新生期投予 Dexamethasone 對於成年期母鼠杏仁核功能之影響
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(2) 目錄 新生期投予 Dexamethasone 對於成年期母鼠杏仁核功能之影響 頁數 中文摘要. 04. 英文摘要. 07. 第一章 緒論. 10. 一、 研究背景. 11. 二、 研究目的. 19. 第二章 研究材料與方法. 20. 一、 實驗動物. 21. 二、 實驗藥品. 21. 三、 藥物投予方式. 21. 四、 離體胞外電生理學紀錄法. 22. 五、 行為測試. 23. 六、 西方墨漬法. 24. 七、 統計方法. 29. 第三章 實驗結果. 30. 第四章 討論. 46. 第五章 參考文獻. 56. 2.
(3) 第六章 圖表. 64. 3.
(4) 中文摘要 (Abstract in Chinese). 4.
(5) 中文摘要 臨床研究發現，新生時期接受糖皮質類固醇藥物治療的早產兒，於兒 童期及青少年期容易發生神經發育及功能異常；且研究指出，在老鼠新生 期投予 dexamethasone (DEX)，會造成腦部杏仁核 (amygdala) 發育不 正常有缺陷的現象，以及類憂鬱傾向的行為。台灣衛生署國民健康局統計 國內兩萬多名的樣本數中，女性發病的機率為男性的 1.8 倍。女性容易 出現憂鬱症的原因，可能與女性的生理週期和體內雌激素 (estrogen) 的 濃度變化有關，而過去的研究也發現 DEX 的投予會影響杏仁核等腦區 雌激素受體 (estrogen receptor, ER) 的表現量及活化後之反應機制。 本研究於新生鼠出生後第一天到第三天，每天接受一次皮下注射 DEX，並且在出生後每週測量體重一次，以觀察動物的生長情況，結果 顯示 DEX 組的動物體重有明顯下降的現象，但在八週齡後此現象改善。 進行離體胞外電生理紀錄，探討新生期投予 DEX，對青少年期及成年期 雌鼠杏仁核長期增益現象 (long-term potentiation, LTP) 之影響，結果顯 示新生期投予 DEX 之雌鼠於六週齡時，杏仁核長期增益現象會被抑制， 此抑制現象於十週齡仍可見。強迫游泳測試 (forced swimming test, FST) 發現六週齡與十週齡 DEX 組雌鼠類憂鬱行為有增加的現象。西方墨漬 法探討新生期雌鼠投予 DEX 後雌激素受體的變化，結果顯示六週齡及 十週齡 DEX 組雌鼠杏仁核之雌激素 α 型受體 (estrogen receptor alpha, ERα) 的 表 現 量 明 顯 減 少 ， 而 杏 仁 核 之 雌 激 素 β 型 受 體 (estrogen receptor beta, ERβ) 沒有變化。在本研究第二階段實驗，離體胞外電生 理紀錄中，給予腦片表面灌流 20 分鐘的雌二醇 (estradiol, E2) 後，六 週齡和十週齡 DEX 組雌鼠杏仁核的長期增益現象有回復的情況；強迫 游泳行為測試，在行為前四天給予動物皮下注射 E2，六週齡的 DEX 組 雌鼠類憂鬱行為有下降的傾向，但是十週齡的雌鼠則沒有明顯回復。. 5.
(6) 綜合以上實驗結果，新生期 DEX 的投予，會對雌鼠杏仁核之神經 傳導與神經突觸可塑性造成不良影響，以及增加其類憂鬱行為，而且此影 響會延續至雌鼠成年期。藉由 E2 的給予，可以降低新生期 DEX 的投 予對雌鼠杏仁核功能之影響，以及减少雌鼠青少年期之類憂鬱行為。藉由 此研究所得之成果，可提供 DEX 在臨床上用藥的安全考量和治療上的 參考。. 關鍵字：dexamethasone (DEX)、杏仁核 (amygdala)、雌激素 (estrogen)、長期增益現象 (long-term potentiation, LTP) 6.
(7) 英文摘要 (Abstract in English). 7.
(8) Abstract in English Clinical studies showed that pharmacotherapy of glucocorticoid steroid drugs in preterm infants have adverse effect on neurological development and dysfunction in childhood and adolescence. Results obtained from animal studies indicated that administration of dexamethasone. (DEX). in. neonatal. rat. can. cause. amygdala. development abnormally and defectively. It is long known that the incidence of female in depression is higher than male. The reason that women have depression easily may be due to the fluctuation of estrogen concentration during menstrual cycles. Previous studies have found that the treatment of DEX attenuate the expression and activation of the estrogen receptor (ER) in the pituitary gland and other brain regions. In this study, we injected DEX to the neonatal rat subcutaneously from the postnatal day-1 to day-3 daily. The body weight was measured weekly. Results showed that neonatal DEX treatment temporary decrease body weight in young rats, but not affected in the later life. We completed the electrophysiological experiments to investigate the possible adverse effect of neonatal DEX treatment on amygdaloid. long-term. potentiation. (LTP). formation. in. female. adolescence and adulthood rats. LTP formation is blocked in basolateral nucleus of amygdala in DEX treatment group, and it’s lasting. to. adulthood.. Neonatal. DEX. treatment. increased. depression-like behavior in childhood and adulthood. Western blot results showed that the expression of estrogen receptor alpha (ERα) was attenuated, and the expression level of estrogen receptor beta (ERβ). sustained.. Results. obtained. from. extracellular. electrophysiological recording showed that the LTP formation on both of the DEX group was rescue by co-administration of estradiol (E2). 8.
(9) Similar rescue effect had also been observed in the forced swimming test, the depression-like behavior was reducing after the E2 injection in four days, but the effect is not appeared in the adulthood. Comprehensively, synaptic. plasticity. neonatal DEX treatment changes amygdaloid and. increasing. depression-like. behavior. in. adolescence, these effects persist into adulthood. And it could be partially rescued by E2 treatment.. keyword：dexamethasone (DEX), amygdala, estrogen, long-term potentiation ( LTP). 9.
(10) 第一章 緒論 (Introduction). 10.
(11) 一、. 研究背景 (Research Background). A. 人 工 合 成 的 糖 皮 質 激 素 之 使 用 (The Usage Of Synthetic Glucocorticoid) 早產兒 (preterm infant) 常患有許多疾病，其中致死率最高的為呼吸 窘迫症候群 (Respiratory Distress Syndrome, RDS) (Lemons et al., 2001)。早產兒呼吸窘迫症候群的致病機轉，主要是由於肺部發育不成 熟，導致肺部界面張力蛋白 (pulmonary surfactant) 不足，造成肺泡或支 氣管在進行呼吸作用時無法維持擴張而容易產生塌陷，而發生呼吸窘迫甚 至 是 發 紺 (cyanosis) 以 及 呼 吸 性 及 代 謝 性 酸 血 症 (respiratory and metabolic acidosis) 等現象 (Tooley and Dyke, 2003)。早在 1972 年就 發現糖皮質類固醇 (glucocorticoid) 能有效地降低早產兒 RDS 的罹患 率 (morbidity) 及死亡率 (mortality) (Liggins and Howie, 1972)。後續的 研究也證實糖皮質類固醇可以藉由活化其受體 (glucocorticoid receptor, GCR) 而與細胞核中特定的轉錄因子，如 nuclear factor kappa B, NF-κB 結合，抑制發炎相關蛋白的表現 (Auphan et al., 1995)。另外在許多研究 中也證明，糖皮質類固醇在加速肺部的發育成熟以及促進肺泡表面張力素 的生合成都具有顯著的效果 (Liley et al., 1989; Vyas and Kotecha, 1997; Muller et al., 2011)，因此合成的糖皮質類固醇才會被廣泛的使用在慢性 肺疾病的預防與治療上。目前臨床上多使用人工合成的糖皮質類固醇 (synthetic glucocorticoid) 來減低早產兒罹患慢性呼吸系統疾病 (chronic lung disease) 的機率。其主要作用機制，為人工合成的糖皮質類固醇可 藉由促進第二型肺泡細胞 (type II pneumocyte) 之成熟及分化，促進肺 部之成熟，以增加表面張力素之分泌。此外，亦可透過減低血管通透性， 以減少蛋白質進入肺泡中，並促進肺部水分的排除，促使間質組織 (interstitial tissue) (Mills et al., 1993) 成熟，增加肺的順應性 (lung. 11.
(12) compliance) 與最大肺容積 (maximal lung volume)，增進表面張力素治 療的反應等，使 RDS 的病情可以受到控制 (Lemons et al., 2001; Lee et al., 2005)，進而提升早產兒的存活率，降低死亡風險及早產兒罹患慢性 呼吸系統疾病之產生。 但在後來追蹤研究卻發現，新生時期接受糖皮質類固醇藥物治療 (dexamethasone-treated group) 的早產兒，於兒童期及青少年期，發生 神經發育及功能異常的機率較一般接受安慰劑 (placebo group) 的早產 兒高 (O'Shea et al., 1999)；動物實驗上，新生期投予 DEX 會造成新生 鼠體重明顯下降，這種現象會持續到老鼠成長到八週齡時，而且會造成腦 部海馬迴 (hippocampus) 神經突觸可塑性降低 (Lin et al., 2006)；且也 有研究指出，新生期投予 DEX，會造成老鼠腦部杏仁核 (amygdala) 發 育不正常而有缺陷的現象 (Zuloaga et al., 2011)。新生期投予 DEX 對於 整體生長、神經發育、行為、學習記憶甚至是對於外界壓力的易感性 (stress susceptibility) 上都可能存在著負面的影響 (Flagel et al., 2002; Neal et al., 2004)。與控制組 (saline group) 相比，新生期接受 DEX 注 射的動物，成年後呈現類憂鬱行為的次數較控制組明顯，且導致下視丘─ 腦下垂體─腎上腺機制 (hypothalamo-pituitary-adrenal, HPA axis) 的異 常，使得在下視丘分泌的促腎上腺皮質激素釋放因子 (corticotropin-releasing factor) mRNA 表現量降低，導致情緒性疾病的產 生 (Kunugi et al., 2006; Nagano et al., 2008)。研究也指出，給予新生期 投予 DEX 的老鼠進行強迫游泳測試 (forced swimming test) 和開放式 行為測試 (open field locomotion) 等實驗，發現在有壓力的情況下，其 憂鬱行為的反應會比對照組老鼠的反應還強，必須要投予促腎上腺皮質激 素 (adrenocorticotrophic hormone; ACTH) 的相似物 (analogue)，才能 減少新生期投予 DEX 所帶來的長期憂鬱行為影響 (Felszeghy et al., 12.
(13) 1993)。 B. 憂鬱症 (Depression) 精神疾病有很多種類，較常見的精神疾病，包括憂鬱症 (depression)、焦慮症 (anxiety disorder) 和精神分裂症 (schizophrenia) 等。世界衛生組織 (World Health Organization； WHO) 將憂鬱症、愛 滋病 (AIDS)、癌症並列為 21 世紀重大疾病，美國國家心理衛生研究所 (National Institute of Mental Health) 統計，在美國每年平均有 9.5% 的 人正在遭遇憂鬱症的痛苦，可見此病是現代人所必須了解的疾病之一。憂 鬱症的患者常會伴隨著長期低落的情緒，覺得生活沒有希望，缺乏自信、 人生沒有價值或是處於懊悔罪惡的情緒中、對環境壓力過度反應或過少反 應、絕望和自暴自棄 (Pare, 1992)；體重方面也會因為食慾不好而急速 降低，或是食慾增加而暴飲暴食導致體重增加 (Stunkard et al., 1990)； 精神方面注意力不集中、無法專注在一件事情上面、容易覺得疲倦和勞累 (Gupta, 2009)，由於憂鬱症容易被忽視，所以常常導致病患在痛苦中沒 有自覺就醫，嚴重時會導致患者有自殺輕生的念頭及行為產生 (Maulen, 2002)。 目前已知憂鬱症的產生和腦中的一些化學物質有關，在人類的腦中有 一種化學物質血清素 (serotonin)，血清素具有促進正向情緒，使人較為 樂觀、正面，而在憂鬱症的患者體內常伴隨著血小板中血清素濃度下降的 情形 (Pivac et al., 2001; Sagud et al., 2008)；另外有研究指出，憂鬱症 的成因和家族母系遺傳 (maternal inheritance) 有關，在家族中有憂鬱症 病史，得到憂鬱症的機率有兩倍之高 (Raymer et al., 2005; Bergemann and Boles, 2010)；長期的下視丘─腦下垂體─腎上腺機制異常活化，也會 導致憂鬱症的發生 (Young et al., 2004; Kaestner et al., 2005)。根據. 13.
(14) 2006 年美國國家心理衛生研究所的統計，美國女性一生中罹患憂鬱症的 平均機率為 25%，男性則為 15%；在 2002 年，臺灣衛生署國民健康局 (Bureau of Health Promotion, Department of Health, R.O.C. ) 統計國內 兩萬多名樣本數裡，女性憂鬱症患者占 10.9%，男性為 6.9%，女性發 病的機率為男性的 1.8 倍。而女性為何憂鬱症發病機率會大於男性呢？ 女性容易出現憂鬱症的時期有月經前、生產後和更年期時，目前研究指出 可能是由於女性的生理週期和體內性激素變化導致 (Stoffel and Craft, 2004; Soares and Zitek, 2008)。女性的卵巢製造出的性激素，均屬於類 固醇激素，而其中的雌激素 (estrogen) 有穩定腦血流量 (cerebral blood flow) 的功能，當雌激素缺乏，則腦血流量會減少，導致人的思考能力會 下降、專心度不夠和有憂鬱的傾向。經前的女性生理上會有乳房脹痛和下 腹部脹痛的現象，在心理上會出現較平常明顯憂鬱的情緒，對於平常有興 趣的事物興趣缺缺的情況，如果憂鬱情形有加劇的傾向則須轉介到精神科 治療；產後的婦女會有短暫的消沉、心情低落、食慾不佳和疲勞的現象， 在醫學上稱為產後憂鬱症 (postpartum depression)，由於產後的婦女其 體內的激素會有大幅度的改變，尤其是雌激素和黃體素 (progesterone) 會急速降低，而影響腦部的活動 (Presl et al., 1975; Stein, 2001)；更年 期的婦女，由於卵巢製造雌激素的能力降低，使得雌激素的產量變少，慢 慢的出現經期不規則或是月經慢慢減少的現象，生理上會出現熱潮紅、出 冷汗和睡眠障礙的現象，在心理上，更年期的婦女有時候會伴隨著情緒低 落、憂鬱的症狀，臨床上對於有憂鬱症狀的更年期婦女會投予雌激素的替 代治療。此外，對於女性憂鬱症病患的治療，臨床上亦會投予雌激素類的 藥物，由此可知，女性憂鬱症的產生和雌激素有密不可分的關係 (Lokuge et al., 2011)。. 14.
(15) C. 雌激素 (estrogen) 雌激素由卵巢、子宮、睪丸和腎上腺素產生，主要功能有調節生殖器 官的發育、促進細胞的生長和調控中樞神經系統等。人體的雌激素有三 種，雌二醇 (estradiol)、雌 三 醇 (estriol) 和 雌固酮 (estrone)，其中 雌二醇扮演較為重要的角色，它負責控制和監測人體的生理需求，且活性 是是另外兩種雌激素的數十倍。人體內有許多區域有雌激素受體 (estrogen receptor, ER)，主要分佈在卵巢、子宮、陰道、骨盆…等，而 在一些大腦的邊緣系統 (limbic system)，例如海馬迴和杏仁核，都有雌 性素受體的分佈。杏仁核是邊緣系統中對雌激素的作用特別敏感的區域之 一；第一：用放射性元素標定雌激素，會看到在杏仁核的區域有高濃度的 雌激素 (Pfaff and Keiner, 1973)，第二：用雌激素處理過的杏仁核，會增 加內側區域 c-fos 蛋白的表現量 (Greco et al., 2003a; Greco et al., 2003b)，第三：投予雌激素的杏仁核腦區，可以看到突觸數量明顯增加 的現象，且樹突的分支密度變高 (Nishizuka and Arai, 1982)。雌激素的 存在與杏仁核所控制的憂鬱和焦慮情緒有關 (Zhou et al., 2004; Walf and Frye, 2006)。在動物實驗上，給予切除卵巢的老鼠投予雌激素在杏 仁核上，可以減輕老鼠的類憂鬱現象。將老鼠去掉卵巢，施打雌激素於內 側 杏 仁 核 (medial nucleus of amygdale) ， 發 現 在 高 架 十 字 型 迷 宮 (elevated plus maze) 和開放式行為探索 (open field behavior) 都有降 低憂鬱的反應 (Walf and Frye, 2006)。且在具有憂鬱行為的成年雌鼠杏 仁核腦區可以發現其 α 型雌激素受體呈現表現較低的現象 (Scharfman and MacLusky, 2006)。這些現象證明了杏仁核是雌激素作用的重要區 域，而這個作用會跟動物憂鬱的表現有關。 雌激素受體有兩種，分別為 α 型雌激素受體 (estrogen receptor α, ERα) 及 β 型雌激素受體 (estrogen receptor β, ERβ)，兩種雌激素受體 15.
(16) 在組織內分布的範圍不同 (Couse et al., 1997)，可以被雌激素活化的程 度也不同 (Paech et al., 1997)，甚至對雌激素的專一性也會有所差異 (Kuiper et al., 1996)。雌激素受體皆為核受體的成員，其蛋白質可以分為 五個區域，這五個區域包括 DNA 結合區、激素結合區和活化區。在動 物體內不同的細胞會形成不同的雌激素接受器，而接受器的形式可以由 ERα 和. ERβ 組 合 成 同 二 聚 體. (homodimers) 或 異 二 聚 體. (heterodimers)。目前已知雌激素受體的活化可分為四種路徑 (圖一)，其 中包含配位基依賴性 (ligand-dependent) 及非依賴性 (independent) 的 活化方式。未和雌激素接合前的雌激素受體會與熱休克蛋白 (heat shock proteins) 結合，並存在於細胞質中，當與雌激素接合後，熱休克蛋白會 離開雌激素受體，此時雌激素受體進入細胞核且因自磷酸化的原因吸引一 些輔助因子 (cofactor)，最後和下游的基因反應位結合，形成一種基因轉 錄子 (transcription factor)，可以促進或抑制基因的表現，且調控蛋白質 轉錄的活性 (Pavao and Traish, 2001; Charitidi et al., 2009; Shi et al., 2010)。雌激素也可藉由另一種非正式的路徑去活化其受體，例如在神經 細胞或乳癌細胞等，這些細胞的膜上的雌激素受體當與雌激素結合後，會 誘 發 促 細 胞 分 裂 活 化 蛋 白 激 脢 (mitogen activated protein kinase, MAPK)，並活化下游的轉錄因子，像是 AF1、fos 和 NF-kb 等，進而 調控下游基因的活性 (Duan et al., 2002; Albanito et al., 2008)。ERα 和 ERβ 已知在 DNA 及賀爾蒙有相似的結合能力，但是兩個受體對於不同 的賀爾蒙有不同的親和力，例如 ERα 對雌二醇和雌固酮有較好的親和 力，而 ERα 和 ERβ 在體內分佈的區域也不大相同，ERα 主要分布於 雌性動物的生殖器官，而 ERβ 則是主要分佈在雄性動物的生殖器官。目 前研究已指出，ERα 和 ERβ 皆有參與學習與記憶的機制，在人類的認 知功能疾病，阿茲海默症的患者的大腦發現其粒線體中的 ERβ 有缺乏的. 16.
(17) 現象，且 ERα 異構體 (splice variant) 的變化也和阿茲海默症息息相 關，尤其在女性裡，發現阿茲海默症的患病率比男性還高 (Ishunina et al., 2005; Ishunina et al., 2007; Zhao et al., 2011; Long et al., 2012)。 雌激素和糖皮質激素的交互作用會在內分泌系統產生不同的反應；腹 腔注射 (intraperitoneal, i.p. ) 投予 DEX，會抑制雌激素在腦下垂體 (the pituitary gland) 的活性 (Terakawa et al., 1985)；投予去卵巢的雌鼠 DEX，在下視丘視旁核 (hypothalamic paraventricular nucleus； PVN) 和 視 上 核 (supraoptic nucleus) 的 部 位 發 現 ERβ 的 免 疫 呈 色 反 應 (immunoreactive) 比投予苯甲酸二醇 (estradiol benzoate; EB) 的雌鼠 還強 (Suzuki and Handa, 2004)；皮下注射 (subcutaneous, s.c.) 給予 去卵巢雌鼠 DEX ，發現會藉由給予皮質固醇 (corticosterone) 而影響 ACTH 的分泌，使得由雌激素活化的 HPA axis 失調，而促使 ERα 引 發 HPA axis 的負回饋機制 (negative feedback)；而 ER 也會藉由跟 DEX 的接合而去調控一些基因轉錄機制 (Weiser and Handa, 2009; Cvoro et al., 2011)。這些現象顯示， DEX 的投予可能會影響不同腦區 ER 的表現量及活化後之反應機制。 D. 情緒中心─杏仁核 (The center of emotion – Amygdala) 動物在面臨壓力時，可能會產生一些負面情緒，例如：恐慌、焦慮和 憂鬱，而這些負面情緒主要是由大腦中邊緣系統 (limbic system)，靠近 額顳葉 (frontotemporal lobe) 的杏仁核所控制的。顳葉的杏仁核，包括 基底核 (basal nuclei)、外側核 (lateral nuclei)和中央核 (central nuclei) 等構造，而當中央核受到損傷時，會導致動物對於恐懼不再感到害怕，對 於威脅也不會有高度反應 (hyperactive) (Davis, 1992; Davis et al., 1994)。有研究顯示，憂鬱患者的病因部分來自於杏仁核的過度不正常的 活化，而異常活化的原因來自於控制正面情緒的左前額葉無法運作，而導. 17.
(18) 致杏仁核的興奮無法受抑制，使得患者會陷入緊張、焦慮和憂鬱的情緒當 中 (van Reekum et al., 2007)。研究指出，在動物早期給予 DEX 的藥 物治療，發現在杏仁核某些特定區域會造成細胞凋亡的現象，而這個影響 會持續到成年期，並且在情緒性記憶、激素的分泌以及性功能上都看得此 持續性的現象 (Zuloaga et al., 2011)。經由離體胞外電生理實驗紀錄 (in vitro extracellular electrophysiological recording) 發現，一般正常老鼠的 杏仁核處，施以強直的電刺激 (tetanus stimulus) 之後，可以誘發出長期 增益現象 (long-term potentiation, LTP)。因此在情緒性記憶的獲取及形 成長期記憶 (long term memory) 的過程中，杏仁核中的 LTP 扮演著重 要的角色 (Rogan et al., 1997; Maren, 1999)。 憂鬱症是 21 世紀重要疾病，而杏仁核是人體產生負面情緒的腦 區，如何從杏仁核機制研究憂鬱症的病因是目前探討的方向之一。已知 DEX 的投予會影響下視丘─腦下垂體─腎上腺機制的調節，導致動物在面 對壓力時生理的反應和情緒上的記憶受到影響，而根據臨床上統計，女性 憂鬱症的發病機率比男性高約 1.8 倍，可能來自於女性的生理週期雌激 素的變化。本研究主要目的在探討新生期雌鼠投予 DEX 後，對杏仁核 功能之長期影響。藉由此研究所得之成果，可提供 DEX 在臨床上用藥 的安全考量和治療上的參考。. 18.
(19) 二、. 研究目的. 本研究的主要目的，為了解新生期投予人工合成之糖皮質激素 DEX 對於成年雌鼠杏仁核功能之影響，其中包括下列分項目標： 1. 探討新生期投予 DEX，是否對雌鼠杏仁核 LTP 的形成及維持造成 影響。 2. 探討新生期投予 DEX，是否造成成年期雌鼠類憂鬱行為表現之增 加。 3. 探討投予 DEX，是否藉由改變杏仁核中的雌激素受體的表現或反 應，而產生行為上之改變。 4. 釐清造成前述變化之可能機制。. 19.
(20) 第二章. 研究材料與方法. (Materials and Methods). 20.
(21) 一、實驗動物 (Animals) 實驗中所使用之 Wistar 品系的公鼠與母鼠，(購自樂斯科生物科技 股份有限公司)，實驗進行期間動物皆飼養於國立臺灣師範大學生命科學 系之動物房，飼養期間皆提供充分的飼料和水分，動物房內採 24 小時 自動溫濕調控，室溫約維持於攝氏 23~28 度，照明採12/12 小時 (早上 10點亮燈、晚上10點關燈)。公鼠與母鼠飼養到成年後自行進行配種，母 鼠懷孕期大約為 21 到 23 天，可以產下幼鼠，幼鼠離乳期為四週，離 乳後公鼠母鼠分籠，並將母鼠飼養到六到十週齡再進行實驗，所有的實驗 均於動物之光週期進行，動物房清潔之維護由動物房工作人員負責，本研 究之動物實驗均經由國立臺灣師範大學實驗動物管理委員會之審查及監 督及實驗過程依據實驗動物倫理規範來進行。. 二、實驗藥品 (Drugs) A. Dexamethasone (DEX) 購自於南光化學製藥股份有限公司。 B. ER agonist (Lund et al., 2005) 17β-estradiol (E2) (Sigma, Taufkirchen, Germany) 0.25 mg/ kg, s.c., dissolved in 0.2 mL DMSO 於正常環境強迫游泳行為測試前 30 分鐘，週邊投藥。. 三、藥物投予方式 (Drug administration) 母鼠產下幼鼠後將其隨機分成兩組，為控制組 (control) 和實驗組 (DEX) 。幼鼠出生後第一到三天 (postnatal day 1~3, P1-P3)，採取皮下 注射 (subcutaneous injection; s.c. ) 的方式投予藥物，兩組實驗動物分別 注射生理食鹽水或 DEX，並在施打藥物後的每週定期測量實驗動物之體 重，測量至成年期為止，藉以驗證投予藥物成功與否。此投藥方式是參考 21.
(22) 過 去 文 獻 內 容 所 使 用 的 藥 物 劑 量 ， DEX 的 注 射 量 是 依 照 P1 (0.5 mg/kg)、P2 (0.3 mg/kg)、P3 (0.1 mg/kg) 的遞減方式投藥 (Lin et al., 2006)，控制組則投予相同遞減劑量的生理食鹽水，等到飼養到六到十週 時，再進行實驗流程。 四、離體胞外電生理學紀錄法 (in vitro extracellular electrophysiological recording) 探討在新生期投與大白鼠 DEX，是否會影響其大腦區杏仁核的神經 功能。 A. 杏仁核腦薄片製備 (Amygdala slice preparation) 先將六週到十週的老鼠放置不銹鋼動物斷頭台 (guillotine)，將其 斷頭犧牲取腦。用剪刀將動物頭皮剪開，剪開頭皮後使用小骨剪將腦 上的頭蓋骨剝除，頭蓋骨去除後看到全腦，再用小鑷子或是剪刀將腦 膜挑開，最後用取腦扁平器將腦神經與腦殼分離，並將全腦放置在裝 有溫度為 4℃ 的人工腦脊髓液 (artificial cerebrospinal fluid, ACSF) ( 參考溶液配製一 ) 中，整個實驗過程腦皆放置於人工脊髓液中，並 供給持續不間斷的充氧氣體 (95% O2 和 5% CO2 )。之後將腦袋放置 有鋪好濾紙的培養皿中，並浸入充氧的人工脊髓液。接著用解剖刀將 小腦去除，並將大腦切分為左右半腦，然後將半腦用快乾劑黏住在固 定載物台上，放置在半冰半水的充氧人工脊髓液水槽裡，接著使用震 動切片機 (vibrotome)。以刀片使用水平切法 (horizontal section) 的 方式將大腦切成厚度為 400 µm 的腦薄片 (brain slice)。取有杏仁核 區域的腦薄片，並將這些腦薄片至於充氧的人工腦脊髓液，放置至少 一小時後再進行離體胞外電生理學紀錄法實驗。 B. 胞外電生理學紀錄法 (extracellular electrophysiological recording) 使用胞外電生理學紀錄法，將有杏仁核區域的腦薄片移至以 95% O2 和 5% CO2 混 和 氣 體 持 續 充 氣 之 ACSF 灌 流 的 紀 錄 槽 22.
(23) (recording chamber) 中，並以黏有尼龍細線的不銹鋼環固定杏仁核腦 薄片。灌流的速率為每 3 秒一滴的流速，並利用循環式加熱器使紀錄 槽內溶液的溫度維持在 32 ± 0.5 ℃。將雙極型刺激電極擺放在側杏仁 核 (basolateral nucleus of amygdale, BLA) 區域，紀錄電極擺放在杏 仁中央核 (central nucleus of amygdale, CA) 區域，以誘發突觸後反 應 (field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)。當訊號呈穩定狀 態後，開始記錄突觸的基礎訊號 (baseline)，約穩定紀錄 20 分鐘後， 再給予高頻電刺激 20 秒一次，總共三次，觀察其訊號變化，之後再 以 ACSF 灌流，持續記錄一小時以上。. 【溶液配製一】 ACSF 10X Stock (1L，保存於 4℃，一週內使用完畢) 藥物名稱 (分子量). 濃度 (mM). 重量 (g). NaCl (58.5). 1170. 68.45. KCl (74.5). 47. 3.50. CaCl2 (111). 25. 2.78. MgCl2．6H2O (203.3). 12. 2.44. NaH2PO4．H2O (138). 12. 1.66. 稀釋 ACSF 10X Stock 為 ACSF 1X 溶液，並加入以下 powder 藥品名稱 (分子量). 濃度 (mM). 重量 (g). NaHCO3 (84). 25. 2.1. Glucose (180). 11. 1.98. 五、 行為測試 (Behavioral experiment) A. 自發性運動行為 (Locomotor activity) 23.
(24) 此行為實驗主要測試動物活動能力及自發性探索行為，實驗目的 為測試排除藥物的投予後，是否影響實驗動物之活動能力及自發性探 索行為，進而改變動物的運動能力。實驗操作方法為：將動物放置於 42 X 42 X 40 公分的壓克力黑箱中，讓實驗動物在黑箱中可以自由活動， 透過正上方所設置的小型直立式攝影機可以拍攝到大白鼠的活動，藉 由 EthoVision video tracking system 設 備 (EthoVision; Noldus, NED) 每秒鐘可以拍攝六次動物的中心點位置變化，再將動物的活動 軌 跡 傳 送 到 電 腦 螢 幕 上 觀 察 動 物 的 水 平 移 動 情 形 (distance of horizontal movement)，利用此軟體累計運算，每五分鐘紀錄並統計一 次老鼠的活動情形，連續記錄到十五分鐘。. B. 強迫游泳 (Forced swimming test, FST) 行為測試主要源自動物怕水的習性，正常情況下動物放入水中都 會奮力掙扎，然而有憂鬱傾向的動物，投入水中其掙扎情況會明顯下 降，即所謂不動的時間 (immobility time) 會增加 (Porsolt et al., 1977)。實驗設計為將動物放在一個直徑 18 公分，高 90 公分的壓 克力透明圓柱桶內，進行實驗時會將圓柱桶注入高 60 公分，溫度約 25℃ 的自來水，動物放入圓柱桶內，使其漂浮於圓桶內，尾巴無法碰 觸到圓桶底部。實驗第一天先讓動物漂浮於水中 15 分鐘當作訓練， 15 分鐘後將動物撈起，至於壓克力鼠籠中，並以 60W 黃光燈泡照 明，讓動物自然烘乾，再放回原本的飼養籠內。第二天以同樣方式將 動物置入水中，以攝影機紀錄動物 5 分鐘內掙扎的狀況，以動物口鼻 部沒入水面下，且四肢沒有明顯划水之動作定義為不掙扎，累計動物 不掙扎的總時間，並跨組別進行比較差異。. 六、西方墨漬法 (Western blotting) 24.
(25) 利 用 硫 酸 十 二 酯 鈉 聚 丙 烯 醯 胺 凝 膠 電 泳 法 (sodium. dedecyl. sulphate. polyacrylamide. gel. electrophoresis,. SDS-PAGE) 依各種蛋白質具有不同分子量之特性來進行分離。本次實驗 所針對探討的蛋白質為雌激素 α 型受體及雌激素 β 型受體。. 製備 SDS-PAGE 遵照 Laemmali 法 (Laemmli, 1970) 進行 SDS- 聚丙烯醯胺凝膠 電泳 (SDS-polyacramide gel electrophoresis)，將蛋白質分離。將配製 完成之 15 % separation gel (參考，溶液配製二) 注入事先裝設好之凝膠 膠玻璃板，膠體達適當高度後，徐徐加入 water – saturated isopropanol 於膠體上層，而後靜置鑄膠器於室溫環境，待凝膠凝固後，除去水或 isopropanol 層，注入 stacking gel (參考，溶液配製二) 溶液並插上梳狀 模版 (comb)，待其凝結後即完成 SDS-PAGE gel 的製備。. 【溶液配製二】 使用不同濃度的 SDS-PAGE gel 配方如下： Separation Gel Percentage. 10 %. Stacking Gel. 12.5 % 15 %. Solution A. 2.0 mL. 2.5 mL. 3.0 mL. Solution B. 1.5 mL. 1.5 mL. 1.5 mL. Solution C H2O. 0.45 mL. 0.75 mL 2.5mL. 2.0 mL. 1.5 mL. 1.8 mL. TREMD. 3 µL. 4.5 µL. 10%APS. 30 µL. 13.5 µL. 製備 gel 的各種溶液 Solution A: 30 % (w/v) acrylamide, 0.8 % (w/v) Bis-acrylamide 25.
(26) Acrylamide. 150.0 g. Bis-acrylamide. Solution B: 1.5M Tris/HCl. 4.0 g. pH 8.8,. Tris. 0.4% SDS 90.0 g. SDS. Solution C: 0.5M Tris/HCl. 500 mL. 2g. 500 mL. pH 6.8, 0.4% SDS. Tris SDS. 30.3 g 2g. 500 mL. 細胞均質化 (Homogenization) 動物施以斷頭犧牲後，取出杏仁核的 lateral and basolateral 組織，依腦 組織重量等比例加入 HB buffer (homogenizing buffer/ Protease inhibitor) 溶液混合後，在冰浴中以研磨器將腦組織磨碎後，在 4℃ 下以 12000 g 之速度離心 45 分鐘。取上清液後利用protein assay (Bio-Rad 1-800-4, U.S.A.) 及 QuantELISA reader (Bio - TEK Instrument Inc., U.S.A.) 進行蛋白質定量。. 蛋白質定量 (quantitation) 蛋白質定量以牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 做為參 考標準，利用 Bradford 反應，偵測標準品與檢體在 595 nm 波長吸光 值變化，繪製標準曲線，並利用檢體吸光值與標準曲線進行迴歸運算，檢 26.
(27) 測蛋白質的濃度 (Bradford, 1976; Braunstein and Halwer, 1986)。之後 取定量完畢蛋白質樣本。. 電泳 (electrophoresis) 取定量的蛋白質樣本與 4X protein loading dye (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 30% glycerol and 0.2% bromophenol blue) 加二次水混 合，總量為 20 µl，並以 95℃ 加熱 5 分鐘。再將sample 注入 comb 所 留 下 的 well 中 ， 以 50 V 之 電 壓 進 行 電 泳 ， 當 sample 進 入 下 層 separating gel 中，再以 90 V 之電壓進行電泳。待電泳結束後，將膠片 從玻璃板中取出，進行電泳轉印 (electrical blotting) 的步驟。 蛋白質電泳轉印法 (Electrial blotting) 將 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane 以下列溶液清洗：甲 醇 15 分鐘，蒸餾水 15 分鐘，Blotting buffer 15 分鐘，作為前處理。 在半濕轉漬槽 (semi-dry transfer unit) 內預鋪上兩張經 blotting buffer 浸潤的 3M 濾紙 在鋪上已預處理完全的 PVDF membrane。把跑完電 泳的 SDS-PAGE 凝膠取出，平鋪在 PVDF membrane 上，並趕走氣 泡，在凝膠上方加鋪兩張經 blotting buffer 浸潤的 3M 濾紙。完成裝置 後，以 0.3 安培於室溫反應 30 分鐘，將蛋白質轉印於 PVDF membrane 上。 封阻步驟 (blocking) 轉印完成的 PVDF membrane 放入 5% 脫脂牛奶／TBST 中，在 4℃ 反應過夜，以阻斷非特異性結合 (non-specific binding)。. 27.
(28) 免疫呈色法 (Immunostaining) 將 PVDF membrane 以 washing buffer 洗三次，每次 10 分鐘， 以 1x TBST 泡製 3% 的脫脂牛奶／TBST，加入 first antibodies，雌激 素 α 型受體 (rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)，或雌激素 β 型受體 (rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)，室溫下反應一小時。反應完後以 washing buffer 洗三次，每次 10 分鐘，加入以 1xTBST 稀釋的 HRP conjugated secondary antibodies，室溫下反應一個小時。反應完後以 washing buffer 洗三次，每次 10 分鐘。最後於暗房，以 ECLTM 套組呈色，將 luminol 和反應促進劑混合液，倒入 PVDF membrane 上使之遍佈。Luminol 和 secondary antibody 上的 HRP 於溫室下反應 10 至 30 秒，產生的螢光 物質，利用 western lighting 呈色套組 (PerkinElmer Life Science, U.S.A.) 呈色，以 X 光底片 (Kodak Biomax 8 X 10 inch) 顯影。即可得清晰結果。 最後利用密度測定儀 (densitometer，Pharmacia Biotech) 搭配軟體 ImageMaster 來量化結果 。. 【西方墨點法中所使用之一級抗體及稀釋倍率】： A. Monoclonal mouse anti-β actin (ab8226, abcam., UK) 使用濃度 1:10000 B. Polyclonal rabbit anti-ERα (sc-7207, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) 使用濃度 1:1000 C. Polyclonal rabbit anti-ERβ (sc-8974, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA) 使用濃度 1:1000 【西方墨點法中所使用之二級抗體及稀釋倍率】： A. Peroxidase-conjugated affinipure goat anti-mouse IgG ( H+L) 28.
(29) (Jackson Immuno Research Laboratories, U.S.A 115-035-003) 使用 濃度 1: 6000。 B. Peroxidase-conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG ( H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, U.S.A 111-035-003) 使用 濃度 1: 3000。 七、 統計方法 (Statistics) 所有之行為實驗結果數值以 Mean ± S.E.M. 方式表示，複數比較 則進行 one-way ANOVA 比較，若是行為測試不同處理則採用 one-way repeat measure ANOVA，另外對兩組數據進行比較時使用 student t-test。再運用 The Scheffé Test (Scheffe, 1947) 進行事後比較線性趨勢 分析 (post-hoc linear trend)，probability value ( p value < 0.05 ) 被認定 具有統計上之顯著差異。 所有蛋白質含量分析結果數值均以 optical density 之百分比方式 表示，每樣本之結果利用 internal control (β-actin) 進行校正後，以 control 組的蛋白質含量設定為標準 100 %。複數比較則進行 one-way ANOVA 比 較 ， 若 是 不 同 處 理 則 採 用 one-way repeat measure ANOVA，另外對兩組數據進行比較時使用 student t-test。再運用 The Scheffé Test (Scheffe, 1947) 進行事後比較線性趨勢分析 (post-hoc linear trend)，probability value ( p value < 0.05 ) 被認定具有統計上之顯 著差異。. 29.
(30) 第三章. 實驗結果. (Results). 30.
(31) 實驗一 A. 實驗目的： 探討新生期投予 DEX，對青少年期及成年期雌鼠杏仁核長期增益現 象之影響。 B. 實驗流程：將實驗動物分為下列四組 Group-1 為六週齡雌鼠 Control group，P1-P3 投予 saline。 Group-2 為六週齡雌鼠 DEX group，P1-P3 投予 DEX。 Group-3 為十週齡雌鼠 Control group，P1-P3 投予 saline。 Group-4 為十週齡雌鼠 DEX group，P1-P3 投予 DEX。 新生鼠於出生後 P1-P3，每天接受一次老鼠皮下注射，其劑量為 (P1： 0.5 mg/kg； P2：0.3 mg/kg； P3：0.1 mg/kg) (Lin et al., 2006)。並在 出生後每星期量體重一次，來觀察動物的生長情況，藉此判斷藥物投予成 功與否。老鼠滿六週和十週，開始接受電生理測試實驗。 電生理實驗方法：參閱實驗方法中相關說明。 C. 實驗流程圖：. D. 實驗結果： 1.. 體重測量結果：. 分別比較各組出生後三天以及第一、二、三、四、六、八和十週的體 重。由圖二結果可以看出，新生期投予 DEX 後，雌鼠在體重上，第三 天、第一週、第二週、第三週、第四週以及第六週 DEX 較 Control 組 31.
(32) 體重輕，呈現生長趨緩的現象，且達統計上顯著差異 [F(1,14)=43.967, p<0.001]，而差異於八週獲得改善。在動物試驗觀察中已發現 DEX 會明 顯地影響個體整體發育成長的情形 (Flagel et al., 2002; Neal et al., 2004)，此現象在臨床上使用 DEX 的早產兒亦可發現。而通常最能直接 反應整體生長情形的指標便是體重上的變化。由圖二可發現新生期接受 DEX 投予的實驗組動物發育確實受到影響，所以可證明 DEX 投予成 功，故進行以下階段實驗，電生理紀錄、強迫游泳以及 western blot 實 驗。 2. 電生理學紀錄法結果： 以六週和十週大鼠之腦薄片，給予連續三次間隔 20 秒的 100 Hz（1 秒）的電刺激可以成功地在杏仁核區域誘發長期增益現象的表現。由圖三 結果顯示，在六週 control 組，給予高頻電刺激後的一小時其 fEPSP 之 斜率為刺激前訊號的 191 ± 14%，n =7。然而在 DEX 組，一小時後斜 率表現為刺激前基礎訊號的 99 ± 5%，其 LTP 的表現明顯小於 control 組，n = 7; p < 0.01 (t-test)。而由圖四結果顯示，在十週 control 組，給 予高頻電刺激後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號的 179 ± 12%，n=7。然而在新生期投予 DEX 的大白鼠其長期增益現象的表現在 誘發後的第 28 分鐘才小於 control 組，其 fEPSP 的斜率為 109 ± 7%，n=7，p < 0.01 (t-test)。由前人研究得知，新生期投予 DEX 會影響 之後腦部海馬迴上 LTP 的形成 (Lin et al., 2006)。本實驗電生理紀錄法 結果圖看到，新生期投予 DEX 會抑制六週老鼠 LTP 表現，第 20 分鐘 給予高頻電刺激後，六週 DEX 組的杏仁核無法產生 LTP ；十週 DEX 組的杏仁核腦片，在給予高頻電刺激後，可以誘發 LTP 的形成，但是維 持的時間不長。因此新生期投予 DEX，會影響青少年期雌鼠杏仁核上 LTP 的形成，但是到成年期可以漸漸回復，不過回復的現象不能持久。. 32.
(33) 實驗二 A. 實驗目的： 探討新生期之 DEX 投予，正常環境下對靑少年期及成年期雌鼠強 迫游泳測試之影響。 B. 實驗流程：將實驗動物分為下列 4 組。 Group-1 為六週齡雌鼠 Control group，P1-P3 投予 saline。 Group-2 為六週齡雌鼠 DEX group，P1-P3 投予 DEX。 Group-3 為十週齡雌鼠 Control group，P1-P3 投予 saline。 Group-4 為十週齡雌鼠 DEX group，P1-P3 投予 DEX。 新生鼠於出生後 P1-P3，每天接受一次老鼠皮下注射 DEX，其劑量為 (P1：0.5 mg/kg；P2：0.3 mg/kg；P3：0.1 mg/kg) (Lin et al., 2006)。於 六週和十週，進行 locomotor activity 確認新生期投予藥物對實驗動物探 索行為無影響後，開始強迫游泳測試行為實驗測試。 行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。 C. 實驗流程圖： 正常環境強迫游泳. D. 實驗結果： 1. 自發性運動行為測試結果 (locomotor activity) (圖五) (圖. 33.
(34) 七)： 行為測試結果可能會受到動物本身活動能力或自身自發性行為探索 影響，所以會進行自發性運動行為測試來了解本實驗是否會因為新生期投 予 DEX 而造成動物本身運動能力或自發性探索行為受到影響。由圖五 及圖七結果顯示，六週及十週齡雌鼠在自發性運動行為測試結果上無顯著 差異，p=0.462，p=0.402 (t-test)。因此推論六週及十週齡雌鼠，並未因 新生期投予 DEX 而影響其自發性運動行為。 2. 強迫游泳行為測試結果 (圖六) (圖八)： 已知在新生期施打 DEX 會造成之後動物呈現類憂鬱的傾向 (Felszeghy et al., 1993; Nagano et al., 2008)，而由本實驗結果圖六顯 示，六週齡雌鼠處於無高台暴露的正常環境下，對照組在水中不掙扎的時 間為 33 ± 9%，而投予 DEX 的雌鼠在水中不掙扎的時間為 76 ± 7%， p=0.00066 (t-test)，比對照組雌鼠在水中不掙扎的時間還多，因此判斷六 週 DEX 雌鼠放棄求生之類憂鬱行為較 Control 組明顯。 而由本實驗結果圖八顯示，十週齡雌鼠處於無高台暴露的正常環境 下，對照組在水中不掙扎的時間為 37 ± 4%，而投予 DEX 的雌鼠在水 中不掙扎的時間為 57 ± 6%，p=0.005 (t-test)，比對照組雌鼠在水中不掙 扎的時間還多，因此判斷十週 DEX 組實驗動物放棄求生之類憂鬱行為 較明顯，且其在行為表現上有還未回復正常之現象。 藉由電生理紀錄實驗結果以及強迫實驗游泳測試，本實驗想釐清新生 期給予 DEX 所造成雌鼠杏仁核 LTP 無法形成以及在行為上呈現類憂 鬱之現象，是否與 ER 的數量有相關？因此設計了 western blot 實驗來 驗證本實驗的推論。. 34.
(35) 實驗三 A. 實驗目的： 探討投予 DEX，是否藉由改變杏仁核中的雌激素受體的表現或反 應，而產生行為上之改變。 B. 實驗流程：將實驗動物分為下列兩組 Group-1 為 Control group，P1-P3 投予 saline。 Group-2 為 DEX group，P1-P3 投予 DEX。 新生鼠於出生後 P1-P3，每天接受一次老鼠皮下注射 DEX，其劑量為 (P1：0.5 mg/kg；P2：0.3 mg/kg；P3：0.1 mg/kg) (Lin et al., 2006)。於 滿六週和十週後接受電生理實驗或行為測試，完成後取其杏仁核組織，進 行 western blotting 實驗。 western blotting 實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。 C. 實驗流程圖：. D. 實驗結果 (圖九) (圖十)： 由圖九顯示，在 western blot 實驗， 六週 Control 組杏仁核組織 ERα 的表現量和 DEX 處理組間有顯著差異，p=0.01 (t-test)；十週也有 看到顯著差異的結果，p=0.0003 (t-test)。由圖十結果顯示，六週與十週 ERβ 的表現 DEX 組皆與 Control 組之間未有顯著差異，p>0.05。目前 結果在此說明了在新生期投予 DEX，可能會藉由影響到 ERα 的表現量 而導致雌鼠在之後杏仁核的 LTP 無法被正常誘發以及產生類憂鬱之行. 35.
(36) 為，而新生期投與 DEX，則對於雌鼠杏仁核之 ERβ 無明顯影響。由此 推論新生期 DEX 的投予主要影響雌鼠杏仁核之 ERα 的表現量。 為了更進一步確定 ER 的表現量或活性因為新生期投予 DEX 而有 差異，本實驗接下來在實驗四及實驗五電生理紀錄法、強迫游泳行為測試 進行給予 E2 之回復性的測試，藉由給予 ER agonist，來觀察在電生理 紀錄法以及行為實驗上是否有回復 DEX 所帶來的影響。. 36.
(37) 實驗四 A. 實驗目的： 探討新生期投予 DEX 杏仁核 LTP 無法回復之現象是否來自於杏 仁核 ER 之變化。 B. 實驗流程：將實驗動物分為下列八組 Group-1 為六週齡雌鼠 Control - E2 group。 Group-2 為六週齡雌鼠 Control - vehicle group。 Group-3 為六週齡雌鼠 DEX - E2 group。 Group-4 為六週齡雌鼠 DEX - vehicle group。 Group-5 為十週齡雌鼠 Control - E2 group。 Group-6 為十週齡雌鼠 Control - vehicle group。 Group-7 為十週齡雌鼠 DEX - E2 group。 Group-8 為十週齡雌鼠 DEX - vehicle group。 新生鼠於出生後 P1-P3，每天接受一次老鼠皮下注射，其劑量為 (P1： 0.5 mg/kg； P2：0.3 mg/kg； P3：0.1 mg/kg) (Lin et al., 2006)。於老 鼠 滿 六 週 和 十 週 後 進 行 電 生 理 實 驗 ， 使 用 ER 促 效 劑 (agonist) 17β-estradiol (E2) 來誘發 LTP 的形成。在杏仁核腦片灌流 ACSF 並記 錄基礎訊號 20 分鐘，接著給予. 17β-estradiol (10-10 M) 或 acetone. (10-4 %, vehicle) 20 分鐘，之後再以高頻率電刺激誘發 LTP。電生理實 驗方法參閱實驗方法中相關說明。 C. 實驗流程圖：. 37.
(38) D. 實驗結果 (圖十一~圖十六)： 1. 六週齡雌鼠電生理實驗結果： 由圖十一結果顯示，六週齡雌鼠杏仁核，Control - vehicle 組在第 20 分鐘給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號的 98% ± 3%，而在第 40 分鐘時以給予高頻電刺激，其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 242 ± 36%；而 Control - E2 組 第 20 分鐘給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎 訊號斜率的 76% ± 9%，而在第 40 分鐘時以給予高頻電刺激，其後的 一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 62 ± 12%。ControlE2 其 LTP 的表現明顯小於 Control - vehicle 組，在投與 E2 後其長期 增益現象的表現在第 16 分鐘後達到顯著差異，p<0.05，p<0.01 (t-test)。 由圖十一結果顯示，在電生理實驗中給予六週 Control - E2 組雌鼠杏仁核 腦區灌流 E2 ，會產生 LTP 被抑制的現象，且此抑制的現象會維持一小 時以上之久。 由圖十二結果顯示，六週齡雌鼠杏仁核，DEX - vehicle 組給予高頻 電刺激其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 99 ± 3%；六週齡雌鼠杏仁核，DEX - E2 組第給予高頻電刺激，其後的一小時， 其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 171 ± 22%。DEX - E2 組其 LTP 的表現明顯大於 DEX - vehicle 組，且在高頻電刺激後即達顯著差 異，p < 0.01 (t-test)。圖十二結果顯示，六週 DEX - E2 組雌鼠杏仁核在 電生理實驗中給予 E2 灌流後，可以回復新生期給予 DEX 之影響，產生 LTP 被誘發現像，但 E2 回復 LTP 之現象會隨著時間而慢慢消落。 由圖十三結果顯示，六週齡雌鼠杏仁核，DEX - E2 組在第 20 分鐘給 予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 97% ± 3%，而在第 40 分鐘時以給予高頻電刺激，其後的一小時，其. 38.
(39) fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 171 ± 22%；六週齡雌鼠杏仁 核，Control - E2 組第 20 分鐘給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的 斜率為刺激前基礎訊號斜率的 76% ± 9%，而在第 40 分鐘時以給予高 頻電刺激，其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 62 ± 12%。Control - E2 組其 LTP 的表現明顯小於 DEX- E2 組，在高 頻電刺激後已達顯著差異，p < 0.01 (t-test)。由圖十三可知，在六週齡雌 鼠杏仁核灌流 E2 在 Control - E2 組及 DEX - E2 組有明顯差異，E2 會 抑制 Control 組雌鼠之 LTP 現象，而相反的在 DEX 組老鼠則會回復其 LTP 之現象，由此推測 E2 具有消除六週齡雌鼠杏仁核在新生期投予 DEX 造成無法誘發 LTP 之影響，而此現象是否能維持到十週還具有相 同效果？因此本實驗為了釐清此現象是否能持續到十週之久，因此進行了 十週齡雌鼠杏仁核電生理給予 E2 之實驗。 2. 十週齡雌鼠電生理實驗結果： 由圖十四結果顯示，十週齡雌鼠杏仁核，Control - vehicle 組在第 20 分鐘給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號的 96% ± 4%，而在第 40 分鐘時以給予高頻電刺激，其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 168 ± 13%；而 Control - E2 組 第 20 分鐘給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎 訊號斜率的 83% ± 5%，而在第 40 分鐘時以給予高頻電刺激，其後的 一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 74 ± 8%。Control E2 其 LTP 的表現明顯小於 Control - vehicle 組，在投與 E2 後其長期 增 益 現 象 的 表 現 在 第 16 分 鐘 後 達 到 顯 著 差 異 ， p<0.05 ， p<0.01 (t-test)。由圖十四結果顯示，在電生理實驗中給予十週 Control - E2 組雌 鼠杏仁核腦區灌流 E2 ，會產生 LTP 被抑制的現象，且此抑制的現象會 維持一小時以上之久。綜合圖十一及圖十四所示，Control 組雌鼠在六週. 39.
(40) 及十週杏仁核電生理結果皆有被 E2 抑制之現象，且抑制之現象皆可維持 到一小時之久，且在六週、十週齡之雌鼠皆有此影響。 由圖十五結果顯示，十週齡雌鼠杏仁核，DEX - vehicle 組給予高頻 電刺激其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 141 ± 10%；十週齡雌鼠杏仁核，DEX - E2 組給予高頻電刺激，其後的一小時， 其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 152 ± 11%。DEX-E2 組其 LTP 的表現與 DEX - vehicle 組在高頻電刺激後第 40 分鐘才達顯著差 異，p < 0.05 (t-test)。圖十五之結果相較圖十二之結果，六週 DEX - E2 組 雌鼠在有 E2 之存在下無法使得誘發 LTP 維持到一小時以上，但圖十五 結果顯示，十週 DEX - E2 組雌鼠杏仁核在電生理實驗中給予 E2 灌流 後，可以回復新生期給予 DEX 之影響，使 LTP 之誘發現象維持到一小 時之久，由此可知，E2 可以消除雌鼠新生期投予 DEX 之影響，並使得 十週齡雌鼠杏仁核達到完全回復之效果。 由圖十六結果顯示，十週齡雌鼠杏仁核，DEX - E2 組在第 20 分鐘 給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 103% ± 6%，而在第 40 分鐘時以給予高頻電刺激，其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 152 ± 11%；十週齡雌鼠杏仁 核，Control-E2 組第 20 分鐘給予 E2 到高頻電刺激前，其 fEPSP 的斜 率為刺激前基礎訊號斜率的 83% ± 5%，而在第 40 分鐘時以給予高頻 電刺激，其後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號斜率的 74 ± 8%。Control - E2 組其 LTP 的表現明顯小於 DEX- E2 組，且在給予 E2 後已達顯著差異，p<0.05，p < 0.01 (t-test)。由圖十六結果可知，在十週 齡雌鼠杏仁核灌流 E2 在 Control-E2 組及 DEX - E2 組有明顯差異，E2 會抑制 Control 組雌鼠之 LTP 現象，而相反的在 DEX 組老鼠則會回復 其 LTP 之現象，由此現象推測 E2 具有消除十週齡雌鼠杏仁核在新生期. 40.
(41) 投予 DEX 造成誘發 LTP 無法持續至一小時之影響，綜合圖十三之結 果，E2 可以消除六週及十週齡雌鼠在新生期投予 DEX 所產生之影響， 且在十週齡雌鼠的電生理結果可知其效果可使 LTP 的誘發維持一小時 之久，達到回復之現象。 為了得知 E2 是否在行為上也具有消除新生期投予 DEX 之現象， 之後進行強迫游泳行為測試，藉此了解 E2 之功能在六週及十週 DEX 雌 鼠生理上所扮演之功能。. 41.
(42) 實驗五 A. 實驗目的： 探討新生期投予 DEX 之雌鼠類憂鬱行為之表現，是否與 ER 表現 量改變有關。 B. 實驗流程：將實驗動物分為下列 8 組，皆為正常環境強迫游泳之組別。 Group-1 為六週齡雌鼠 Control - E2 group。 Group-2 為六週齡雌鼠 Control - vehicle group。 Group-3 為六週齡雌鼠 DEX - E2 group。 Group-4 為六週齡雌鼠 DEX - vehicle group。 Group-5 為十週齡雌鼠 Control - E2 group。 Group-6 為十週齡雌鼠 Control - vehicle group。 Group-7 為十週齡雌鼠 DEX - E2 group。 Group-8 為十週齡雌鼠 Control - vehicle group。 新生鼠於出生後 P1-P3，每天接受一次老鼠皮下注射，其劑量為 (P1： 0.5 mg/kg； P2：0.3 mg/kg； P3：0.1 mg/kg) (Lin et al., 2006)。於老 鼠六週和十週，進行強迫游泳行為測試前給予四天 17β-estradiol (0.25 mg/kg) 或 dimethylsulfoxide (0.25 mg/kg) (DMSO, vehicle) (Lund et al., 2005)，再進行正常環境強迫游泳行為測試。行為測試結束後進行 locomotor activity 確認投予 ER agonist 此動作對實驗動物探索行為無 影響。 行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。 C. 實驗流程圖：. 42.
(43) D. 實驗結果： 1. 六週齡雌鼠強迫游泳行為測試結果 (圖十七)： 利用攝影機攝影記錄，六週齡雌鼠於正常環境中，置入水中五分鐘， 觀察動物在水中不掙扎的時間。 Control - vehicle 組在水中不掙扎之時間為 39% ± 8%，而 DEX DMSO 組在水中不掙扎之時間為 77% ± 6%。兩組相比較，在水中靜止不掙 扎的時間在統計上已達顯著差異，p=0.001(t-test)。由此結果顯示，給予六週 齡雌鼠行為前施打 DMSO 此溶液並未使六週齡雌鼠產生行為上額外之影 響，且與實驗二的結果圖六相對應，可以驗證新生期投予 DEX 的動物確實 在幼年期會造成類憂鬱行為的表現增加。 Control - vehicle 組在水中不掙扎之時間為 39% ± 8%，Control - E2 組 在水中不掙扎之時間為 32% ± 7%，兩組相比較，在水中靜止不掙扎的時間 在統計上未達顯著差異，p=0.48 (t-test)。由此結果顯示，給予六週 Control 組 雌鼠行為前施打 E2 並未使動物有行為上明顯之改變，E2 對於六週 Control 組雌鼠行為並未有影響的現象。 DEX - vehicle 組在水中不掙扎之時間為 77% ± 6%，而 DEX - E2 組在 水中不掙扎之時間為 57% ± 6%，兩組相比較，在水中靜止不掙扎的時間在 統計上達顯著差異，p=0.021 (t-test)。由此結果顯示，給予六週 DEX 組雌鼠 行為前施打 E2 可使動物有行為上之改變，求生之行為有回復。行為前 E2 之 施打使得 DEX 組雌鼠類憂鬱之行為得到回復的作用。 43.
(44) Control - E2 組在水中不掙扎之時間為 32% ± 7%，而 DEX - E2 組在 水中不掙扎之時間為 57% ± 6%，兩組相比較，在水中靜止不掙扎的時間在 統計上達顯著差異，p=0.009 (t-test)。由此結果顯示，給予六週 DEX 組雌鼠 行為前施打 E2 可使動物有行為上之改變，使得求生之行為回復，但 DEX - E2 組動物求生之行為相較 Control 組動物還是呈現較憂鬱之傾向。所以此結果 可驗證 E2 雖然可以使 DEX 組的老鼠在類憂鬱的行為上得到改善的現象，但 是改善的效果跟新生期未施打 DEX 的動物相比，行為上還是殘留著新生期 施打 DEX 所帶來的影響。因此為了釐清十週齡雌鼠在行為前施打 E2 是否 會依循六週齡雌鼠之行為變化，進行了十週齡雌鼠行為前打藥之回復實驗。 2. 十週齡雌鼠強迫游泳行為測試結果 (圖十九)： 利用攝影機攝影記錄，十週齡雌鼠於正常環境中，置入水中五分鐘，觀 察動物在水中不掙扎的時間。 Control - vehicle 組在水中不掙扎之時間為 26% ± 6%，而 DEX vehicle 組在水中不掙扎之時間為 69% ± 7%。兩組相比較，在水中靜止不掙 扎的時間在統計上已達顯著差異，p<0.001(t-test)。由此結果顯示，給予十週 齡雌鼠行為前施打 DMSO 此溶液並未使十週齡雌鼠產生行為上額外之影 響，且與實驗二的結果圖八相對應，可以驗證新生期投予 DEX 的動物確實 在幼年期會造成類憂鬱行為的表現增加。 Control - vehicle 組在水中不掙扎之時間為 26% ± 6%，而 Control - E2 組在水中不掙扎之時間為 58% ± 9%，兩組相比較，在水中靜止不掙扎的時 間在統計上達顯著差異，p=0.08 (t-test)。由此結果顯示，給予十週 Control 組 雌鼠行為前施打 E2 會使得動物有行為上之改變，動物放棄求生之類憂鬱行為 增加，相較於六週齡之雌鼠 Control - E2 組結果 (圖十七)，施打 E2 並未使 十週 Control - E2 組有維持相同求生之作用，反而讓十週齡雌鼠類憂鬱之行為 增加。且 Control - E2 組與 DEX - vehicle 組相比，p=0.321 (t-test)。. 44.
(45) DEX - vehicle 組在水中不掙扎之時間為 69% ± 7%，而 DEX - E2 組在 水中不掙扎之時間為 52% ± 9%，兩組相比較，在水中靜止不掙扎的時間在 統計上未達顯著差異，p=0.131 (t-test)。由此結果顯示，給予十週 DEX 組雌 鼠行為前施打 E2 行為上並無有回復的現象。 Control - E2 組在水中不掙扎之時間為 58% ± 9%，而 DEX - E2 組在 水中不掙扎之時間為 52% ± 9%，兩組相比較，在水中靜止不掙扎的時間在 統計上未達顯著差異，p=0.641 (t-test)。由此結果推論，給予十週齡雌鼠行為 前施打 E2 可使 Control 組雌鼠與 DEX 組雌鼠在行為上產生不同之改變， 十週 Control - E2 組反而類憂鬱行為增加，而 DEX - E2 組之雌鼠卻在行為 上與 DEX - vehicle 組行為在統計上未達顯著差異，因此證實十週齡雌鼠行 為前給予 E2 在 DEX 組的動物上所產生的效果較不顯著。 3. 強迫游泳後之自發性運動行為 (圖十八) (圖二十)： 由於強迫游泳之行為測試可能因為動物之活動能力及自發性探索行 為而受到影響，為了評估雌鼠在行為前四天之打藥行為是否影響其自發性 探索行為，因此在強迫游泳後進行自發性運動行為。由圖十八及圖二十實 驗結果可知，六週齡及十週齡各組雌鼠實驗組別在行為前施打藥物之影響 在統計上並無顯著差異 [F(3,20)=1.248，p=0.319]、[F(3,20)=0.510， p=0.68] (one-way ANOVA)。而六週 Control – E2 組的雌鼠與 Control – DMSO 組的雌鼠相比，P=0.145。因此可以排除行為前四天施打藥物對 於雌鼠活動力和自發性探索行為之影響。. 45.
(46) 第四章. 討論. (Discussion). 46.
(47) 討論 一、. 新生期投予 DEX 對雌鼠杏仁核所造成的影響. 雌激素已知的功能有調節生殖器官的發育、增進細胞的生長以及調控 中樞神經系統。而雌激素的接受器分布位置十分廣泛，在動物體的生殖系 統，以及大腦的邊緣系統，例如杏仁核、海馬迴都是雌激素作用的區域。 雌 激 素 可 以 增 加 麩 氨 酸 接 受 器 (glutamate receptor, GluR) 中 的 N-methyl-D-aspartate. receptors. 以. (NMDAR). alpha-amini-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic. acid. 及. receptor. (AMPA receptor) 的表現量來促進長期增益現象 (LTP) (Smith et al., 2009; Zadran et al., 2009; Snyder et al., 2011; Nebieridze et al., 2012)。NMDA receptor 和 AMPA receptor 都是 GluR 的一種，LTP 的 形成最開始須要神經元釋放 glutamate 活化神經細胞突觸的 AMPA receptors，AMPA receptors 因為去極化而被活化，進而使鈣離子也流入 細胞內，使得 NMDA receptors 也被活化，讓鈣離子和鈉離子流入突觸 後細胞，這時鈣離子會和調鈣素 (calmodulin) 形成復合物，與下游分子 機 制 作 用 ， 例 如 活 化 第 二 型 鈣 離 子 依 賴 型 磷 酸 激 酶 (calcium-calmodulin–dependent protein kinase II, CaMKII)、絲裂原活化 蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 等等，然後促進新 突 觸 receptor 的 形 成 ， 造 成 一 連 串 的 長 期 增 益 現 象 (Bliss and Collingridge, 1993; Wu et al., 2006; Asrar et al., 2009)。 先前研究指出，在新生期給予人工合成糖皮質激素 DEX，會造成兒 童期和青少年期發育上不良的影響，例如個體發育不良、神經新生異常， 以及認知學習功能上產生負面影響 (Flagel et al., 2002; Neal et al., 2004)。動物實驗上，新生期投予 DEX 會造成新生鼠體重明顯下降，這 種現象會持續到老鼠成長到八週齡時，而且會造成腦部海馬迴神經突觸可 47.
(48) 塑性降低，使得海馬迴的 LTP (long-term potentiation ) 受到影響而與控 制 組 老 鼠 有 明 顯 差 異 ， 而 這 些 現 象 可 能 跟 CaMKII 的 自 磷 酸 化 (autophosphorylation) 增加和第一型磷酸水解脢 (protein phosphatase I) 的活性降低有關，進而影響 glutamate receptor 的活化而改變其神經 傳導物質的釋放量，導致形成 LTP 的閾值增加 (Lin et al., 2006)。但是 在新生期施打 DEX 的公鼠其個體發育不良、神經新生異常，以及認知 學習功能上產生的負面影響，過去文獻指出其不良影響可於成年期時回復 正常。 在本實驗中，新生鼠出生後三天連續投予遞減式劑量 DEX，發現 DEX 組在第三天即有發育遲緩的現象，而且 DEX 影響雌鼠生長的現象 可以持續到六週時，直至第八週齡才恢復。對照先前文獻結果，新生期投 予 DEX 的動物，不論性別差異，在生長發育的功能上，都有受到阻礙 的現象，而且從體重紀錄結果上，可以得知 DEX 對發育功能的影響到 動物成年期後就可以恢復正常。 而 DEX 對動物腦部發育的影響，利用胞外電生理紀錄法來觀察是 否有變化。給予六週齡雌鼠杏仁核連續高頻電刺激，發現無法誘發 LTP； 但在十週齡的 DEX 組，可以看到杏仁核 LTP 有回復的現象，但 LTP 持 續到第 28 分鐘即削弱。因此 DEX 會影響動物青少年期杏仁核 LTP 的 形成，而且這個阻礙 LTP 形成的現象會持續到成年期還無法完全回復正 常。由此顯示新生期施打過 DEX 的動物其不但在海馬迴會產生負面影 響，而且在杏仁核的神經突觸可塑性上也產生變化，且在雌鼠杏仁核的影 響會持續到雌鼠的成年期還無法回復。 過去文獻指出，新生期投予 DEX 之動物，其海馬迴神經塑性之影 響會在成年期有回復正常的現象 (Lin et al., 2006)。但在本實驗中，卻發. 48.
(49) 現 DEX 對於杏仁核有更為長遠之影響。由此可知，新生期投予 DEX 的 行為，對於動物的杏仁核發育變化產生的影響比海馬迴來得更加長遠。且 已知 DEX 處理過的發育期動物，在腦部杏仁核組織會有細胞凋亡的現 象，這個現象可能會影響杏仁核腦區所調控之情緒性記憶的機制 (Zuloaga et al., 2011)。因此可以推論同樣新生期投予 DEX 的動物，對 於不同腦區會有不同程度的影響，有些腦區可能於成年期後可以回復，但 有些腦區會帶來長遠甚或是終生性的影響。 二、 新生期投予 DEX 對雌鼠類憂鬱行為的改變 新生期投予 DEX 的動物，發現成年後有 HPA axis 失衡的現象，並 伴隨一些情緒性疾病的產生，例如類憂鬱的傾向 (Felszeghy et al., 1993)。而關於憂鬱、焦慮和恐懼等負面情緒的掌控，是由大腦邊緣系統 的杏仁核所調控。 本實驗在強迫游泳行為測試上，六週齡與十週齡的 DEX 雌鼠具有 明顯類憂鬱行為之傾向。而在自發性探索行為結果，六週與十週各組雌鼠 之行為沒有差異，因此可以排除新生期投予所帶來的自發性探索能力被影 響或運動障礙。由於電生理記錄結果可證實六週與十週 DEX 組雌鼠杏 仁核的神經可塑性受到負面影響，關於動物體杏仁核所控制的情緒性反 應，憂鬱情緒主要是由杏仁核所調控。強迫游泳測試的結果不但可以證實 新生期給予 DEX 的六週齡雌鼠無法正常建立恐懼記憶，且十週的雌鼠 也可以看到此類憂鬱反應，而在行為上的結果又可以和電生理的實驗結果 相呼應，證實在杏仁核上神經突觸可塑性受到影響而造成行為上之變化。 類憂鬱行為的表現，新生期投予 DEX 的行為影響至雌鼠成年期。 DEX 的投予，可能在動物尚未發育完全時，導致 HPA axis 的功能失調， 使得動物心理和生理發展受到負面影響，且這個影響會持續到動物的成年 49.
(50) 期，還會呈現類憂鬱的行為。 三、新生期投予 DEX 對雌激素受體表現的變化 糖皮質激素和雌激素都是屬於動物體內類固醇 (steroid) 激素的一 員，且兩種激素的受體都為核受體的一種，對於基因的調控具有一定的影 響。目前已知糖皮質激素和雌激素可以交互作用，並藉由影響基因表現的 機制，而調節內分泌系統 (Suzuki and Handa, 2004)。且糖皮質激素會 去抑制雌激素的活性，並抑制雌激素在某些細胞的分泌量，但目前對於抑 制的相關機制尚不明確 (Gong et al., 2008)。 由於 DEX 會改變神經突觸塑性並增加 LTP 閾值導致 LTP 無法形 成，且 DEX 也會影響雌激素受體在體內的表現量和活性 (Suzuki and Handa, 2004; Weiser and Handa, 2009)，而雌激素是可以經由活化 glutamate receptor 和增加其表現量來達到 LTP 的形成，所以推測 DEX 是否會經由影響 ER 表現量而造成形成 LTP 的其中路徑受到阻 礙。從本實驗結果當中， western 的結果可以看出 DEX 組的雌鼠在 ER 的表現量似乎與 Control 組有顯著差異，因此新生期投予 DEX 是否會 造成之後雌鼠雌激素受體有變化，而 LTP 無法被誘發與 ER 的表現量 減少可能存在正相關的關係，且 DEX 對雌鼠的影響會持續到成年期。 已知雌激素的細胞訊號 (cell signaling) 是在細胞膜開始的，且此訊 號傳遞涉及代謝型麩氨酸的轉錄受體 1A 型 (mGluR1a) 引導細胞內儲 存型鈣離子的釋放。而 ERα 是存在於細胞膜和胞外的一種受體，ERα 和 大多數膜上受體一樣，鑲嵌在細胞膜上，並透過 agonist 的刺激移動到 細胞內，而這個動作會迅速的導致一連串膜上的受體被活化以及移動到胞 內，直到 ER 降解 (degradation) 才會停止。而這個具有時間性的自動 調節 (autoregulation) 會去限制雌二醇去啟動膜上的細胞訊號 50.
(51) (Micevych et al., 2010)。ERα 可以被一種細胞膜表面的 Caveolin 蛋白 結合並且棕櫚酸醯化 (palmitoylated)。Caveolin 是存在於細頸瓶狀的細 胞膜內陷的區域的一種特定蛋白質，主要功能是小泡運輸和信號傳遞等細 胞生命活動，Caveolin 蛋白不但可以運送 ERα 至膜上，而且還參與了 代謝型麩氨酸的交互作用，而此路徑主要是藉由活化 G 蛋白訊號 (G protein signaling) 來達成 (Luoma et al., 2008)。 由本實驗 western blot 實驗結果發現，六週齡與十週齡 DEX 雌鼠 的 ERα 與 Control 組相比，有明顯呈現較少的趨勢，推論在新生期投 予 DEX，會導致 ERα 的表現量有明顯的改變，而 ERβ 則不受影響。 而在電生理回復實驗上，在六週齡及十週齡 Control-E2 組皆看到長期增 益現象被抑制且長達一小時之久，而六週及十週 DEX-E2 組則呈現有回 復 LTP 的情況，又電生理實驗結果得知新生期施打 DEX 會導致 LTP 無法被誘發，這個現象直至十週還未完全回復。已知 ERα 在細胞內主要 是由蛋白質 caveolin 所運送，在 ER agonist 的刺激之下，會加速 ERα 移動到胞內的速度，而本實驗之結果推論由於 ERα 量的減少，可能會導 致 heterodimers 的量增加，是否因此去影響 caveolin 調控 E2 訊號傳 遞之相關機制，建議必須設計分生相關實驗來釐清。 四、雌激素對於新生期投予 DEX 雌鼠行為之回復效果 由於目前已知 DEX 的投予可能會造成 HPA axis 的失衡而使得心 理上容易因壓力的而導致無法適度調節的現象，而臨床上又得知女性患憂 鬱症的機率較男性來得高，可能來自於女性之雌激素會隨生理周期而有變 化，因此臨床上常藉由雌激素之給予來減緩憂鬱之症狀。 本實驗在進行強迫游泳行為測試結果中，發現六齡週及十週齡 DEX. 51.
(52) 組之雌鼠有明顯類憂鬱傾向。回復性行為實驗結果，六週齡 DEX- E2 組 雌鼠之類憂鬱之傾向有減輕之現象，但是相較 Control 組雌鼠，六週 DEX - E2 組的動物其憂鬱行為還是較明顯。雖然行為上給予 E2 確實可緩減因 新生期投予 DEX 所帶來之憂鬱現象，但是對於新生期投予 DEX 所帶 來的類憂鬱行為增加，E2 還是未能完全消除 DEX 所引發的影響。推論 E2 雖然能回復一部分 DEX 所帶來的影響，但是卻未能完全消除，可能 來自於 DEX 在動物體內影響的機制不只一種，且尚有其他機制是無法 藉由給予 E2 的去回復 DEX 所帶來的影響。 在十週 DEX - E2 組行為之表現，則與 DEX - vehicle 組無明顯差 異。由於十週齡雌鼠已經屬於性成熟之成鼠，對於性成熟之雌鼠是否在性 激素上呈現個體性之差異導致 E2 無法發揮其作用或者產生負回饋機制 則值得再做更深入探討。 本實驗十週 Control - E2 組之類憂鬱行為有明顯增加的現象，且和 DEX - vehicle 組相比未有顯著差異。推斷 DEX 和 E2 可能在動物體內 的一些生理內分泌機制調控相同的路徑，導致 Control - E2 組與 DEX vehicle 組有相似的結果。而六週齡雌鼠未看到此現象可能由於動物體內 普遍雌激素濃度值較低，因此不足以引發十週齡 Control - E2 組之結 果。而十週 Control- E2 組之類憂鬱行為有明顯增加現象，可以證實體內 未經 DEX 處理的動物，也有可能由於 E2 單獨的給予而造成類憂鬱現象 增加的情形。由此可推論，E2 和 DEX 在動物體內的某些機制扮演著相 同的角色。 由於六週齡雌鼠尚未性成熟，體內的生殖系統以及相關性激素的分泌 量較十週齡已性成熟之雌鼠單純，我們可以排除因為性成熟所帶來體內雌 激素變動的影響。單就六週齡未性成熟之雌鼠的回復型行為實驗結果推 論，E2 確實有回復 DEX 所帶來的影響，但回復的效果並不是完全，可. 52.
(53) 能來自於 DEX 所牽涉到的其他機制。而十週齡動物已是性成熟之年齡， 在 E2 給予的回復型實驗結果，E2 的作用可能受到體內雌激素的波動比 較沒有辦法達到一致性的效果。所以本實驗建議在 E2 給予的回復性行為 實驗上，可以從三方面做相關的改善。第一：性成熟之雌鼠動情週期為四 天一次，可以藉由動情週期的觀察，將實驗動物的生理週期調整至一致的 時期，才可排除因不同時期而有不同雌激素變化量所帶來的影響，第二、 量測實驗動物之體內雌激素濃度，並標準化激素濃度，不同的實驗動物給 予不同劑量之雌激素，才可排除因動物體內雌激度濃度不同，而可能造成 之負回饋反應，第三、給予實驗動物施打 ER antagonist，來判斷動物之 回復型行為是來自於 ER agonist (E2) 之給予。希望藉由這三方面的改 善，來做雌激素濃度給予的調整。 五、 新生期投予 DEX 所影響之基因調控機制 新生期投予三天的 DEX 可以導致動物之後在腦部發育以及行為反 應長遠的影響，並且導致雌鼠的 ERα 表現量明顯降低。對於十週齡之雌 鼠，ERα 表現量的降低可能會導致體內許多生理周期的調控受到不良的 調控，甚至影響到心理層面的發展。而這些長遠的影響目前推測可能在早 期投予 DEX 藥物時，就已經影響到基因調控的機制。 一般疏水性的藥物或激素分子，能夠穿透過疏水性的雙層磷脂細胞膜 構造，直接進入細胞核內影響基因調控的路徑，進而去干擾細胞內訊息的 傳遞，而影響細胞生理功能；或者與 DNA 疏水區結合，而導致基因變 異；有些則會和性激素這類型的細胞核受體結合，產生類激素的作用 (Andre, 1990)。目前已發現 DEX 可以刺激動物體內細胞的 DNA 甲基 化. (methylation) ， 並 且 藉 由 調 控 組 蛋 白 乙 醯 脢. (histone. acetyltransferase, HAT) 或去乙醯脢 (histone deacetylase , HDAC) 來 影響基因轉錄的活性；且在臨床上可以看到用 DEX 處理過的患者，在 53.
(54) 體內組蛋白乙醯化的活性有降低的情況 (Prasad and Thakur, 1991; Kurihara et al., 2000; Matthews et al., 2004)。 藉由本實驗 western blot 結果，新生期投予 DEX 之雌鼠在 ERα 的表現量有明顯降低的現象，推論可能是來自於新生期 DEX 對動物體 內基因轉錄之機制的影響，導致受體蛋白質表象量降低，而此現象並維持 到成年期還無法回復。對於此機制相關之探討，後續研究可藉由進行相關 分生實驗，來釐清 DEX 對於 ERα 此受體基因轉錄機制之影響。. 54.
(55) 總結 本實驗主要藉由新生期投予 DEX 之行為，探討雌鼠之後於成年期 之影響，而實驗結果發現給予 E2 可以在電生理上部分回復 DEX 在杏 仁核 LTP 之形成，此回復效果在六週齡及十週齡時均可被觀察到；而在 行為上 E2 於六週 DEX 雌鼠回復求生行為明顯，但於十週時卻沒有明顯 改善現象；western blot 實驗結果顯現 ERα 表現量減少。綜合本實驗 之結果，新生期投予 DEX 對於雌鼠杏仁核 ERα 有長遠之影響，而此現 象目前推斷可能涉及到新生期投藥之行為導致基因調控及轉錄之相關路 徑，針對此部分之現象值得深入研究與探討，以便之後 DEX 藥物在臨 床上用藥之參考與評估。. 55.
(56) 第五章 參考文獻 (References). 56.
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