Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4318
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(2) 謝誌 在研究所學習的兩年，很快都過去了，雖然覺得還有很多東西沒有學習 完整，但是在這些日子裡所得到的，的確也讓我此後人生將有所改變。不管 是專業知識，還是人際關係上的學習，指導教授李宗徽 博士都不遺餘力的 指導，深深佩服老師在做人處事上的修為，這都是讓我要更加要學習的部 分。同時，老師上許多方面上的幫助與包容，也使得我能夠順利的完成學業， 在此由衷的感謝指導教授李宗徽 博士。另外，感謝立德大學簡文達 博士， 在海洋微生物實驗上教導了很多，並且給我很多建議與協助，也讓我對於實 驗總是充滿興趣與熱誠。更要感謝口試委員盧重光 博士的悉心指正，讓本 論文可以更加得以完整與正確。此外，也要感謝台大海洋所謝文陽 博士提 供了機會讓我可以在您的實驗室裡學習，並獲得很多好的經驗。 而在這兩年裡，要謝謝與我互相扶持的生藥所同學們，在一起學習的過 程中，共同分享甘苦。尤其是台大海研所的同學們，旻暁、桓昌、建勳與思 妤學姊，讓我在研究室裡，感受到許多溫暖與歡樂。還有研究室的學妹們， 雅菁與瑜真所給予的適時支援與陪伴。另外要感謝北醫共儀中心王淑慧老師 與台大貴儀中心黃守齡小姐，在光譜圖譜的實驗上給予我許多幫助，讓我能 夠順利的將論文完成。 最後，感謝家裡的父母親無悔的付出，願意讓我繼續往上學習，提供我 在經濟與精神上的支持，得以讓我完成這個階段的學業。此外，要感謝的人 還太多，沒辦法一一的詳述，我能附上我最大誠意感謝這兩年幫助過我的師 長與朋友們，謝謝各位的鼎力幫忙。. 李翊弘. 1. 於北醫生藥所. 2008 7 月.
(3) 中文摘要 本研究利用瓊脂擴散法 (disc agar diffusion method) 來篩選105株台灣 海洋細菌，藉以尋找出對抗藥性金黃色葡萄球菌 (Penicillin G-resistant Staphylococcus aureus, ATCC 11631 ) 具有抑制活性的海洋細菌。所得結果根 據 抑 菌 圈 的 大 小 判 斷 其 中 2 株 具 較 明 顯 的 抑 制 活 性 ， 分 別 為 #M1B (Pseudomonas aeruginosa) 和#AW52 (Rhodobacteraceae)。此外，所有海洋菌 株萃取液在血管舒張活性 (vasorelaxing activities) 上，利用Phenylephrine誘 發大鼠 (Sprague-Dawley Rat) 胸主動脈血管收縮，再以細菌醱酵液萃取物進 行處理，得知其中2株菌之萃取物具有抑制血管收縮的活性，分別為#M1B (P. aeruginosa) 和#MO6 (B. firmus)。隨後將上述三株海洋菌以PY培養基擴大培 養，針對其代謝物進行一系列的分析、分離、純化與結構解析，計分離出15 個化合物，包括: 兩個喹林生物鹼 (quinoline alkaloide)、兩個吩嗪生物鹼 (phenazine alkaloids)、五個芳香胺衍生物 (phenylamides derivatives) 、六個 環狀雙胺基酸. (diketopiperazines) 和. 2- 胺 基 苯 乙 酯 (2-aminophenyl. acetate)。分別為: 2-n-heptylquinol-4-one (1)、2-aminophenyl acetate (2)、 cyclo-L-Pro-L-Phe (3)、cyclo-L-Tyr-L-Pro (4)、phenazine-1-carboxamide (5)、 hydroxyphenazine. (6). 、. N-(2’-Phenylethyl)isobutyramide. (7). 、. 2-Ethyl-N-(2’-phenethyl)butyramide (8)、2-Methyl-N-(2’-phenylethyl)butyramide (9)、N-(2’-phenylethyl)isovaleramide (10)、2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide 2.
(4) (11)、cyclo-L-Pro-L-Ile (12)、cyclo-L-Pro-L-Val (13)、cyclo-L-Pro-L-Leu (14) 和 cyclo-L-Pro-L-Met sulfoxide (15)，其中cyclo-L-Pro-L-Met sulfoxide (15) 是過去 未曾報導過的新化合物。這些天然物純質更進一步進行抗菌活性試驗，結果 顯示化合物1、5、6和11針對抗藥性金黃色葡萄球菌有明顯的抑制活性，其 最小抑制濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 分別為64、36、36和 24 μg/ml。另外，細胞毒性檢測的結果顯示，化合物1和11具有顯著的細胞毒 性，其對於 NPC-tw01、HCT-116、Jurkat和H661等四株癌細胞的半抑制濃度 (IC50) 範圍介於 7.1 ~ 14.7 μM。. 3.
(5) Abstract In this study, 105 strains of marine bacteria isolated from Taiwan were cultured for the screening of their antibacterial activities by disc agar diffusion method. Of these bacterial strains monitored, 2 strains exhibited antibacterial activities. Among them, bacterial strains M1B (Pseudomonas aeruginosa) and AW52 (Rhodobacteraceae) showed significant antibacterial activities toward Penicillin G-resistant Staphylococcus aureus. (ATCC 11631). Besides, all the marine bacterial extracts on vasorelaxing activities of SD rats induced by phenylephrine were also examined. Of these bacterial strains monitored, strains M1B (P. aeruginosa) and MO6 (B. firmus) exhibited vasorelaxing activities. Based on this findings, the 3 bacterial strains were mass cultured using PY broth. Then, the bioactive constituents were obtained by a series of chromatographic separation, and characterized by spectral analysis. Totally 15 compounds including 2 quinoline alkaloids, 2 phenazine alkaloids, 4 phenylamide derivates, 6 diketopiperazines and a 2-aminophenyl acetate were isolated and identified . Their structures were elucidated to be 2-n-heptylquinol-4-one (1), 2-aminophenyl acetate (2), cyclo-L-Pro-L-Phe (3), cyclo-L-Tyr-L-D-Pro (4), hydroxyphenazine (5), phenazine-1-carboxamide. (6),. N-(2’-Phenylethyl)isobutyramide. (7),. 2-Ethyl-N-(2’-phenethyl)butyramide (8), 2-Methyl-N-(2’-phenylethyl)butyramide 4.
(6) (9), N-(2’-phenylethyl)isovaleramide (10), 2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide (11), cyclo-L-Pro-L-Ile (12), cyclo-L-Pro-L-Val (13), cyclo-L-Pro-L-Leu (14), and cyclo-L-Pro-L-Met sulfoxide (15). Among them, cyclo-L-Pro-L-Met sulfoxide (15) was isolated for the first time from the natural source. The bioactivities of all the pure entities were further evaluated. The results of biological tests indicated that 1, 5, 6 and 11 exhibited strong antibacterial activity toward resistant S. aureus, with minimum inhibitory concentrations (MIC) of 64, 36, 36 and 24 μg/ml, respectively. Additionally,. 1 and 11 showed significant cytotoxic activitives. against NPC-tw01, HCT-116, Jurkat, and H661 cancer cell lines, with an IC50 values from 7.1 to 14.7 μM. ‧. 5.
(7) 總目錄 謝誌.............................................................................................................................................. 0 中文摘要 ..................................................................................................................................... 2 Abstract....................................................................................................................................... 4 總目錄 ......................................................................................................................................... 6 表目錄 ......................................................................................................................................... 8 圖目錄 ....................................................................................................................................... 10 縮寫............................................................................................................................................ 14 壹 緒論與研究目的.................................................................................................................. 15 1.1 海洋細菌之活性天然物的研究發展.......................................................................... 15 1.2 三種海洋細菌天然物之文獻回顧............................................................................. 31 貳、實驗結果與討論................................................................................................................ 39 2.1.1 2-n-heptylquinol-4-one (1) 之結構解析....................................................... 45 2.1.2 2-aminophenyl acetate (2) 之結構解析........................................................ 52 2.1.3 cyclo- L-Pro- L-Phe (3) 之結構解析 ................................................................ 56 2.1.4 cyclo-L-Tyr-L-Pro (4) 之結構解析................................................................... 63 2.1.5 Hydroxyphenazine (5) 的結構解析 ................................................................ 68 2.1.6 Phenazine-1-carboxamide (6) 之結構解析 ..................................................... 74 2.1.7 N-(2’-Phenylethyl)isobutyramide (7) 之結構解析 .......................................... 80 2.1.8 2-Ethyl-N-(2’-phenethyl)butyramide (8) 之結構解析..................................... 87 2.1.9 2-Methyl-N-(2’-phenylethyl)butyramide (9) 之結構解析............................... 92 2.1.10 N-(2’-phenylethyl)isovaleramide (10) 之結構解析....................................... 96 2.1.11 2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide (11) 之結構解析............................. 104 2.1.12 cyclo-L-Pro-L- Leu (12) 之結構解析........................................................... 110 2.1.13 cyclo-L-Pro-L-Val (13) 之結構解析............................................................. 114 2.1.14 cyclo-L-Pro-L-Ile (14) 之結構解析.............................................................. 118 2.1.15 cyclo-L-Pro-L-Met sulfoxide (15) 之結構解析............................................ 123 2.2 氨基酸水解分析結果................................................................................................ 132 2.3 抑制抗藥性金黃色葡萄球菌生長之試驗結果........................................................ 133 2.3.1 105 株海洋細菌初篩結果........................................................................... 133 2.3.2 抑制創傷弧菌及金黃色葡萄球菌生長之試驗結果.................................... 134 2.4 細胞毒性測試結果................................................................................................... 136 2.5 討論........................................................................................................................... 137 參、實驗部份.......................................................................................................................... 139 3.1 儀器設備與試劑....................................................................................................... 139 3.2 培養基配置............................................................................................................... 141 6.
(8) 3.3 抑菌活性測試 : ....................................................................................................... 142 3.3.1 瓊脂紙錠擴散試驗 (disc agar-diffusion test) .............................................. 142 3.3.2 海洋細菌活性成分抑制抗藥性金黃色葡萄球菌之濃度測試.................... 143 3.4 海洋菌株之萃取與分離............................................................................................ 144 3.4.1 #M1B 之成份分離與純化 ............................................................................. 145 3.4.2 #MO6 之成份分離與純化 ............................................................................. 147 3.5 胺基酸水解分析....................................................................................................... 151 3.6 各成分之物理數據................................................................................................... 152 參考文獻.................................................................................................................................. 160. 7.
(9) 表目錄 表 1、自不同環境單離出之海洋菌株及其活性代謝產物的文獻整理。 17 表 2、綠膿桿菌所分離得到的天然物之文獻整理。 ............................... 31 表 3、1H- and 13C-NMR data of 1 ............................................................... 47 表 4、1H- and 13C-NMR data of 2 ............................................................... 53 表 5、1H- and 13C-NMR data of 3 ............................................................... 58 表 6、1H- and 13C-NMR data of 4 ............................................................... 64 表 7、1H- and 13C-NMR data of 5 ............................................................... 69 表 8、1H- and 13C-NMR data of 6 ............................................................... 75 表 9、1H- and 13C-NMR data of 7 ............................................................... 81 表 10、1H- and 13C-NMR data of 8 ............................................................. 88 表 11、1H- and 13C-NMR data of 9 ............................................................. 93 表 12、1H- and 13C-NMR data of 10 ........................................................... 98 表 13、1H- and 13C-NMR data of 11.......................................................... 106 表 14、1H- and 13C-NMR data of 12 ..........................................................111 表 15、1H- and 13C-NMR data of 13 ......................................................... 115 表 16、1H- and 13C-NMR data of 14 ......................................................... 119 表 17、1H- and 13C-NMR data of 15 ......................................................... 125 表 18、胺基酸分析結果。 ....................................................................... 132. 8.
(10) 表 19、海洋細菌菌液萃取液汁抗菌活性初篩結果。 ........................... 133 表 20、化合物 1 ~ 15 對金黃色葡萄球菌之最小抑制濃度 ................. 135 表 21、化合物 1~5 及 7~11 抑制人類多種癌細胞生長之 IC50 ............. 136 表 22、本研究中所使用之各種培養基配方。 ....................................... 141 表 23、#M1B 乙酸乙酯萃出物以膠濾管柱層析分離結果.................... 145 表 24、#MO6 乙酸乙酯萃出物以膠濾管柱層析分離結果.................... 147 表 25、#AW52 乙酸乙酯萃出物以膠濾管柱層析分離結果.................. 149. 9.
(11) 圖目錄 圖 1、 #MIB 菌株培養液之乙酸乙酯萃取物分離流程......................... 40 圖 2、 #MO6 菌株培養液之乙酸乙酯萃取物分離流程........................ 41 圖 3、 #AW52 菌株培養液之乙酸乙酯萃取物分離流程...................... 41 圖 4、化合物 1 之電噴灑電離質譜。 ...................................................... 47 圖 5、化合物 1 之紅外光譜。 .................................................................. 48 圖 6、化合物 1 之紫外光譜。 .................................................................. 48 圖 7、化合物 1 之氫譜。 .......................................................................... 49 圖 8、化合物 1 之碳譜。 .......................................................................... 49 圖 9、化合物 1 之 COSY 圖譜。.............................................................. 50 圖 10、化合物 1 之 HMBC 圖譜............................................................... 51 圖 11、化合物 2 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 53 圖 12、化合物 2 之紅外光譜。 ................................................................ 54 圖 13、化合物 2 之紫外光譜。 ................................................................ 54 圖 14、化合物 2 之氫譜。 ........................................................................ 55 圖 15、化合物 2 之碳譜。 ........................................................................ 55 圖 16、化合物 3 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 58 圖 17、化合物 3 之紅外光譜。 ................................................................ 59 圖 18、化合物 3 之紫外光譜。 ................................................................ 59. 10.
(12) 圖 19、化合物 3 之氫譜。 ........................................................................ 60 圖 20、化合物 3 之碳譜。 ........................................................................ 60 圖 21、化合物 3 之 COSY 圖譜。............................................................ 61 圖 22、化合物 3 之 HMBC 圖譜。........................................................... 62 圖 23、化合物 4 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 65 圖 24、化合物 4 之紅外光譜。 ................................................................ 65 圖 25、化合物 4 之紫外光譜。 ................................................................ 66 圖 26、化合物 4 之氫譜。 ........................................................................ 66 圖 27、化合物 4 之碳譜。 ........................................................................ 67 圖 28、化合物 5 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 70 圖 29、化合物 5 之紅外光譜。 ................................................................ 70 圖 30、化合物 5 之紫外光譜。 ................................................................ 71 圖 31、化合物 5 之氫譜。 ........................................................................ 71 圖 32、化合物 5 之碳譜。 ........................................................................ 72 圖 33、化合物 5 之 COSY 圖譜。............................................................ 72 圖 34、化合物 5 之 HMBC 圖譜。........................................................... 73 圖 35、化合物 6 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 76 圖 36、化合物 6 之紅外光譜。 ................................................................ 76 圖 37、化合物 6 之紫外光譜。 ................................................................ 77. 11.
(13) 圖 38、化合物 6 之氫譜。 ........................................................................ 78 圖 39、化合物 6 之碳譜。 ........................................................................ 79 圖 40、化合物 7 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 82 圖 41、化合物 7 之紅外光譜。 ................................................................ 82 圖 42、化合物 7 之紫外光譜。 ................................................................ 83 圖 43、化合物 7 之氫譜。 ........................................................................ 83 圖 44、化合物 7 之碳譜。 ........................................................................ 84 圖 45、化合物 7 之 COSY 圖譜。............................................................ 85 圖 46、化合物 7 之 HMBC 圖譜。........................................................... 86 圖 47、化合物 8 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 89 圖 48、化合物 8 之紅外光譜。 ................................................................ 89 圖 49、化合物 8 之紫外光譜。 ................................................................ 90 圖 50、化合物 8 之氫譜。 ........................................................................ 90 圖 51、化合物 8 之碳譜。 ........................................................................ 91 圖 52、化合物 9 之電噴灑電離質譜。 .................................................... 94 圖 53、化合物 9 之紅外光譜。 ................................................................ 94 圖 54、化合物 9 之紫外光譜。 ................................................................ 95 圖 55、化合物 9 之氫譜。 ........................................................................ 95 圖 56、化合物 10 之電噴灑電離質譜。 .................................................. 98. 12.
(14) 圖 57、化合物 10 之紅外光譜。 .............................................................. 99 圖 58、化合物 10 之紫外光譜。 .............................................................. 99 圖 59、化合物 10 之氫譜。 .................................................................... 100 圖 60、化合物 10 之碳譜。 .................................................................... 101 圖 61、化合物 10 之 COSY 圖譜。........................................................ 102 圖 62、化合物 10 之 HMBC 圖譜。....................................................... 103 圖 63、化合物 11 之電噴灑電離質譜。 ................................................ 106 圖 64、化合物 11 之紅外光譜。............................................................. 107 圖 65、化合物 11 之紫外光譜。............................................................. 107 圖 66、化合物 11 之氫譜。..................................................................... 108 圖 67、化合物 11 之碳譜。..................................................................... 109 圖 68、化合物 12 之電噴灑電離質譜。 ................................................ 112 圖 69、化合物 12 之紅外光譜。 ............................................................ 112 圖 70、化合物 12 之氫譜。 .................................................................... 113 圖 71、化合物 12 之碳譜。 .................................................................... 113 圖 72、化合物 13 之電噴灑電離質譜。 ................................................ 116 圖 73、化合物 13 之紅外光譜。 ............................................................ 116 圖 74、化合物 13 之氫譜。 .................................................................... 117 圖 75、化合物 13 之碳譜。 .................................................................... 117. 13.
(15) 圖 76、化合物 14 之電噴灑電離質譜。 ................................................ 120 圖 77、化合物 14 之紅外光譜。 ............................................................ 120 圖 78、化合物 14 之氫譜。 .................................................................... 121 圖 79、化合物 14 之碳譜。 .................................................................... 122 圖 80、化合物 15 之電噴灑電離質譜。 ................................................ 126 圖 81、化合物 15 之紅外光譜。 ............................................................ 126 圖 82、化合物 15 之氫譜。 .................................................................... 127 圖 83、化合物 15 之碳譜。 .................................................................... 128 圖 84、化合物 15 之 COSY 圖譜。........................................................ 129 圖 85、化合物 15 之 HMBC 圖譜。....................................................... 130 圖 86、化合物 15 之 HSQC 圖譜。........................................................ 131 圖 87、化合物 15 的兩個立體異構物。 ................................................ 131. 縮寫 COSY ESI/MS HMBC HSQC NOESY. Correlation Spectroscopy Electrospray Ionization Mass Spectrometry 1 H-Detected Heteronuclear Mutiple-Bond Coherence 1 H-Detected Heteronuclear Single-Quantum Coherence Nuclear Overhauser and Enhancement Spectroscopy. 14.
(16) 壹 緒論與研究目的 1.1 海洋細菌之活性天然物的研究發展 在現今既有的醫療用藥裡，據統計約有一半是開發自天然資源，足見天 然物在未來新藥開發上仍扮演重要的角色，其中由海洋中所找到的天然物更 1. 是具有高度的發展潛力 。綜觀過去相關於天然物研究的文獻顯示，由海洋 生物所得到的天然物與自陸生生物所得到的在化學結構上常存有大的差 異，推究其原因可能是由於海洋的高壓、高鹽和低溫環境下，生物體經長期 的演化，發展出獨特的代謝系統，以因應週遭環境的改變，使海洋生物得以 生存。自 1976 年首次由 Ruggieri 提出，海洋生物可望成為新藥來源的概念， 此後陸續有不少文獻指出從海洋裏所提萃出的天然物，具有非常強效的生物 2. 3. 4. 5. 活性，包括 : 抗菌 、抗腫瘤 、抗發炎 和抗瘧疾 。近年來，新的證據顯 示，在已知的海洋天然物中，多種結構較為特殊且具有強生理活性的化合 物，如 : 河豚毒素 (Tetrodotoxin, TTX)(1)、海葵毒素 (Palytoxin)(2)、黑海 綿酸 (okadaic acid)(3)、星孢菌素 (Staurosporine)(4) 和嘔吐毒素 (cereulide)(5) 等均是由海洋微生物所得到. 6, 7, 8, 9, 10, 11. ，逐見海洋微生物應是天然物研究中. 另一重要的標的。而在海洋中約有 200 萬到 2 億種微生物，平均由海平面每 往下 10 平方公尺，即有 10 萬種微生物存在。有些細菌會附著、共生於海洋 的動植物體表或腸道內。儘管有許多海洋微生物是由陸地上經由河水、雨水 或空氣傳播到海洋中，但由於海洋環境的特殊性就造就了海洋微生物高度的 15.
(17) 多樣性，也代謝出更多不同於陸地的特殊產物。 在過去，海洋微生物的研究發展很緩慢，探究其原因為海洋資源的多樣 性、鑑種的不易與採集技術上的困難。但近幾年來，由於生物技術的發展迅 速，使得在微生物的鑑定與保種上得以更加簡易方便，同時天然物分離與結 構鑑定的技術也提升不少，讓一些存在於海洋微生物中極其微量的化合物得 以被發現，再加上新的海洋生物技術與醱酵工程、細胞工程等知識的持續快 速累積，對於大量培育海洋微生物作為藥源的成功機會又更加提升。鑑於 此，對於這些存在於特殊環境的微生物，以及更多具有新穎代謝產物能力的 菌種，將會被陸續發掘出來。 已知由海洋微生物所得到的次級代謝物中，其化學結構也存在著高度的 多樣性，包括了萜類 (terpene)、胜肽類 (peptide)、生物鹼 (alkaloid)、巨環內酯類 (macrolide) 與聚醚 (polyether) 類等。自 1966 年由 Burkholder 由海洋假單胞桿菌 (Pseudomonas) 分離到抗生素吡咯尼林 (Pyrrolnitrin)(6) 後 12，由海洋微生物去尋找抗癌藥物的研究才被科學家們所 正視。接著陸續由海底污泥、海洋動植物體表及其腸胃中分離得到一些具有 抗菌、抗發炎和抗癌的海洋細菌 (表 1)。其中較顯著的是已上市的一種抗菌 劑，是由黃桿菌屬 (Flavobacterium) 所得到的，這株海洋細菌所產生的一種 胞外多醣 Marinactan，對於抑制癌細胞生長有很強的活性，可以完全抑制轉 移腫瘤細胞的生長，延長壽命，並且在體外有能刺激淋巴細胞轉化作用. 16.
(18) (biotransformation) 及活化巨噬細胞 (macrophage) 的能力 9；由海底泥砂分 離得到海洋細菌 Alteromonas sp.得到生物鹼 Alteramide A (7)，是一個新型的 內醯胺 (Lactam)，具有抗 P388 白血病、L1210 淋巴瘤和 KB 人類皮膚癌的 生物活性 13；由海洋魚類 Halichoeres bleekeri 的腸胃道所分離的鏈黴菌 (Streptomyces hygroscopicus) 得到 Halichomycin (8) 具有很強的細胞毒性，並 對 P388 白血病有抑制活性 14；由加州深海沉積物中所分離到的深海細菌， 分離到大環內酯類的 Macrolactins A (9)，具有抑制 B16-F10 鼠黑色素瘤的活 性，並且具有抑制單純疱疹病毒及人類免疫缺陷病毒 (HIV) 的能力 15。 台灣四面環海，得天獨厚的環境，俾利於海洋微生物的研究，基於此原 因，本研究針對台灣海域所分離得到的純株海洋細菌，經由初步的抗菌與抗 血管收縮活性檢測後，得到 3 株具有活性的海洋細菌，包含一株綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa, M1B)、一株堅強芽孢桿菌 (Bacillus firmus, MO6) 和一株紅桿菌科新屬 (Rhodobacteraceae., AW52)，並針對這 3 株海洋細菌加 以大量培養，進行其次級活性代謝物之探究。 表 1、自不同環境單離出之海洋菌株及其活性代謝產物的文獻整理。 菌株. 菌種來源. 天然物. 海洋沉積物 海洋沉積物 海棉 軟體動物 海洋沉積物 海洋沉積物. Lagunapyrones (10)16 Bisucaberin (11)17 Alteramide (12)18 Homocereulide (13)19 Halobacillin (14)12 Isocoumarin (15)20. 抗癌 Actinomycete Alteromonas haloplanktis Alteromonas sp. Bacillus cereus Bacillus sp. Bacillus sp.. 17.
(19) Chaina purpurogena Flavobacterium uliginosum Micromonospora sp. Pelagiobacter sp. Streptomyces hygroscopicus Strepomyces sioyaensis Streptomyces sp. Streptomyces sp. Streptomyces sp. Streptomycets Vibrio sp.. 海洋沉積物 黃桿菌 軟珊瑚 海藻 魚類消化道 海洋沉積物 軟珊瑚 海洋沉積物 海洋沉積物 軟體動物 浮木. SS-228Y (16)21 Marinactan14 Thiocoraline (17)22 Pelagiomicins (18)21 Halichomycin (19)23 Altemicidin (20)22 Octalacins (21)24 γ-Indomycinone (22)25 δ-Indomycinone (23)25 Aburatubolactam C (24)24 Acyldepsipeptide (25)26. 抗菌 Actinomycete. 海洋沉積物. Marinone (26)27. Alcaligenes faecalis Alteromonas rava Bacillus sp. Chromobacterium sp. Maduromycete Pseudoalteromonas Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas bromoutilis Pseudomonas fluorescens Pseudomonas sp. Streptomyces griseus Streptomyces sp. Streptomyces tenjimariensis Streptomycete Vibrio gazogenes. 軟體動物 海水 海洋蠕蟲 海綿 海洋沉積物 海藻 海棉 海草 海鞘 海草 海洋沉積物 海棉 海洋沉積物 海洋沉積物 海洋沉積物. B-1015 (27)28 Thiomarinol (28)29 Loloatins (29)30 Bromopyrroles (30)28 Maduralide (31)31 Korormicin (32)32 Diketopiperazine (33)33 Pentabromopseudilin (34)34 Andrimid (35)35 Massetolides A (36)36 Aplasmomycins (37)37 Urauchimycins (38)38 Istamycins (39)39 Wailupemycins (40)40 Magnesidins (41)41. 海蜇皮. Salinamides (42)42. 抗發炎 Actinomycete. 18.
(20) OH. O. O. HO. OH. OH HO HN. OH. N H. HN. 1 OH OH. HO. OH OH OH. OH. OHO HO. O. HO. OH OH OH. OH. OH. OH. OH. OH. OH. O. OH. HO O. OH. O HO. OH. OH O. OH. O HO OH. O. O HO NH2 HO OH. HO HO OH. O. OH. OH. HO. H N N H. HO HO. HO. OH. O. 2 HO O OH. H O. OH. O. O. OH. H O. O. O H. O. OH. 3. 19.
(21) H N. O H N N. O. NH O. 4. O. O H N. O. O. O. H N. O. O. O O. H N. HN O. O. O. NH. H N. O. O. O. O. O. 5 H N. O. O N Cl. Cl. 6 O OH N H HO. O NH. OH O. 7 20.
(22) O. O O NH. O. O. 8 HO. HO. O. O. 9 O. O. OH. OH. 10 O OH O N. NH. HN N OH. 11. 21. O O. OH.
(23) O OH N H HO. O NH. OH O. 12 O. O H N. O. O. O. O. H N. O. O. NH. H N. HN. H N. O. O. O. O. O. O. O. O. O. 13. O O. O. O O. H N O. N H. NH2 H N. H N N H. N H O O. O. O. H N. O. 14 OH. O OH. O NH2. HO. NH O. OH. H O. OH. OH. O. 15. O. 16. 22.
(24) HO. S O. O. O. O S. H N. S. N. N H. S. O. N. H N. N N. N. N. N H. O. S. O. O. O. O S. OH. 17 NH2 O OH O. N. N O HO. O. 18 O. H2N O. O. OH O. N NH. O. OH HN. O O. O. O S. H2N. O. 19. 20 OH. O. OH. O. O. HO O. H. O. OH. O. O. 21. 22 23.
(25) OH Me. OH Me. OH. O. O O Me. O. I. 23 O. O. N H. O. OH. N O. 24. O O. O. H N. N H H N. O. N H. OH. N H. O O HO. 25. 24. O.
(26) Br. O. HO. O OH. O. 26. HN. N. OH. O. HO. S O O. 27 H N. O. S. OH. O. OH H OH. O. S N H. O. O. OH. 28. 25.
(27) OH. O H N HN. N H. O. O. O. O N. X. NH H2N R1. O. O. O. O. H N. N H. NH N H O. HO. O O. R2 NH2. Loloatin A. R1=. R2=. X=H. OH. Loloatin B. R1=. R2=. X=H. N H. Loloatin C. R1=. R2=. X=H. N H. Loloatin D. N H. R1=. X = OH. R2=. N H. 29. Br. O N O. Br. 30. 26.
(28) HO. O. OH O O O O OH. O OH. OH. O. 31. O. O O. OH. N H. O. 32 O H N N N N H O. 33. 27.
(29) Br. Br. Βr Br. N H. OH Βr. 34. O H N. O. O O. HN. N H. 35. HO O. O H N. O O. O. O. N H. NH H N. O HO. N H O. H N. N H O. NH. O OH. O. OH. 36. 28. O.
(30) O O HO O OO-. O. O-. B+3 O-. O. O O O O O. 37. HO O. O O. OH H N. O N H O. 38 NH2. NH2. H O. O O. OH N. N H. H2N O. 39. 29. O.
(31) O. O. O. OH. OH HO. O. O. 40. N. 41 HO O. Cl. O HN N H N. O. O. O NH. O O. H H. NH O OH. HO. O. O NH. O O. 42. 30.
(32) 1.2 三種海洋細菌天然物之文獻回顧 在本論文中，針對一株綠膿桿菌 (P. aeruginosa, #M1B)、一株堅強芽孢 桿 菌 ( B. firmus, # M O 6 ) 和 一 株 紅 桿 菌 科 新 種 ( R h o d o b a c t e r a c e a e , #AW52) 所生成的次級代謝物進行研究。堅強芽孢桿菌與新種紅桿菌屬未 有被發表次級代謝物的文獻。 在過去的觀念中，綠膿桿菌常是被當作一種破壞免疫系統的病菌，常發 生在燒燙傷、傷口及血液感染，故常被當作抗菌活性試驗的主要目標病菌。 而自1960起陸續由綠膿桿菌中分離出一系列天然物，其中部分的天然物擁有 不錯的生物活性，包括抗菌、抗癌及抗病毒等。而今尚有一些研究人員對此 菌種做研究，期待能夠發現更多的活性天然物。有鑒於此，我們將過往自綠 膿桿菌所發現的天然物加以整理，以為後續海洋綠膿桿菌天然物研究之參 考。而紅桿菌科新屬菌雖未有文獻報導具天然物之研究，但是在其親緣關係 相近的玫瑰桿菌屬 (Roseobacter sp.) 則發現一個具有強抗菌能力的天然物 tropodithietic acid (84)43。 表 2、綠膿桿菌所分離得到的天然物之文獻整理。 Structure analog Lactone analog. Compound nameRef N-butanoyl-L-homoserine lactone (BHL) (43)44 N-hexanoyl-L-homoserine lactone (HHlL) (44)44 N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (OHHL) (45)44 N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, (OdDHL) (46)44. Peptide analog. Alkaloids analog. 2,3-de-epoxy-2,3-didehydro-rhizoxin (47)45 diketopiperazine (DKP) (48~54)46 pyoverdine I (55~57)47 phenazine-α-carboxamide (58)48 31.
(33) 2-n-heptylquinol-4-one (59)48 2-n-nonylquinol-4-one (60)48 2-n-(1＇E-nonyl)-quinol-4-one (61)48 3-n-heptyl-3-hydoxyquinolin-2,4-dione (62)48 2-n-heptyl-1,2,4-trihydroxyquinoline (63)48 4-hydroxy-2-alkylquinolines, (HAQs) (64)48 2-(2 '-hydroxyphenyl)-4-hydroxymethyl thiazole (65)48 2-(2'-hydroxypheny1) thiazole (66)48 (2 '-hydroxyphenyl)-4-carboxaldehyde thiazole. (67)48 aeruginoic acid (68)48 phenazine-1-carboxylic Acid (69)44 phenazine-1-carboxamide (70)48 pyocyanin (71)49 pyrrolnitrin (72)50 pyoluteorin (73)51 (+)-aerothionin (74)48 homoaerothionin (75)48 pyochelin (76)52 Halide analog dibromoverongiaquinol (77)48 bromochloroverongiaquinol (78)48 dichloroverongiaquinol (79)48 (+)-aeroplysinin-1 (80)48 Glucoside analog rahamnolipid (81)45 Benzenoid derivatives. 2,4-diacetylphloroglucinol (82)45 2-hexyl-5-propyl resorcinol (83)45. Lactone analog. Ο Ο N H Ο. 32. 43.
(34) Ο Ο N H Ο. 44. O O N H. H. O. O. O. 45. O O N H. H O. 33. 46.
(35) O. O HO. O N O. O. OCH3. 47 Peptide analog O H N HN H. 48. O O H. R2. Ν ΝΗ. R3. H O. R1 = CH3; R2 = R3= H; 49 R1 = H; R2 = R3 = CH3; 50 R1 = R2 = CH3; R3 = H; 51 R1 = R2 = H; R3 = SCH3; 52 34. O.
(36) O H Ν ΝΗ R. H O. R = H; 53 R = OH; 54 NH2. O. H2C. H2 C. H2 C. O. H N. HN. O. OH. CH2. HN. NH. NH. O. H N. O H HO. HO O. N H. NH. NHCOR. O N. O. N. O. NH. HN. OH HO. O. H. OH O. OH. R = CH2-CH2-CO-COOH R = CH2-CH2-CHNH2-COOH R = CH2-CH2-COOH Alkaloids analog O. Η Ν H Ν. Ν. 58 35. Pyoverdine Ia 55 Pyoverdine Ib 56 Pyoverdine Ic 57.
(37) O. N H. R. R=n-C7H15 59 R=n-C9H19 60 R=. CH2 Me. 61. 6. OH. O. OH. OH. n-C7H15 N H. n-C7H15. N. O. OH. 62. 63 O. N H. 64 OH. N. R. S. R=CH2OH; 65 R=H; 66 R=CHO; 67 R=COOH; 68 36.
(38) OH. N. N. N. N. R. R=CO2H; 69 R=CONH2; 70. 71 Cl. H N. OH. Cl NH. Cl. Cl. NO2. OH. 72. O. OCH3 Br. 73. OCH3 Br. Br. Br. HO. OH O. O N. H H N (CH2)n N. N O. O. n=4, 74 n=5, 75 OH. COOH Ν. N. S S. 37. 76.
(39) Halide analog O X. Y. Br. Br. HO. HO. CONH2. HO. CN. 80 X=Y=Br X=Br, Y=Cl X=Y=Cl. 77 78 79. Glucoside analog. O. OH. CH3. O. C. C. O. CHCH2COOH. O CH3. OH. (CH2)6. (CH2)6. CH3. CH3. OH. 81 Benzenoid derivatives OH. HO. 82. O. OH. O. O. OH. OH. O. S S OH. 83. 84 38.
(40) 貳、實驗結果與討論 海洋菌株 #M1B、#MO6、#AW52 之培養液經由乙酸乙酯的分配萃取 後，自 #M1B 中分離出七個化合物，分別為 2-n-heptylquinol-4-one (1)、 2-aminophenyl acetate (2) 、 cyclo-L-Pro-L-Phe (3) 、 cyclo-L-Tyr-L-Pro (4) 、 hydroxyphenazine (5)、phenazine-1-carboxamide (6) 和 2-heptylquinolin-4-ol (11) ； 自. #MO6. 中 分 離 得 到 四 個 化 合 物 ， 分 別 為. N-(2’-Phenylethyl)isobutyramide (7)、2-Ethyl-N-(2’-phenethyl)butyramide (8)、 2-Methyl-N-(2’-phenylethyl)butyramide (9) 、 N-(2’-phenylethyl)isovaleramide (10)；自 #AW52 中分離得到三個化合物，分別為 cyclo-L-Pro-L-Leu (12)、 cyclo-L-Pro-L-Val (13)、cyclo-L-Pro-L-Ile (14) 和 cyclo-L-Pro-L-Met sulfoxide (15)。以上各株萃取物之分離、純化流程，分別如圖 1、2、3 所示。. 39.
(41) #M1B, 16 L Broth Partitioned with EA. Sephadex LH-20 eluted with MeOH. Fr. I Fr. II. E, F. Fr. III. Fr. IV. Fr. V. Fr. VI. D A. B. 1 (5.6 mg) 2 (3.7 mg) 3 (3.1 mg). C. D. 5 (6 mg),. 4 (5.9 mg). 6 (4 mg) 11 (6.3 mg). A: HPLC, C18BDS (10 × 250 mm), H2O/MeCN (1:1) + CH3COONH4 B: HPLC, C18BDS (10 × 250 mm), H2O/MeCN (4:1) C: HPLC, C18BDS (10 × 250 mm), H2O/MeCN (9:1) D: HPLC, C18BDS (10 × 250 mm), H2O/MeCN (3:2). E: SPE C18 (25 × 30 mm), EA F: Sephadex LH-20 eluted with EA. 圖 1、 #MIB 菌株培養液之乙酸乙酯萃取物分離流程. 40.
(42) #MO6 21 L Broth Partitioned with EA Sephadex LH-20 eluted with MeOH. Fr. I. Fr. II. Fr. III. E. Fr. IV. Fr. V. Fr. VI. E 7 (9.1 mg). 9 (7.0 mg). 8 (5.2 mg). 10 (8.4 mg). E: HPLC, Hypersil-100, silica (10 × 250 mm), EA. 圖 2、#MO6 菌株培養液之乙酸乙酯萃取物分離流程. #AW52. 27 L Broth Partitioned with EA Sephadex LH-20 eluted with MeOH. Fr. I. Fr. II. Fr. III. Fr. IV. Fr. V. G. C. 15 (8.5 mg). 12 (5.0 mg). Fr. VI. Fr. VII. Fr. VIII. 13 (4.4 mg) 14 (3.8 mg). C: HPLC, C18BDS (10 × 250 mm), H2O/MeCN (9:1) G: HPLC, C18BDS (10 × 250 mm), H2O/MeCN (19:1). 圖 3、 #AW52 菌株培養液之乙酸乙酯萃取物分離流程. 41.
(43) 化合物 1-15，依其骨架的相似性可分為以下五類: Quinoline alkaloide 喹林生物鹼 Ο. 6 5. 7. 4. 3 2'. 2. 8. 10. N H. 9. 4'. 1'. 6'. 3'. 7'. 5'. 1. OH. 6. 4. 5. 7. 3 2'. 2. 8 9. 10. Ν. 4'. 1'. 3'. 6' 7'. 5'. O. 11. Phenazine alkaloids 吩嗪生物鹼. 4 5. 3 2 1. 14. N. N. 4. 8 7. 12. 9. 3. 10. 2. 5. 14. 1. 11. N. N. 8 7. 12. 9 10 11. 1'. OH Ο. 5. NH2. 6. 42.
(44) Phenylamides derivatives 芳香胺衍生物 6' 1'. 6. 4'. 5'. 2. H N. 7'. 2' 4. 1'. 6. H N. 4'. 2' 4. O. 6'. 2. O. 7. 8. 6'' 1'. 6. H N. 4'. 6. 5'. 2' 4. 1'. 7' 5. 1. 4. 2. 6'. 2. O. H. 4. 9. N. 2'. 3. 4'. 10 6'. H O. 3. O. H 5. 6. 2'. NH. 4. 9. N. 3 H. OH. 4'. 10 6'. 4. O. 43. 5'. 6'. 7'. 10. O. NH. 4' O. Diketopiperazines 環狀雙胺基酸. 6. H N. 2'. 3. 9. 5. 7'. 5'. 8'.
(45) O. O. Η. Η. 5. 6. 5 7. 4 N. 3. 12. NH. 7. N. 11. 3. 13. 10. Η. NH. 4. 9. 1. 6. 9. 1. 10. Η O. O. 12. 12. 13. O H. 5. 6. 7. N. 1. NH. 4 3. 9. 10. 11 12. H O. 10'. 14. O Η. 5. 6. 7. NH. 4 N. 3. 9. 1 Η. 13. 11 S. 10. O. O. 15. 其他 3 4. 2. NH2 O. 1. 5 6. O. 1'. 2'. 2 44. 11.
(46) 2.1.1 2-n-heptylquinol-4-one (1) 之結構解析 Ο. 6 5. 7. 4. 3 2'. 2. 8. 10 9. N H. 1'. 4' 3'. 6' 5'. 7'. 化合物 1 為棕色無晶型粉末，比旋光度 [α]24D +12.1° (c 0.50, MeOH)， ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 245 (圖 4)。由紅外光譜顯示有胺 基 (3297 cm-1)、共軛羰基 (1637 cm-1) 和苯環 (1594, 1506 cm-1) 等官能基的 存在 (圖 5)，紫外光譜在 234、315 和 327 nm 有最大吸收 (圖 6)。 化合物 1 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz) 顯示在芳香區中 (圖 7)，有 δH 7.37 (1H, dd, J = 7.2, 7.4 Hz, H-7)、7.60 (1H, brd, J = 7.2 Hz, H-8)、7.58 (1H, brs, H-9)、8.19 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6) 等四組訊號，推測是一個鄰位雙取代的苯 環；一組三取代雙鍵的質子訊號位於 δH 6.21 (1H, s, H-3)；一組三重峰訊號位 於 δH 0.86 (3H, t, H-7’)，推測為一末端甲基；在 δH 1.25~1.38 (8H, m, H-3’ ~ 6’) 有 8 個氫的吸收訊號；同時在較低場域有 δH 1.73 (2H, m, H-2’) 及 2.69 (2H, t, H-1’) 的訊號吸收，藉由 COSY 實驗 (圖 9) 得知 H-1’ ~ H-7’ 間互有相關， 為一長脂肪鏈。由碳譜 (圖 8) 得知 δC 180.6 (C-4) 為一個共軛羰基訊號，且 由 HMBC 實驗得知 (圖 10)，δH 6.21 (H-3 ) 和 δC 35.0 (C-1’)、δC 157.2 (C-2)、 δC 180.0 (C-4) 及 δC 126.0 (C-5) 有相關，得知 δC 108.8 (C-3) 和 δC 157.2 (C-2) 的兩個訊號，為與羰基共軛的一組雙鍵。另外，δH 2.69 (H-1’ ) 和 δC 157.1 45.
(47) (C-2)、δC 108.8 (C-3) 及 δC 32.8 (C-2’) 相關，說明了在 C-2 處與 C-1’ 的長脂 肪側鏈 (aliphatic chain) 做連結；此外在低場域出現的 δC 157.2 (C-2) 和 δC 141.6 (C-10) 兩個訊號，推測應接有異原子，根據 ESI-MS 所測得之分子量 為奇數，推測化合物 1 應含有一個氮原子，因而推斷 C-2 與 C-10 經由一個 氮原子連結在一起；此外，由碳譜得知，δC 119.1 (C-9)、125.0 (C-7)、125.5 (C-6)、126.0 (C-5)、133.4 (C-8) 和 146.1 (C-10) 為一組苯環的訊號，且 HMBC 實驗確認 δH 8.19 (H-6) 與 δC 180.0 (C-4)、δC 133.4 (C-8) 及 δC 141.6 (C-10)，δH 7.37 (H-7) 與 δC 180.0 (C-6) 及 δC 119.1 (C-9)，δH 7.60 (H-8) 與 δC 180.0 (C-6) 及 δC 141.6 (C-10) 有相關，確定苯環上碳的排列位置。綜合以上解析所得之 數據詳列於表 3，並與文獻比對後確認化合物 1 為已知物 2-n-heptylquinol-4-one53。. 46.
(48) 表 3、1H- and 13C-NMR data of 1 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. 2. 157.2. 3 4 5 6 7 8 9 10. 108.8 180.0 126.0 125.5 125.0 133.4 119.1 141.6 35.0 32.8 30.2 30.2 30.1 23.6 14.4. 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’. C. 1. H. HMBC (H→C). 6.21 (1H, s). 1’, 2, 4, 5. 8.19 (1H, d, J = 7.4 Hz) 7.37 (1H, dd, J = 7.2, 7.4 Hz ) 7.60 (1H, brd, J = 7.2 Hz) 7.58 (1H, brs). 4, 8, 10 6, 9 6, 10. 2.69 (2H, m) 1.73 (2H, m) 1.25~1.38 (2H, m) 1.25~1.38 (2H, m) 1.25~1.38 (2H, m) 1.25~1.38 (2H, m) 0.86 (3H, t, J = 6.8 Hz). 2, 3, 2’ 1’, 3’, 4’ 1’, 4’ 2’, 5’ 3’, 6’, 7’ 4’, 7’ 5’, 6’. [M+H]+ [2M+H]+. 圖 4、化合物 1 之電噴灑電離質譜。. 47.
(49) 圖 5、化合物 1 之紅外光譜。. 圖 6、化合物 1 之紫外光譜。. 48.
(50) 圖 7、化合物 1 之氫譜。. 圖 8、化合物 1 之碳譜。 49.
(51) 圖 9、化合物 1 之 COSY 圖譜。 O. 6 5. 7. 4. 3 2'. 2. 8. 10 9. N H. 1'. 4' 3'. 50. 6' 5'. 7'.
(52) 圖 10、化合物 1 之 HMBC 圖譜. O. 6 5. 7. 4. 3 2'. 2. 8. 10 9. N H. 1'. 4'. 6'. 3'. 7'. 5'. O. 6 5. 7. 4. 3 2'. 2. 8. 10 9. N H. 1'. 4' 3'. 51. 6' 5'. 7'.
(53) 2.1.2 2-aminophenyl acetate (2) 之結構解析 3 4. NH2. 2. O. 1. 5 6. O. 1'. 2'. 化合物 2 為黃色油狀液體，比旋光度 [α]24D +2.4° (c 0.50, MeOH)，由 HRESI 實驗 (圖 11) 得到 [M +H]+，其分子量應為 152.07，輔以 HRESI 實 驗推測此化合物的分子量為 C8H9NO2，推測化合物 2 應含有一個氮原子。紅 外光譜顯示有胺基 (3404 cm-1)、苯環 (1527 cm-1) 和與胺基形成氫鍵的酯基 (1664 cm-1) 等官能基存在 (圖 12 )。紫外光譜在 238、241 和 282 nm 有最大 吸收 (圖 13)。 在化合物 2 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz) 在芳香區中 (圖 14)，顯示 δH 7.59 (1H, d, J = 0.8 Hz, H-6)、6.98 (1H, dd, J = 7.5, 0.8 Hz, H-5)、 6.83 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-3) 及 6.78 (1H, dd , J = 7.5, 0.8 Hz, H-4 )，所以推測 是一個鄰位雙取代的苯環。由碳譜 (CD3OD, 125 MHz) 得知 (圖 15)，在 δC 172 (C-1’ ) 有吸收，有一個羰基存在，且有一組的甲基訊號在 δH 2.19 (3H, s, H-2’ ) 有吸收，所以得知側鏈是乙酯基；在苯環中有出現一個 δC 149.8 (C-1 ) 的訊號，推測有一個接氧原子的四級碳，所以側鏈乙酯基在此與苯環連接， 而另一個四級碳 δC 127.1 (C-2)，則與胺基相接。綜合以上數據解析得到之數 據詳列於表 4，得知化合物 2 為 2-aminophenyl acetate。經由文獻比對後，發 現化合物 2 為首次在天然物發現的，而在 1904 年首次有人發表合成此化合 52.
(54) 物 49，由 o-Amino phenyl methyl carbonates ( C6H4 (OCO2CH3)(NH3Cl) )，經 氯化氫 (HCl) 還原後，生成此化合物。 表 4、1H- and 13C-NMR data of 2 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. 1. 149.8. 2 3 4 5 6. 127.1 117.3 124.0 126.8 120.6 172.2 23.4. 1’ 2’. 1. C. H. 6.83 (1H, d, J = 7.5 Hz) 6.78 (1H, dd, J = 7.5, 0.8 Hz) 6.98 (1H, dd, J = 7.5, 0.8 Hz) 7.59 (1H, d, J = 0.8 Hz) 2.19 (3H, s). 圖 11、化合物 2 之電噴灑電離質譜。. 53.
(55) 圖 12、化合物 2 之紅外光譜。. 圖 13、化合物 2 之紫外光譜。. 54.
(56) 圖 14、化合物 2 之氫譜。. 圖 15、化合物 2 之碳譜。. 55.
(57) 2.1.3 cyclo- L-Pro- L-Phe (3) 之結構解析 O H. 5. 6. 2'. NH. 4. 9. N. 3. 4'. 10 6'. H O. 化合物 3 為白色無晶型粉末，比旋光度 [α]24D -52.4° (c 0.50, MeOH)， ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 245 (圖 16)。紅外光譜顯示有胺 基 (3236 cm-1)、醯胺羰基 (1658 cm-1) 和苯環 (1504 cm-1)等官能基 (圖 17)。紫外光譜在 258 nm 有最大吸收 (圖 18)。 化合物 3 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz)，在芳香區中 (圖 19 ) 顯示有一組 5 個質子的吸收訊號在 δH 7.20 ~ 7.29 (5H, m) 出現，推測為一個單取代的苯 環。兩個接有異原子的次甲基訊號在 δH 4.06 (1H, dd, J = 2.2, 5.0 Hz H-6)、4.43 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9) 出現，以及四個亞甲基訊號在 δH 1.79 (H2- 4)、δH 1.25 (1H, d, J = 2.2 Hz, Ha-5) 及 2.08 (1H, t, J = 5.0 Hz, Hb-5)、δH 3.16 (2H, d, J = 5.0 Hz, H2-10) 和 δH 3.37 及 3.53 (each 1H, m, H2-3)。由碳譜 (圖 20) 得知有兩個 羰基分別位於. δC 167.4 (C-1) 和 171.3 (C-7)，同時在 δC 136.7 (C-1’)、131.3. (C-2’)、129.6 (C-3’)、128.5 (C-4’)、129.6 (C-5’) 和 131.3 (C-6’) 發現一組屬於 苯環的訊號，以及 3 個位於 δC 46.1 (C-3)、59.1 (C-9) 和 59.7 (C-6) 的訊號。 由 COSY 實驗 (圖 21 ) 得知 δH 3.37 和 3.53 (each 1H, m, H2-3) 與 δH 1.79 56.
(58) (H2-4) 相關，而 δH 1.79 (H2-4) 與 δH 1.25 和 2.08 (each 1H, m, H2-5) 相關， 且與 δH 4.05 (H-6) 也有相關。δH 4.43 (H-9) 與 δH 3.16 (H2-10) 互有相關，以 及由 HMBC 實驗 (圖 22) 得知 δH 3.16 (H2-10) 與 δC 167.4 (C-1)、δC 131.3 (C-2’) 有相關，可以推測得知 ( H2-10) 連接在一單取代苯環。在較低場域出 現 δH 3.37 及 3.53 (H2-3) 的訊號並與 δC 167.4 (C-1) 相關，故推測 δC 45.9 (C-3) 與 δC 167.4 (C-1) 之間有異原子存在，比對 ESI/MS 實驗所得之結果，推測 此異原子為氮；此外，δH 4.43 (H2-9) 與 δC 171.3 (C-7) 相關，比對 ESI/MS 實 驗結果，可得知在 C-7 與 C-9 之間，有一氮原子存在，並由紅外光譜的結果 印證此結構內含有一個醯胺基。進一步與文獻比對後，推測其結構應為 cyclo-Pro-Phe。此結構具有兩個立體中心，利用鹽酸水解為兩個單胺基酸， 使用可分析胺基酸鏡相異構物的 HPLC 管柱，再分別與 L-Pro 和 L-Phe 兩標 準品的滯留時間比對，滯留時間分別為 L-Pro ( 5.34 min) 及 L-Phe (41.32 min)，綜合以上數據確認結構為 cyclo- L-Pro- L-Phe48, 54。. 57.
(59) 表 5、1H- and 13C-NMR data of 3 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. 1. 167.4. 3. 45.9. 4 5. 22.5 29.8. 6. 59.8. 7 9 10 Ar. 171.3 59.1 41.0. 4.43 (1H, t, J = 5.0 Hz) 3.16 (2H, d, J = 5.0 Hz ). 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’. 136.7 131.2 129.6 128.5 129.6 131.2. 7.20~7.29 (1H, m) 7.20~7.29 (1H, m) 7.20~7.29 (1H, m) 7.20~7.29 (1H, m) 7.20~7.29 (1H, m). C. 1. HMBC (H→C). H. 3.37 (1H, m) 3.53 (1H, m) 1.79 (2H, m) 1.23 (1H, d, J = 2.2 Hz) 2.08 (1H, t, J = 5.0 Hz) 4.06 (1H, dd, J = 2.2 Hz 5.0 Hz). 1, 4, 5. 4. 3, 5, 6 4, 6, 3. 3, 5 4, 6. 5, 7. 5. 1, 7, 10, 1’ 1, 9, 1’, 2’. 10 9. [M+H]+. 圖 16、化合物 3 之電噴灑電離質譜。. 58. COSY.
(60) 圖 17、化合物 3 之紅外光譜。. 圖 18、化合物 3 之紫外光譜。. 59.
(61) 圖 19、化合物 3 之氫譜。. 圖 20、化合物 3 之碳譜。. 60.
(62) 圖 21、化合物 3 之 COSY 圖譜。 O. NH N. O. 61.
(63) 圖 22、化合物 3 之 HMBC 圖譜。 O. 5. 6. 2'. NH. 4. 9. N. 3. H. O. 62. 4'. 10 6'.
(64) 2.1.4 cyclo-L-Tyr-L-Pro (4) 之結構解析. O. H 5. OH. 6. 2'. NH. 4. 9. N. 3. 4'. 10 6'. H O. 此化合物 4 為白色無晶型粉末，比旋光度[α]24D -58.4° (c 0.50, MeOH)， ESI-MS 顯示分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 261 (圖 23)。紅外光譜顯示有羥基 (3270 cm-1)、苯環 (1504 cm-1)和醯胺羰基 (1650 cm-1) 等官能基 (圖 24)。紫 外光譜在 274 nm 有最大吸收 (圖 25)。 由化合物 4 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz)，在芳香區中 (圖 26) 有 δH 6.69 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2’, 6’) 與 δH 7.03 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3’, 5’) 兩組吸收訊 號，推測有一個雙取代苯環存在。在 δH 4.04 (1H, dd, J = 6.0, 1.8 Hz, H-6) 和 4.35 (1H, t, J = 4.1 Hz, H-9) 有訊號存在，所以可以推測這兩個是屬於接於異 原子的次甲基，且在 δH 1.79 (H2-4, m)、1.23 (1H, t, J = 10 Hz, Ha-5) 和 δH 2.08 (1H, t, J = 6.0 Hz, Hb-5)、3.04 (2H, m, H2-10)、3.33 和 3.53 (each 1H, m, H2-3) 有亞甲基吸收訊號存在。 由碳譜 (圖 27) 可知，有兩個羰基的吸收訊號在 δC 167.0 (C-1) 和 δC 170.8 (C-7) 有吸收，同時在 δC 127.6 (C-1’)、132.1 (C-2’)、116.2 (C-3’)、116.2 (C-5’) 和 132.1 (C-6’) 發現一組屬於苯環的訊號，而在 δC 157.7 (C-4’) 有吸收 63.
(65) 訊號，並且配合氫譜上兩組鄰位的苯環上之質子訊號，可以得知在此碳上會 接有異原子。又由於紅外光譜的佐證發現此結構含有醯胺基與羥基，故推論 此異原子為羥基。在 δC 45.9 (C-3)、60.1 (C-9)、57.9 (C-6) 有吸收訊號，發 現與化合物 3 相似，所以應該具有相同的結構骨架。與化合物 3 做比對後， 推測此化合物平面結構為 cyclo-Pro-Tyr，具有兩個立體中心。利用鹽酸水解 為兩個單胺基酸，使用可分析胺基酸鏡相異構物的 HPLC 管柱，再分別與 L-Pro. 和 L-Tyr 之標準品的滯留時間比對，其滯留時間分別為 L-Pro (5.23 min). 及 L-Tyr (18.92 min)，綜合以上數據確認結構為 cyclo-L -Pro- L-Tyr46, 54。 表 6、1H- and 13C-NMR data of 4 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. 1. 167.0. 3. 45.9. 4 5. 22.7 37.7. 6 7 9 10 Ar. 57.9 170.8 60.1 29.4. 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’. 127.6 132.1 116.2 157.7 116.2 132.1. 1. C. H. 3.33 (1H, m) 3.53 (1H, m) 1.79 (2H, m) 1.23 (1H, t, J = 10 Hz) 2.08 (1H, t, J = 6.0 Hz) 4.04 (1H, dd, J = 6.0, 1.8 Hz ) 4.35 (1H, t, J = 4.1 Hz) 3.04 (2H, m). 6.69 (1H, d, J = 8.4 Hz) 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz) 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz) 6.69 (1H, d, J = 8.4 Hz). 64.
(66) 圖 23、化合物 4 之電噴灑電離質譜。. 圖 24、化合物 4 之紅外光譜。 65.
(67) 圖 25、化合物 4 之紫外光譜。. 圖 26、化合物 4 之氫譜。. 66.
(68) 圖 27、化合物 4 之碳譜。. 67.
(69) 2.1.5 Hydroxyphenazine (5) 的結構解析. 4 5. 3 2 1. 14. N. N. 8 7. 12. 9 10 11. OH. 化合物 5 為深褐色無晶型粉末，比旋光度 [α]24D +14.8° (c 0.50, MeOH)， ESI / MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 197 (圖 28)。紅外光譜顯示有烴 基 (3290 cm-1) 及苯環 (1501, 1602 cm-1) 等官能基 (圖 29)。紫外光譜在 263 及 366 nm 有最大吸收 (圖 30)。 化合物 5 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz)(圖 31)，經解析後顯示多組吸收訊 號出現在芳香區 δH 7.0 ~ 8.5 之間，推測有苯環結構的存在。由 COSY 實驗 得知 (圖 33)，δH 7.67 (H-4) 與 7.78 (H-3) 有相關，以及 δH 7.18 (H-2) 與 δH 7.78 (H-3) 有相關，由 HMBC 實驗得知 (圖 34)，δH 7.78 (H-3) 與 δC 145.1 (C-5) 及 δC 154.9 (C-1) 有相關，δH 7.67 (H-4) 與 δC 111.2 (C-2) 及 δC 137.3 (C-14) 有相關，δH 7.18 (H-2) 與 δC 119.8 (C-4)、154.9 (C-1) 及 137.3 (C-14) 有相關， 得知有一個三取代的苯環；再由 COSY 實驗得知，δH 8.31 (H-11) 與 7.90 (H-10)、δH 7.90 (H-9) 與 7.87 (H-10) 及 δH 8.17 (H-8) 與 7.87 (H-9) 有相關， 由 HMBC 實驗得知，δH 8.31 (H-11) 與 δC 132.4 (C-9) 及 144.5 (C-7)、δH 7.90 (H-9) 與 δC 144.5 (C-7) 及 130.6 (C-11)、δH 7.87 (H-10) 與 δC 129.8 (C-8) 及 68.
(70) 142.9 (C-12) 和 δH 8.17 (H-8) 與 δC 131.5 (C-10) 及 δC 142.9 (C-12) 有相關， 推測結構中另有一個鄰位雙取代苯環結構。由碳譜得知 (圖 32)，δC 154.9 (C-1)、δC 137.3 (C-14)、δC 145.1 (C-5)、δC 144.5 (C-7) 和 δC 142.96 (C-12) 是 四級碳，在較低的場域，推測此五個碳接有異原子，其中 δC 154.9 (C-1) 場 域最低，推測接有氧原子。再由 HMBC 實驗中，兩個苯環間沒有互有相關 的訊號，推測兩個苯環結構由兩個異原子接合在一起，輔以 ESI / MS 所測得 之分子量，推測此二個異原子應是氮原子。經與文獻比對後，確認化合物 5 的結構為 hydroxyphenazine33，是屬於已知物。綜合以上解析所得之數據詳列 於表 7。 表 7、1H- and 13C-NMR data of 5 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. C. 1. 154.9. 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 14. 111.2 133.4 119.8 145.1 144.5 129.8 132.4 131.5 130.6 142.9 137.3. 1. H. HMBC (H→C). COSY. 7.18 (1H, d, J = 7.0 Hz) 7.78 (1H, dd, J = 8.4, 7.0 Hz) 7.67 (1H, d, J = 8.4 Hz). 1, 4, 14 1, 5 2, 14. 3 2, 4 3. 8.17 (1H, d, J = 8.4 Hz) 7.90 (1H, dd, J = 8.4 Hz) 7.87 (1H, dd, J = 8.4 Hz) 8.31 ( 1H, d, J = 8.4 Hz). 10, 12 7, 11 8, 12 7, 9. 9 8, 10 9, 11 10. .. 69.
(71) 圖 28、化合物 5 之電噴灑電離質譜。. 圖 29、化合物 5 之紅外光譜。 70.
(72) 圖 30、化合物 5 之紫外光譜。. 圖 31、化合物 5 之氫譜。 71.
(73) 圖 32、化合物 5 之碳譜。. 圖 33、化合物 5 之 COSY 圖譜。. 72.
(74) 圖 34、化合物 5 之 HMBC 圖譜。. 4 5. 3 2 1. 14. N. N. 8 7. 12. 4. 9. 5. 3. 10. 2. 11. 1. OH. OH. 73. 14. N. N. 8 7. 12. 9 10 11.
(75) 2.1.6 Phenazine-1-carboxamide (6) 之結構解析 4 5. 3 2. 14. 1. N. N. 8 7. 12. 9 10 11. 1' Ο. NH2. 化合物 6 為淺黃色無晶型粉末，比旋光度 [α]24D +19.4° (c 0.50, MeOH)， ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 224 (圖 35)。紅外光譜顯示有胺 基 (3329 cm-1)、醯胺羰基 (1678 cm-1) 及苯環 (1620, 1522 cm-1) 等官能基 (圖 36)。紫外光譜在 248 和 366 nm 有最大吸收 (圖 37)。 化合物 6 的氫譜 (CDCl3, 500 MHz)(圖 38)，經解析後顯示多組吸收訊號 出現在芳香區 δH 7.95 ~ 9.01 之間，推測有苯環結構存在。在氫譜上訊號分成 兩群，分別為 δH 9.02 (1H, dd, J = 1.1, 1.1 Hz, H-2)、8.43 (1H, dd, J = 1.1, 7.5 Hz, H-3) 及 7.97 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4) 與 δH 8.22 (1H, dd, J = 2.5, 3.8 Hz, H-8)、δH 8.28 (1H, dd, J = 2.5, 3.8 Hz, H-11) 及 δH 7.95 (2H, m, H-9, 10)。由此 預測，結構中會有兩個苯環結構。由碳譜得知 (圖 39)，亦可將訊號分成兩 群，分別為 δC 134.3 (C-1)、131.7 (C-2)、131.0 (C-3)、135.9 (C-4)及 143.2 (C-5) 和 δC 129.8 (C-8)、130.0 (C-9)、129.9 (C-10) 及 129.1 (C-11)。在較低場域中 有吸收訊號在 143.2 (C-5)、δC 140.8 (C-7)、δC 141.5 (C-12)、δC 143.5 (C-14) 和 δC 166.6 (C-1’)，推測此五個碳接有異原子，其中 δC 166.6 (C-1’) 場域最低， 74.
(76) 推測為一個醯胺羰基訊號。此與紅外光譜的解析相符。經與化合物 5 加以比 較，碳譜僅在 C-1 位置有不同，推測醯胺羰基是接在 C-1 位置。再與文獻比 對後，確認化合物 6 的結構為 Phenazine-1-carboxamide 33，是屬於已知物。 綜合以上解析所得之數據詳列於表 8。 表 8、1H- and 13C-NMR data of 6 (CDCl3, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. C. 1. 134.3. 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 14. 131.7 131.0 135.9 143.2 140.8 129.8 130.0 129.9 129.1 141.6 143.5 166.6. 1’. 1. H. 9.02 (1H, dd, J = 1.1, 1.1 Hz ) 8.43 (1H, dd, J = 1.1, 7.5 Hz) 7.97 (1H, d, J = 7.5 Hz). 8.22 (1H, dd, J = 2.5, 3.8 Hz) 7.95 (1H, m) 7.95 (1H, m) 8.28 ( 1H, dd, J = 2.5, 3.8 Hz). 75.
(77) [2M+Na]+ [M+H]+. 圖 35、化合物 6 之電噴灑電離質譜。. 圖 36、化合物 6 之紅外光譜。. 76.
(78) 圖 37、化合物 6 之紫外光譜。. 77.
(79) 圖 38、化合物 6 之氫譜。. 78.
(80) 圖 39、化合物 6 之碳譜。. 79.
(81) 2.1.7 N-(2’-Phenylethyl)isobutyramide (7) 之結構解析 6' 1'. 6. H N. 4'. 2' 4. 2. 5'. 7'. O. 化合物 7 為無色透明無晶型粉末，比旋光度 [α]24D +18.4° (c 0.50, MeOH)，ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 192 (圖 40)。紅外光譜 顯示有胺基 (3296 cm-1) 和醯胺羰基 (1635 cm-1) 等官能基的存在 (圖 41)， 紫外光譜在 259 nm 有最大吸收 (圖 42)。 化合物 7 的氫譜 (CDCl3, 500 MHz)(圖 43) 顯示在芳香區中，顯示有 δH 7.25 (2H, m, H-2, 6)、7.20 (1H, m, H-4) 和 7.17 (2H, m, H-3, 5)為一個單取代 苯環；在高場域有一組雙重峰訊號位於 δH 1.05 (6H, d, J = 6.9 Hz, H-6’)，為兩 個末端甲基；在 δH 2.77 (2H, t, J = 7.36 Hz, C-1’) 有一組三重峰訊號，為鄰近 苯環的亞甲基；在較低場域 δH 3.38 (2H, t, J = 7.4 Hz, C-2’) 有一組吸收訊 號，為接有異原子的亞甲基。經由 ESI/MS 結果顯示化合物 7 之分子量為奇 數，推測該異原子為氮；由碳譜顯示 (圖 44)，δC 140.5 (C-1)、129.4 (C-2, 6)、 127.3 (C-3, 5) 和 129.7 (C-4) 為一苯環訊號，其中 δC 140.5 是一個四級碳； 在低場域有一吸收訊號位於 δC 180.1，推測為羰基的訊號。在 COSY 實驗中 指出 (圖 45)，δH 1.05 (H3-6’, 7’) 與 δH 2.35 (H-5’) 相關，形成了一個異丙基； 80.
(82) δH 2.77 (H2-1’) 與 δH 3.38 (H2-2’) 相關。由 HMBC 實驗 (圖 46) 得知，δH 1.05 (H3-6’, 7’) 與 δC 36.2 (C-5’) 及 180.1 (C-4’) 相關，以及 δH 2.35 (H-5’) 與 δC 180.1 (C-4’) 相關，推測在較低場域的訊號 δH 2.35 (H-5’)，旁邊接有醯胺羰 基；δH 3.38 (H2-2’) 與 δC 180.1 (C-4’) 及 36.5 (C-1’) 有相關，推測 C-4’為一個 醯胺羰基且連接異丙基 (C-5’ ~ C7’)；δH 2.77 (H2-1’) 與 δC 140.6 (C-1) 及 41.85 (C-2’) 相關，可推測此長側鏈在 δC 36.5 (C-1’) 與苯環上的 δC 140.6 (C-1) 連 接 。 上 述 解 析 經 與 文 獻 比 對 後 ， 確 認 化 合 物 7 的 結 構 為 N-(2’-Phenylethyl)isobutyramide 55，是屬於已知物。綜合以上解析所得之數據 詳列於表 9。 表 9、1H- and 13C-NMR data of 7 (CDCl3, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. C. 1. H. HMBC (H→C). COSY. 1, 3 2, 6. 1. 140.6. 2 3 4 5 6. 129.4 129.9 127.3 129.9 129.4 36.5 41.9. 7.25 (1H, m) 7.17 (1H, m) 7.20 (1H, m) 7.17 (1H, m) 7.25 (1H, m) 2.77 (2H, t, J = 7.0 Hz) 3.38 (2H, t, J = 7.0 Hz). 3, 6 1, 5. 3 2, 4 3, 5 4, 6 5. 1, 2’ 1, 1’, 4’. 2’ 1’. 180.1 36.3 19.9 19.9. 2.35 (1H, dq, J = 6.9, 6.9 Hz) 1.05 (3H, d, J = 6.9 Hz) 1.05 (3H, d, J = 6.9 Hz). 6’ 4’, 5’ 6’, 5’, 4’. 6’ 5’, 7’ 6’. 1’ 2’ N 4’ 5’ 6’ 7’. 81.
(83) 圖 40、化合物 7 之電噴灑電離質譜。. 圖 41、化合物 7 之紅外光譜。 82.
(84) 圖 42、化合物 7 之紫外光譜。. 圖 43、化合物 7 之氫譜。. 83.
(85) 圖 44、化合物 7 之碳譜。. 84.
(86) 圖 45、化合物 7 之 COSY 圖譜。 6' 1'. 6. H N. 4'. 2' 4. 2. O. 85. 5'. 7'.
(87) 圖 46、化合物 7 之 HMBC 圖譜。 6' 1'. 6. H N. 4'. 5'. 7'. 2' 4. O. 2. 6' 6. H N. 1'. 4'. 2' 4. O. 2. 86. 5'. 7'.
(88) 2.1.8 2-Ethyl-N-(2’-phenethyl)butyramide (8) 之結構解析. 1'. 6. H N. 4'. 2' 4. 7'. 5' 6'. 2. O. 化合物 8 為無色透明片狀結晶，比旋光度 [α]24D +4.18° (c 0.50, MeOH)， ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 192 (圖 47)。由紅外光譜顯示有 胺基 (3294 cm-1) 和醯胺羰基 (1643 cm-1) 等官能基的存在 (圖 48)，紫外光 譜在 268 nm 有最大吸收 (圖 49)。 化合物 8 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz) 顯示在芳香區中 (圖 50)，訊號分 成兩區，在低場域部份顯示有 δH 7.26 (1H, dd, J = 7.3, 7.6 Hz, H-2, 6 )、7.20 (1H, brs, H-4) 和 7.17 (1H, dd, J = 7.3, 7.6 Hz, H-3, 5) 所以為一單取代的苯 環；在高場域有一組雙重峰訊號位於 δH 0.89 (3H, t, J = 7.4 Hz, H-7’)，為一個 末端甲基；在 δH 1.59 (2H, m, C-6’) 和 δH 2.10 (2H, t, J = 7.4 Hz, C-5’) 有兩個 亞甲基訊號；在較低場域 δH 3.38 (2H, t, J = 7.4, C-2’ ) 有一組亞甲基訊號， 接有異原子；δH 2.77 (2H, t, J = 7.4, C-1’ ) 為一接有苯環的亞甲基訊號。經由 ESI/MS 結果顯示，該異原子為氮；由碳譜顯示 (圖 51)，在高場域出現的烷 基訊號為 δC 36.6 (C-1’)、39.0 (C-2’)、41.9 (C-5’)、20.4 (C-6’) 和 13.9 (C-7’)； 在低場域出現訊號為 δC 140.5 (C-1)、129.5 (C-2, 6)、127.3 (C-3, 5) 和 129.8 (C-4) 為一組苯環訊號；在低場域有一組吸收訊號 δC 176.1 (C-4’)，為羰基的 87.
(89) 訊號，與紅外光譜所得結果比對，可知在長側鏈部分有一個醯胺羰基；此外， δC 140.5 (C-1) 是一個四級碳，推測長側鏈在 36.5 (C-1’) 與苯環的 δC 140.6 (C-1) 連接。與化合物 7 得到之結果比較，進一步與文獻比對，確認化合物 8 的結構為 2-Ethyl-N-(2’-phenethyl)butyramide 56，是屬於已知物。綜合以上 解析所得之數據詳列於表 10。 表 10、1H- and 13C-NMR data of 8 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No. 1 2 3 4 5 6. 13. 1. C. H. 1’ 2’. 14 0.5 129.5 129.8 127.3 129.8 129.5 36.6 41.9. 7.26 (1H, d, J = 7.3, 7.6 Hz) 7.17 (1H, dd, J = 7.3, 7.6 Hz) 7.20 (1H, brs) 7.17 (1H, dd, J = 7.3, 7.6 Hz) 7.26 (1H, d, J = 7.3 Hz) 2.77 (2H, t, J = 7.4 Hz) 3.38 (2H, t, J = 7.4 Hz). 4’ 5’ 6’ 7’. 176.1 41.9 20.4 13.9. 2.10 (2H, t, J = 7.4 Hz) 1.59 (2H, m) 0.89 (3H, t, J = 7.4 Hz). 88.
(90) 圖 47、化合物 8 之電噴灑電離質譜。. 圖 48、化合物 8 之紅外光譜。. 89.
(91) 圖 49、化合物 8 之紫外光譜。. 圖 50、化合物 8 之氫譜。. 90.
(92) 圖 51、化合物 8 之碳譜。. 91.
(93) 2.1.9 2-Methyl-N-(2’-phenylethyl)butyramide (9) 之結構解析 6'' 1'. 6. H N. 4'. 2' 4. 7'. 5' 6'. 2. O. 化合物 9 為淡黃色粉狀無晶型粉末，比旋光度 [α]24D +31.5° (c 0.50, MeOH)，ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 206 (圖 52)。由紅外光 譜顯示有胺基 (3288 cm-1)、醯胺羰基 (1641 cm-1) 等官能基的存在 (圖 53)， 紫外光譜在 258 nm 有最大吸收 (圖 54)。 化合物 9 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz) 顯示在芳香區中 (圖 55)，訊號分 成兩區，在低場域部份顯示有 δH 7.26 (2H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz, H-2, 6 )、7.20 (1H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz, H-4) 和 7.17 (2H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz, H-3, 5) 所以推 測為一個單取代的苯環；在高場域有兩組雙重峰訊號位於 δH 0.83 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-7’) 和 δH 1.04 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-6’’) ，推測有兩個末端甲基；在 δH 1.54 和 1.36 (each 1H, m, H2-6’) 有亞甲基訊號；在較低場域 δH 3.38 (2H, m, C-2’ ) 有一組亞甲基訊號，應是接有異原子； δH 2.78 (2H, t, J = 7.41, C-1’ ) 有一組亞甲基訊號，推測接有苯環。經由 ESI/MS 結果顯示化合物之分子量 為奇數，推測該異原子為氮，與紅外光譜所得結果吻合。與化合物 7 得到之 結果比較，進一步與文獻比對，確認化合物 9 的結構為. 92.
(94) 2-Methyl-N-(2’-phenylethyl)butyramide 55，是屬於已知物。綜合以上解析所得 之數據詳列於表 11。. 表 11、1H- and 13C-NMR data of 9 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C) 1. No. 1 2 3 4 5 6 1’ 2’ 4’ 5’ 6’ 6’’ 7’. H. 7.26 (1H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz) 7.17 (1H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz) 7.20 (1H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz) 7.17 (1H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz) 7.26 (1H, dd, J = 7.3, 7.5 Hz) 2.78 (2H, t, J = 7.4 Hz) 3.38 (2H, m). 2.78(1H, m) 1.54 (1H, m) 1.36 (1H, m) 1.04 (3H,d, J = 7.5 Hz) 0.83 (3H, t, J = 7.5 Hz). 93.
(95) [M+H]+. [2M+H]+. [2M+Na]+. 圖 52、化合物 9 之電噴灑電離質譜。. 圖 53、化合物 9 之紅外光譜。 94.
(96) 圖 54、化合物 9 之紫外光譜。. 圖 55、化合物 9 之氫譜。. 95.
(97) 2.1.10 N-(2’-phenylethyl)isovaleramide (10) 之結構解析 6. 1'. 5. 1. 4. 2. H N. 4'. 5'. 6'. 8'. 2' O. 7'. 3. 化合物 10 為無色無晶型粉末，比旋光度 [α]24D + 27.8° (c 0.50, MeOH)， ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 206 (圖 56)。紅外光譜顯示有胺 基 (3303 cm-1) 和醯胺羰基 (1622 cm-1) 等官能基的存在 (圖 57)，紫外光譜 在 251 nm 有最大吸收 (圖 58)。 化合物 10 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz)(圖 59) 顯示在芳香區中，有 δH 7.29 (2H, m, H-2, 6)、7.20 (1H, m, H-4) 和 7.12 (2H, m, H-3, 5) 等吸收訊號，為一 單取代苯環；在高場域有一組雙重峰訊號位於 δH 0.92 (6H, d, J = 7.0 Hz, H-7’, 8’)，為兩個末端甲基；在 δH 1.98 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-5’) 有一組二重峰訊號， 為一個亞甲基；在 δH 2.82 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-1’) 有一組三重峰訊號，為連 接一個苯環的亞甲基；在較低場域 δH 3.51 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-2’) 有一組吸 收訊號，為接有異原子的亞甲基，由 ESI/MS 結果顯示化合物 10 之分子量為 奇數，推測該異原子為氮；由碳譜 (CD3OD, 125 MHz) 顯示 (圖 60)， δC 138.9 (C-1)、128.6 (C-2, -6)、128.7 (C-3, 5) 和 126.5 (C-4) 為一組苯環訊號， 進一步檢視 HSQC 實驗所得的結果，確認 δC 138.9 (C-1) 是一個四級碳；在 低場域有一組吸收訊號 δC 172.4 (C-4’)，為羰基的訊號。在 COSY 實驗中指 96.
(98) 出 (圖 61)，δH 0.92 (H3-7’, 8’) 與 δH 2.06 (H-6’) 相關，且 δH 1.96 (H2-5’) 與 δH 2.06 (H-6’) 相關，形成了一個異丁基 (isobutyl group)；δH 2.82 (H2-1’) 與 δH 3.38 (H2-2’) 相關。由 HMBC 實驗 (圖 62) 得知，δH 0.92 (H3-7’, 8’) 與 δC 26.1 (C-6’) 及 46.2 (C-5’) 相關；δH 2.06 (H-6’) 與 δC 22.4 (C-7’, 8’) 及 46.2 (C-5’) 相 關；δH 1.96 (H-5’) 與 δC 172.4 (C-4’)、26.1 (C-6’) 及 22.4 (C-7’, 8’) 相關，推 測 δH 1.96 (H-5’) 旁邊接有醯胺羰基；δH 3.51 (H2-2’) 與 δC 138.9 (C-1)、172.4 (C-4’) 及 35.8 (C-1’) 相關，由此得知 C-1’ ~ C-8’為一組長側鏈；δH 2.82 (H2-1’) 與 δC 138.9 (C-1) 及 40.4 (C-2’) 相關，此長側鏈在 35.8 (C-1’) 與苯環的 δC 138.9 (C-1) 連接。综合以上解析並與文獻做比對，確認化合物 10 的結構為 N-(2’-phenylethyl)isovaleramide 55，是屬於已知物。以上解析所得之數據詳列 於表 12。. 97.
(99) 表 12、1H- and 13C-NMR data of 10 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No. 1 2 3 4 5 6 1’ 2’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’. 13. 1. C. 138.9 128.6 128.7 126.5 128.7 128.6 35.8 40.4 172.4 46.2 26.1 22.4 22.4. H. HMBC (H→C). COSY. 7.29 (1H, m) 7.12 (1H, m) 7.20 (1H, m) 7.12 (1H, m) 7.29 (1H, m) 2.82 (2H, t, J = 6.8 Hz) 3.51 (2H, t, J = 6.8 Hz). 1, 3, 5 2, 4, 5 2, 6 3, 4, 6 1, 2, 5. 3 2, 4 3, 5 4, 6 5. 1, 2,6, 2’ 1, 1’, 4’. 2’ 1’. 1.98 (2H, d, J = 7.0 Hz) 2.06 (1H, m) 0.92 (3H, d, J = 7.0 Hz) 0.92 (3H, d, J = 7.0 Hz). 4’, 6’, 7’, 8’ 5’, 7’, 8’ 5’, 6’, 8’ 5’,6’, 7’. 6’ 5’, 7’, 8’ 6’ 6’. [2M+H]+ [M+H]+. [2M+Na]+. 圖 56、化合物 10 之電噴灑電離質譜。 98.
(100) 圖 57、化合物 10 之紅外光譜。. 圖 58、化合物 10 之紫外光譜。. 99.
(101) 圖 59、化合物 10 之氫譜。. 100.
(102) 圖 60、化合物 10 之碳譜。. 101.
(103) 圖 61、化合物 10 之 COSY 圖譜。 6. 1'. 5. 1. 4. 2. H N. 4'. 5'. 6'. 2' O. 3. 102. 7'. 8'.
(104) 圖 62、化合物 10 之 HMBC 圖譜。. 6. 1'. 5. 1. 4. 2. H N. 4'. 5'. 6'. 8'. 2' O. 7'. 3. 6. H N. 1'. 5. 1. 4. 2. 4'. 5'. 6'. 2' O. 3. 103. 7'. 8'.
(105) 2.1.11 2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide (11) 之結構解析 OH. 6. 4. 5. 7. 3 2'. 2. 8 9. 10. Ν. 1'. 4' 3'. 6' 5'. 7'. O. 化合物 11 為無色無晶型粉末，比旋光度 [α]24D +12.3° (c 0.50, MeOH)， ESI/MS 顯示其分子離子峰 [M + H]+ 為 m/z 261 (圖 63)。由紅外光譜顯示有 烴基 (3302 cm-1) 和苯環 (1504 cm-1) 等官能基的存在 (圖 64)，紫外光譜在 240 nm 和 328 nm 有最大吸收 (圖 65)。 化合物 11 的氫譜 (CD3OD, 500 MHz) 顯示在芳香區中 (圖 66)，有 δH 7.48 (1H, dd, J = 8.0, 7.5 Hz, H-8)、7.78 (1H, dd, J = 8.0, 7.5 Hz, H-7)、8.07 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-9)、8.24 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6) 等四組訊號，為一個鄰位雙 取代的苯環；一組三取代雙鍵的質子訊號位於 δH 6.28 (1H, br s, H-3)；一組 三重峰訊號位於 δH 0.86 (3H, t, H3-7’)，為一末端甲基；在 δH 1.30 ~ 1.45 (8H, m, H2-3’ ~ 6’) 有 8 個氫的吸收訊號；在較低場域有 δH 1.75 (2H, br t, J = 7.5 Hz, H2-2’) 及 2.89 (2H, br t, J = 7.5 Hz, H2-1’) 的訊號吸收，與化合物 1 做比對， 其分裂形式相同，推測 H2-1’ ~ H3-7’ 為一長脂肪鏈。由碳譜 (圖 67) 得知 δC 156.4 (C-4)為接有異原子的不飽和碳，而根據 ESI/MS 所推測之分子量，與 紅外光譜實驗數據作比對，顯示有烴基與亞硝基存在，故推測此異原子為氧. 104.
(106) 原子。此外，在高場域出現的飽和碳訊號為 δC 33.0、32.6、30.1、30.4、28.6、 23.7 和 14.4；在低場域出現的 δC 142.0 (C-2) 和 δC 133.6 (C-10) 兩個訊號， 為接有異原子的不飽和碳。此外，由碳譜得知，δC 116.9 (C-9)、125.9 (C-7)、 125.8 (C-6)、125.4 (C-5)、133.6 (C-8) 和 133.6 (C-10) 為一組苯環的訊號。 綜合以上解析所得之數據詳列於表 13，並與文獻比對後確認化合物 11 為已 知物 2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide 53, 57。綜合以上解析所得之數據詳列 於表 13。. 105.
(107) 表 13、1H- and 13C-NMR data of 11 (CD3OD, 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C). No.. 13. 2 3 4 5 6 7 8 9 10. 141.2 107.5 156.4 125.4 125.8 125.9 133.6 116.9 133.6 33.0 32.6 30.1 30.4 28.6 23.7 14.4. 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’. 1. C. H. 6.28 (1H, br s). 8.24 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7.78 (1H, dd, J = 8.0, 7.5 Hz) 7.48 (1H, dd, J = 8.0, 7.5 Hz) 8.07 (1H, d, J = 8.0 Hz) 2.89 (2H, br t, J = 7.5 Hz) 1.75 (2H, br t, J = 7.5 Hz) 1.30~1.45 (2H, m) 1.30~1.45 (2H, m) 1.30~1.45 (2H, m) 1.30~1.45 (2H, m) 0.86 (3H, t, J = 6.8 Hz). [2M+H]+ [M+H]+. 圖 63、化合物 11 之電噴灑電離質譜。. 106.
(108) 圖 64、化合物 11 之紅外光譜。. 圖 65、化合物 11 之紫外光譜。. 107.
(109) 圖 66、化合物 11 之氫譜。. 108.
(110) 圖 67、化合物 11 之碳譜。 109.
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