on the cadaver.. 體上產生圓柱形、橘紅色之子座 (stroma)，上 有子囊殼 (perithecium) (Mongkolsamrit et al. 2018)，但本研究中尚未發現此菌於咖啡果小 蠹蟲體上產生有性世代。 Isaria 屬之形態特徵為輪生的瓶梗，瓶梗 基部膨大，頂端突然變窄，形成一尖端。分生 孢子鏈生，單細胞、透明平滑、近球形或圓柱 形，此些形態特徵與其他相近屬之真菌相同， 因此過去分類十分紊亂 (Mongkolsamrit et al. 2018)。 由 於 用 以 鑑 定 Isaria 的 型 態 特 徵 不 甚 可靠 (尤其是瓶梗及孢子形狀)，且無法分別自 然的分類群 (Luangsa-Ard et al. 2005)，故 DNA 序列為目前鑑定 Isaria spp. 的重要依據，常用. 之 基 因 座 (locus) 包 括 ITS、nuc 28S rDNA、 TEF1、β-tubulin 基因及 RNA polymerase II subunit (RPB1 及 RPB2) 等 (Shimazu & Takatsuka 2010; Gallou et al. 2016; Mongkolsamrit et al. 2018)。本研究使用 ITS、TEF1 及 β-tubulin 基因 進 行 親 緣 關 係 樹 的 重 建， 在 ITS 與 β-tubulin 基因所構築的親緣關係樹中，皆顯示本研究所 分 離 到 的 I. javanica CAES1 被 歸 於 I. javanica 的分支中 (圖 4、圖 6)。其中，TEF1 所重 建 的 親 緣 關 係 樹 中， 雖 然 I. javanica CAES1 仍然被歸類於 I. javanica，但本分支中仍存有 一 支 Isaria fumorsorosea CBS 337.52 ( 圖 5)。 這 與 Kepler et al. (2017) 利 用 小 單 位 核 醣 體.
(10) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. (small subunit; SSU) DNA、大單位核醣體 (large subunit; LSU) DNA、TEF、RBP1 及 RBP 2 所 構築的親緣關係樹中，將 I. fumorsorosea CBS 337.52 和 其 他 I. fumorsorosea 菌 株 歸 於 不 同 分 支、 而 與 I. javanica CBS 134.22 歸 屬 於 同 一 個 分 支 的 情 形 相 同， 顯 示 I. fumorsorosea CBS 337.52 的 部 分 序 列 可 能 與 I. javanica 較 相似。 I. javanica 過去曾於數種寄主上分離到， 包 括 鱗 翅 目 (Lepidoptera) 之 吉 普 賽 舞 蛾 (Lymantria dispar)、棉花夜蛾 (Spodoptera littoralis)，半翅目 (Hemiptera) 之菸草粉蝨 (Bemisia tabaci)、 銀 葉 粉 蝨 (Bemisia argentifolii)、 溫 室 粉 蝨 (Trialeurodes vaporariorum)、 柑 桔 木 蝨 (Diaphorina citri)，以及蛛形綱之節肢動物 等 (Scorsetti et al. 2007; Shimazu & Takatsuka 2010; Chen 2016; Gallou et al. 2016; Mongkolsamrit et al. 2018)。台灣過去曾有於銀葉粉蝨 分 離 到 I. javanica 之 紀 錄 (Chen 2016)， 且 目 前關於 I. javanica 之研究多為應用於粉蝨防治 之研究。本研究首度於台灣之咖啡果小蠹上分 離到此菌，以其分生孢子重新感染咖啡果小蠹. 141. 可使其發病，並可於蟲體表面產生大量分生孢 子 (圖 7)。顯示此菌對咖啡果小蠹具致病性， 且如應用於田間防治咖啡果小蠹，可於田間再 次產生接種源，有機會於田間造成真菌病之流 行，然而實際運用之方式及效果仍須更進一步 研究。因此，未來仍須更進一步評估 I. javanica CAES1 於不同孢子濃度及環境條件下對咖 啡果小蠹之防治效果、研發其大量生產方式及 於田間施用方式及效果等，以提供農民另一環 境友善之防治方法。. 誌謝 本研究感謝林怡岑小姐協助咖啡果小蠹的 飼養及蟲生真菌致病力試驗，呂宜蓁小姐協助 整理親緣關係分類及校對資料，李佳勳先生協 助進行分子鑑定工作，許淑麗小姐及蔡佳達先 生協助菌絲生長速率試驗，國立台灣大學昆蟲 學系保育及演化生物學實驗室曾惠芸助理教授 協助親緣關係樹分析，亦感謝中埔福友咖啡農 場負責人詹曜威先生提供果園進行咖啡果小蠹 採樣及調查。.
(11) 142. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. 附錄 本研究於親緣關係樹重建分析所使用之菌株及序列。 Appendix Reference isolate sequences obtained from GenBank for phylogenetic analyses. GenBank accession numberz Species and isolate number. ITS. TEF1. β-tubulin. Isaria japonica BCC 2821. EU828662. -. AY624242. Isaria japonica BCC 2808. AY624199. -. AY624241. Cordyceps cf. Takaomontana BCC 1409. AY624198. -. AY624240. Isaria tenuipes ARSEF 5135. AY624196. JF416020. AY624234. Isaria tenuipes CBS 994.73. AY624187. Isaria tenuipes CBS 997.73. AY624195. HM161731. AY624233. Isaria tenuipes OSC 111007. -. DQ522349. -. AY624176. -. AY624215. Isaria coleopterora CBS 110.73. AY624177. JQ425689. AY624216. Isaria ghanensis CBS 105.73. AY624185. -. AY624223. Cordyceps cicadae BCMU CS03. AB085888. -. -. Paecilomyces cicadae BCC 2574. AY624175. -. -. Isaria cicadae MRCIF4. EU573331. -. EU604136. Isaria cicadae MRCIF45. EU573332. -. EU604138. Isaria cicadae MRCIF8. EU573333. -. EU604137. Isaria cicadae ARSEF 7260. HQ880826. HQ881017. -. Isaria cateniannulata ARSEF 6242. GU734760. GU734759. -. Isaria coleopterora CBS 102.73. Isaria cateniannulata IP 67. -. GU734753. Isaria cateniannulata ARSEF 6240. GU734761. GU734758. -. Paecilomyces cateniannulata CBS 152.83. AY624172. JQ425687. AY624211. Isaria fumosorosea ARSEF 322. -. -. EF585301. Isaria fumosorosea CBS 375.70. AY624183. HM161736. AY624221. Isaria fumosorosea CBS 244.31. AY624182. JQ425690. AY624220. Isaria fumosorosea CBS 107.10. AY624184. HM161735. AY624222. Isaria fumosorosea CBS 337.52. EF411219. MF416500. EF411239. Isaria fumosorosea BCC 20180. JQ425655. JQ425669. -. Isaria javanica BCC 19523. -. JQ425670. -. Isaria javanica BCC 28596. JQ425661. JQ425679. -. Isaria javanica BCC 28597. JQ425662. JQ425680. -. Isaria javanica BCC 26304. JQ425660. JQ425677. -. Isaria javanica CBS 134.22. DQ403723. JQ425683. EF585304. Isaria javanica CBS 174.25. MH854836. EF585302. Isaria javanica ARSEF 5321. FJ899919. Isaria javanica ARSEF 3577. FJ899914. Isaria javanica ARSEF 3776. FJ899916. Isaria javanica ARSEF 5259. -. -. FJ899918. Isaria javanica ARSEF 3778. -. -. FJ899917. Isaria javanica ARSEF 5806. -. -. EF585306. Isaria javanica ARSEF 3593. -. -. FJ899915. Isaria javanica ARSEF 3573. -. -. FJ899913.
(12) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. 143. 附錄 本研究於親緣關係樹重建分析所使用之菌株及序列 (續)。 Appendix Reference isolate sequences obtained from GenBank for phylogenetic analyses. (continued) GenBank accession numberz Species and isolate number. ITS. TEF1. β-tubulin. Isaria javanica CAES1 (This study). MN094459. MN215883. MN215882. Isaria cateniobliqua ARSEF 6283. GU734763. GU734749. -. Paecilomyces cateniobliquus CBS 153.83. AY624173. JQ425688. AY624212. Isaria amoenerosea CBS 107.73. AY624168. MF416494. AY624207. HM161732. AY624208. Isaria amoenerosea CBS 729.73 Isaria amoenerosea ARSEF 744. EU553281. -. -. Isaria farinosa CBS 111113. AY624181. MF416499. AY624219. Isaria farinosa CBS 541.81. AY624180. JQ425686. AY624218. Isaria farinosa CBS 240.32. AY624178. JQ425684. -. Isaria farinosa CBS 262.58. AY624179. JQ425685. AY624217. Evlachovaea kintrischica ARSEF 8058. GU734764. GU734750. -. Evlachovaea kintrischica ARSEF 7218. EU553278. GU734751. -. -. GU734746. -. Hirsutella sp. OSC 128575. JN049845. EF469064. -. Paecilomyces marquandii CBS 182.27. AY624193. EF468793. AY624229. Metarhizium flavoviride BCC 7672. AY624203. -. AY624248. Metarhizium flavoviride BCC 11959. -. -. AY624249. HQ331453. DQ463994. -. Evlachovaea sp. ARSEF 1576. Metarhizium robertsii ARSEF 727 z. ITS: internal transcribed spacer; TEF1: translation elongation factor-1α gene. Boldface type indicates ex-type specimens..
(13) 144. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. 引用文獻 Aristizábal, L. F., O. Lara, and S. P. Arthurs. 2012. Implementing an integrated pest management program for coffee berry borer in a specialty coffee plantation in Colombia. J. Integr. Pest Manag. 3:G1–G5. doi:10.1603/IPM11006 Aristizábal, L. F., A. E. Bustillo, and S. P. Arthurs. 2016. Integrated pest management of coffee berry borer: Strategies from Latin America that could be useful for coffee farmers in Hawaii. Insects 7:6. doi:10.3390/insects7010006 Balakrishnan, M. M. and R. N. Prakash. 2014. Infectivity of ten Metarhizium anisopliae isolates to the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae). J. Entomol. Zool. Studies 2:246– 249. Brun, L. O., C. Marcillaud, V. Gaudichon, and D. M. Suckling. 1990. Monitoring of endosulfan and lindane resistance in the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) in New Caledonia. Bull. Entomol. Res. 80:129–135. doi:10.1017/S0007485300013341 Brun, L. O., C. Marcillaud, V. Gaudichon, and D. M. Suckling. 1994. Cross resistance between insecticides in coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) from New Caledonia. Bull. Entomol. Res. 84:175–178. doi:10.1017/ S0007485300039651 Bustillo, A. E., R. Cardenas, and F. J. Posada. 2002. Natural enemies and competitors of Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in Colombia. Neotrop. Entomol. 31:635–639. doi:10.1590/S1519566X2002000400018 Cabanillas, H. E., J. H. de Leon, R. A. Humber, K. D. Murray, and W. A. Jones. 2013. Isaria poprawskii sp. nov. (Hypocreales: Cordycipitaceae), a new entomopathogenic fungus from Texas affecting sweet potato whitefly. Mycoscience 54:158–169. doi:10.1016/j.myc.2012.09.009 Chen, Y. 2016. The efficacy of the entomopathogenic fungus, Isaria javanica (Ascomycota: Hypocreales), as a biocontrol agent for management of the whitefly, Bemisia argentifolii (Bellows & Perring). Master Thesis, Department of Entomology, National Chung Hsing University. Taichung. Taiwan. 48 pp. (in Chinese with English abstract) Chu, Y. F., M. H. Yang, S. F. Chang, P. H. Chen, and T. C. Wang. 2017. The composition of life stages of coffee berry borer (Scolytidae: Hypothenemus hampei) in the coffee berry and the control efficacy of different insecticides for the pest. J. Taiwan Agri. Res. 66:318–325. doi:10.6156/JTAR/2017.06604.06. Damon, A. 2000. A review of the biology and control of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae). Bull. Entomol. Res. 90:453– 465. doi:10.1017/S0007485300000584 Darriba, D., G. L. Taboada, R. Doallo, and D. Posada. 2012. jModelTest 2: More models, new heuristics and parallel computing. Nat. Methods 9:772. doi:10.1038/nmeth.2109 De La Rosa, W., R. Alatorre, J. Trujillo, and J. F. Barrera. 1997. Virulence of Beauveria bassiana (Deuteromycetes) strains against the coffee berry borer (Coleoptera: Scolytidae). J. Econ. Entomol. 90:1534–1538. doi:10.1093/jee/90.6.1534 De La Rosa, W., R. Alatorre, J. F. Barrera, and C. Toriello. 2000. Effect of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Deuteromycetes) upon the coffee berry borer (Coleoptera: Scolytidae) under field conditions. J. Econ. Entomol. 93:1409–1414. doi:10.1603/0022-0493-93.5.1409 De La Rosa-Reyes, W., J. L. Godinez-Aguilar, and R. Alatorre-Rosas. 1995. Biological activity of five strains of Metarhizium anisopliae, upon the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Col.: Scolytidae). Entomophaga 40:403–412. doi:10.1007/ BF02373728 Gallou, A., M. G. Serna-Domínguez, A. M. Berlanga-Padilla, M. A. Ayala-Zermeño, M. A. Mellín-Rosas, R. Montesinos-Matías, and H. C. Arredondo-Bernal. 2016. Species clarification of Isaria isolates used as biocontrol agents against Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae) in Mexico. Fungal Biol. 120:414– 423. doi:10.1016/j.funbio.2015.11.009 Glass, N. L. and G. C. Donaldson. 1995. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl. Environ. Microbiol. 61:1323–1330. Kang, B. R., J. H. Han, J. J. Kim, and Y. C. Kim. 2018. Dual biocontrol potential of the entomopathogenic fungus, Isaria javanica, for both aphids and plant fungal pathogens. Mycobiology 46:440–447. doi:10 .1080/12298093.2018.1538073 Kepler, R. M., J. J. Luangsa-ard, N. L. Hywel-Jones, C. A. Quandt, G. H. Sung, S. A. Rehner, M. C. Aime, T. W. Henkel, T. Sanjuan, R. Zare, M. Chen, Z. Li, A. Y. Rossman, J. W. Spatafora, and B. Shrestha. 2017. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus 8:335–353. doi:10.5598.imafungus.2017.08.02.08 Kumar, S., G. Stecher, M. Li, C. Knyaz, and K. Tamura. 2018. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 35:1547–1549. doi:10.1093/molbev/msy096.
(14) 咖啡果小蠹之 Isaria javanica. Larkin, M. A., G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A. McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I. M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J. D. Thompson, T. J. Gibson, and D. G. Higgins. 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23:2947– 2948. doi:10.1093/bioinformatics/btm404 Liang, Y. P. and T. C. Wang. 2018. Preliminary study of virulence of Beauveria bassiana isolates from Taiwan against the coffee berry borer (Coleoptera: Scolytidae). p.85. in: The 39th Annual Meeting of Taiwan Entomological Society. October 20–21, 2018. Tainan, Taiwan. Taiwan Entomol. Soc. Publ., Taipei. (in Chinese) Luangsa-Ard, J. J., N. L. Hywel-Jones, L. Manoch, and R. A. Samson. 2005. On the relationships of Paecilomyces sect. Isarioidea species. Mycol. Res. 109:581–589. doi:10.1017/S0953756205002741 Mongkolsamrit, S., W. Noisripoom, D. Thanakitpipattana, T. Wutikhun, J. W. Spatafora, and J. Luangsa-Ard. 2018. Disentangling cryptic species with isaria-like morphs in Cordycipitaceae. Mycologia 110:230– 257. doi:10.1080/00275514.2018.1446651 O’Donnell, K. and E. Cigelnik. 1997. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous. Mol. Phylogenet. Evol. 7:103–116. doi:10.1006/ mpev.1996.0376 Rehner, S. A. and E. Buckley. 2005. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: Evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia 97:84–98. doi:1 0.1080/15572536.2006.11832842 Samson, R. A. 1974. Paecilomyces and some allied hyphomycetes. Stud. Mycol. 6:1–119. Samuels, R. I., R. C. Pereira, and C. A. T. Gava. 2002. Infection of the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) by Brazilian isolates of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Biocontrol Sci. Technol. 12:631–635. doi:10.1080/0958315021000016298 Scorsetti, A. C., R. A. Humber, C. De Gregorio, and C. C. L. Lastra. 2007. New records of entomopathogenic fungi infecting Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum, pests of horticultural crops, in Argentina. Biocontrol 53:787. doi:10.1007/s10526-0079118-9 Shimazu, M. and J. Takatsuka. 2010. Isaria javanica (anamorphic Cordycipitaceae) isolated from gypsy moth larvae, Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae), in Japan. Appl. Entomol. Zool. 45:497– 504. doi:10.1303/aez.2010.497. 145. Tzean, S. S., L. S. Hsieh, and W. J. Wu. 1997. Atlas of Entomopathogenic Fungi from Taiwan. Council of Agriculture, Executive Yuan. Taipei, Taiwan. 214 pp. Vega, F. E., G. Mercadier, and P. F. Dowd. 1999. Fungi associated with the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae). p.229–238. in: Proceedings of the 18th International Scientific Colloquium on Coffee. August 2–6, 1999. Helsinki, Finland. Association for Science and Information on Coffee, Paris. Vega, F. E., R. A. Franqui, and P. Benavides. 2002. Scientific note: The presence of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei, in Puerto Rico: Fact or fiction? J. Insect Sci. 2:13. doi:10.1093/jis/2.1.13 Vega, F. E., F. Posada, M. C. Aime, M. Pava-Ripoll, F. Infante, and S. A. Rehner. 2008. Entomopathogenic fungal endophytes. Biol. Control 46:72–82. doi:10.1016/j.biocontrol.2008.01.008 Vega, F. E., F. Infante, A. Castillo, and J. Jaramillo. 2009. The coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae): A short review, with recent findings and future research directions. Terr. Arthropod Rev. 2:129–147. doi:10.1163/18749 8209X12525675906031 Vera, J. T., E. C. Montoya, P. Benavides, and C. E. Góngora. 2011. Evaluation of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as a control of the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) emerging from fallen, infested coffee berries on the ground. Biocontrol Sci. Technol. 21:1–14. doi:10.1080/09583157.2010. 517605 Wang, H., M. Qi, and A. J. Cutler. 1993. A simple method of preparing plant samples for PCR. Nucleic Acids Res. 21:4153–4154. doi:10.1093/nar/21.17.4153 Wraight, S. P., S. Galaini-Wraight, R. L. Howes, L. A. Castrillo, R. I. Carruthers, R. H. Smith, T. K. Matsumoto, and L. M. Keith. 2018a. Prevalence of naturally-occurring strains of Beauveria bassiana in populations of coffee berry borer Hypothenemus hampei on Hawai’i Island, with observations on coffee plant-H. hampei-B. bassiana interactions. J. Invertebr. Pathol. 156:54–72. doi:10.1016/j. jip.2018.07.008 Wraight, S. P., S. Galaini-Wraight, L. A. Castrillo, M. H. Griggs, L. M. Keith, and T. K. Matsumoto. 2018b. Collection, isolation, in vitro culture, and laboratory transmission of Hirsutella eleutheratorum (Hypocreales: Ophiocordycipitaceae) from coffee berry borer on Hawai‘i Island. J. Invertebr. Pathol. 157:53–66. doi:10.1016/j.jip.2018.08.002.
(15) 146. 台灣農業研究 第 69 卷 第 2 期. Identification and Pathogenicity of Isaria javanica CAES1 Isolated from the Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei) in Taiwan Yu-Ping Liang1 and Tai-Chuan Wang1,*. Abstract Liang, Y. P. and T. C. Wang. 2020. Identification and pathogenicity of Isaria javanica CAES1 isolated from the coffee berry borer (Hypothenemus hampei) in Taiwan. J. Taiwan Agric. Res. 69(2):132–146.. An isolate of entomopathogenic fungi, CAES1, was isolated from a naturally infected coffee berry borer (Hypothenemus hampei; CBB) in a coffee field in Taiwan. Colonies of CAES1 were white to pale-yellow or grey. Mycelia could grow in range of 10℃ to 30℃, with the optimal temperature at 25℃, ranging from 10℃ to 30℃. The conidiophores formed branches with phialides in whorls of 1 to 4, with phialides 3.7–5.0–6.4 μm × 1.9–3.0–3.5 µm, and conidia forming in chain, 2.7–3.8–5.4 μm × 1.2–1.6–2.1 μm. CAES1 was identified as Isaria javanica based on morphology and phylogenetic analysis of the sequences of ribosomal internal transcribed spacer (ITS), translation elongation factor-1α (TEF1) and β-tubulin. The cumulative mortality rate of CBB was 100% on the 7th day after treated with conidia of I. javanica CAES1. I. javanica CAES1 sporulated on the surface of CBB 2.77 d ± 0.17 d after CBB died. This is the first record of I. javanica from CBB in Taiwan. It is suggested that I. javanica CAES1 is pathogenetic to the CBB and could be a potential biocontrol agent against CBB in the future. Key words: Coffee berry borer (Hypothenemus hampei), Isaria javanica, Taiwan, Biological control.. Received: September 9, 2019; Accepted: December 23, 2019. * Corresponding author, e-mail: [email protected] 1 Assistant Research Fellows, Department of Plant Protection, Chiayi Agricultural Experiment Branch, Taiwan Agricultural Research Institute, Chiayi, Taiwan, ROC..
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