行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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M 細胞標的型微球體之開發（Ⅱ）
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計畫類別：■個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：NSC89－2313－B－039－004－
執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：侯庭鏞
共同主持人：吳世祿、王淑紅
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：中國醫藥學院中國醫學研究所
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日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
M 細胞標的型微球體之開發（Ⅱ）
Development of M cell-tar geting micr ospher es（Ⅱ）
計畫編號：NSC 89-2313-B-039-004
執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
主持人：侯庭鏞 中國醫藥學院中國醫學研究所
共同主持人：吳世祿 中國醫藥學院生化學科
共同主持人：王淑紅 仁德醫護管理專科學校護理科
一、中文摘要 現今許多疾病的感染是病原由口或是 呼吸道侵入。就免疫反應而言，傳統針劑 疫苗無法誘發黏膜性免疫反應的產生，以 製造多量的分泌型 IgA，防止呼吸道及胃腸 道病原的感染。誘發黏膜性免疫反應必須 將抗原直接與黏膜面接觸，但黏膜免疫方 式在抗原的傳遞方面，仍有許多問題待克 服。因此為了開發可經口投與、抗原經胃 及小腸後不會失去其抗原性、並能標的至 M 細胞的口服疫苗，本計畫結合遺傳工程 及化工之高分子合成技術，研發一種腸道 細胞標的型的微球體劑型（M cell-targeting microsphere），以完成口服疫苗的核心技 術。我們以牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）為模式蛋白質，選定具有 生 物 可 分 解 性 的 poly-DL-(lactide-co-glycolide)（PLG）為基 礎包覆材質，利用溶劑蒸發法，製作包埋 BSA 的 water-in-oil-in-water 形式之微球 體，同時完成微球體的物化特性分析及蛋 白質釋放試驗，顯示以 PLG 為包覆材質所 製成之微球體具有控制釋放的能力。為了 使微球體具有 M 細胞標的功能，我們選定 大 腸 桿 菌 忌 熱 性 腸 毒 素 （ heat-labile enterotoxin；LT）為腸道標的分子。利用大 腸桿菌表現純化 LT 後，進行口服試驗。結 果顯示，LT 經由口服接種，確實可誘發小 白鼠產生良好的黏膜性免疫反應，也證實 LT 作為腸道標的分子的可能性。進一步我 們 將 呼 吸 道 病 原 ─ 胸 膜 肺 炎 放 線 桿 菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae）與忌熱 性腸毒素進行接合，再包埋入微球體中， 以口服方式免疫老鼠，結果發現單獨給予 抗原不易引起免疫反應，而口服給予經接 合腸毒素後的抗原，在酵素連結免疫吸附 試驗偵測時有較明顯的 IgA 免疫反應。顯 示忌熱性腸毒素確實可以作為黏膜性佐 劑，協助口服抗原產生黏膜性免疫反應。 因此由本計畫研究的結果，已完成微球體 包覆及特性分析，並證實 LT 作為腸道標的 分子的可能性。 關鍵詞：微球體、大腸桿菌忌熱性腸毒素、 黏膜免疫 Abstr actHistorically, immunization has relied on the induction of humoral immunity by parenteral administration of vaccine. Antibodies induced in this manner, however, do not necessarily reach mucosal surfaces where most infectious agents enter the host. Induction of immunity at mucosal surface requires administration of antigen directly to the mucosal site. However, mucosal administration must overcome several challenges, such as a suitable antigen delivery system. In order to develop the oral vaccine that could be administrated orally, be stable during oral administration and be targeted to M cells, we prepared the poly-DL-(lactide-co-glycolide) （ PLG ） microspheres containing bovine serum albumin (BSA) as a model antigen by a water-in-oil-in-water emulsion solvent evaporation method. The BSA-loaded microspheres displayed a controlled release kinetic. To develop the M-cell targeting microspheres, we purified the Escherichia
coli heat-labile enterotoxin (LT) from
prokaryotic expression system. The significant amount of secretory IgA was produced on the mucosal surfaces by oral administration of LT, suggests that LT could be used as an M-cell targeting molecule to induce mucosal immunity. To further analyze the efficiency of LT as a mucosal adjuvant, we conjugated a respiratory pathogen —
Actinobacillus pleuropneumoniae (A.
pleuropneumoniae) with LT by
glutaraldehyde. The conjugate was then administered to mice orally and the humoral immunity was detected. Oral administration of A. pleuropneumoniae alone didn’t induce
a detectable antibody response in serum and mucosal washes; however, oral administration of A. pleuropneumoniae-LT
conjugate induced a significant amount of IgA response in lung and intestinal washes. Taken together, the recombinant LT could not only be used as an oral vaccine to induce a significant mucosal immune response, but also be used as a mucosal adjuvant to improve the mucosal immunity of respiratory pathogen by oral administration.
Keywor ds: Microsphere, Heat-labile Enterotoxin, Mucosal Immunity
二、緣由與目的 預防注射對於預防不同疾病的感染是 非常有效的一種途徑。習慣上，疫苗的接 種通常是藉由皮下注射完成，這種免疫方 式可以激發良好的體液性免疫反應，使個 體產生抗體，但藉由這種途徑產生的抗 體，並不能有效地到達黏膜層，以防止病 原經口或呼吸道感染。在黏膜面上，IgA 是 最主要的抗體形式，分泌型的 IgA 可以預 防病原與黏膜面接觸，並中和會傷害宿主 的病毒及毒素。因為黏膜免疫系統為個體 對抗外在病原感染的第一道防線，因此如 何有效地誘發黏膜性免疫反應是非常重要 的 [1]。一般而言，誘發黏膜性免疫反應必 須將抗原直接與黏膜面接觸，例如，為了 避免下呼吸道感染，疫苗必須以噴霧的方 式直接送到肺部。雖然黏膜免疫方式具有 相當多優點，但在抗原的傳遞上，仍有許 多問題待克服，因此目前的預防接種還是 以皮下注射為主。 雖然口服疫苗具有相當多優點，但口 服疫苗的開發仍然相當緩慢。因為在缺乏 適當的抗原包覆系統下，疫苗抗原會遭受 口及胃腸道中細菌及酵素的分解，此外， 疫苗在食糜中的稀釋及無法有效地滲透至 黏膜面，都降低了疫苗的效力 [2]。因此， 為了開發可經口投與、抗原經胃及小腸後 不會失去其抗原性、並能標的至 M 細胞上 的口服疫苗，本計畫結合遺傳工程及化工 之高分子合成技術，研發一種腸道細胞標 的 型 的 微 球 體 劑 型 （ M cell-targeting microsphere），以完成口服疫苗的核心技 術。並以牛血清白蛋白為模式蛋白質，來 模擬微球體經口投與釋放的效果。 三、結果與討論 （一）微球體的製備 微 球 體 的 包 覆 材 質 選 定 poly-DL-(lactide-co-glycolide)（PLG），因 為 PLG 具有生物可分解性、生物共容性及 控制釋放的能力等優點，因此已被廣泛地 使用在醫學材料方面，應用於創傷口的縫 合、手術後防組織沾黏用吸收性薄膜、韌 帶修補材及藥物疫苗傳輸等方面 [3]。微球 體的製作是採溶劑蒸發法完成 [4]，簡言 之，將模式蛋白質牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）與 PLG 混合後，利 用 超 音 波 打 碎 機 混 合 均 勻 ， 以 形 成 water-in-oil 之內膜 ， 之 後 加 入 polyvinyl alcohol 再用超音波打碎機混合均勻，即形 成 water-in-oil-in-water 的微球體雛形，最 後將微球體置於室溫至少 16 小時，待溶劑 蒸發後，再利用冷凍乾燥技術，即完成微 球體的製備。 （二）大腸桿菌忌熱性腸毒素的產製及特 性分析 將腸毒性大腸桿菌於 37℃增殖培養 後，萃取其質體 DNA，並以設計好的引子 （分別位於忌熱性腸毒素基因 5’端及 3’ 端），進行聚合 連鎖反應。利用特異性 的引子進行反應，可以增殖出長約 1147 bp 的忌熱性腸毒素基因。進一步利用設計於
引子上的酵素 BamHI 及 XhoI 切割，送入 已 利 用 BamHI 及 XhoI 切 割 後 的 載 體 pET-28a(+)中，成為表現質體 pET-LT。經 定序確定無誤後，進行大腸桿菌忌熱性腸 毒素蛋白質的產製。 我們選擇 pET 系統，是因為它有兩個 重要的特性。一是具有嚴謹的系統以誘導 目標基因表現蛋白質。在 pET 表現系統 中，IPTG 必須先誘導宿主表現 T7 RNA 聚 合 後，再藉 T7 RNA 聚合 結合到 T7 啟 動子上，才能進一步進行基因的轉錄及轉 譯，以表現出目標基因，同時 pET 系統會 分解少量 T7 RNA 聚合 ，以避免在無 IPTG 誘導的狀態下，因為少量 T7 RNA 聚 合 的產生，造成少量目標基因的表現。 另一個特性是，pET 載體可以誘導 N 端或 C 端融合 6 到 10 個連續組胺酸（histidine） 的融合蛋白質（fusion protein）表現，這種 一連串的 histidine 對含鎳金屬鉗合樹脂 （metal chelation resin）具有親和性，因此 可以利用親和性層析的方法，將蛋白質純 化的步驟單純化。 為了取得大量而且純度很高的忌熱性 腸毒素蛋白質，我們利用大腸桿菌表現系 統進行蛋白質的大量產製。首先進行表現 最佳條件之測試：在不同 IPTG 濃度（0.1、 0.25 、 0.5 、 0.75 、 1 mM ） 及 細 菌 濃 度 （OD600=0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0）的 變因調整下，發現於 IPTG 濃度 0.5 mM、 細菌濃度為 OD600=0.7 的條件下，可以產 生最大量的蛋白質，蛋白質大小分別如同 預估為 A 次單位 27 kDa 及 B 次單位 11.5 kDa。進一步為了設定純化的流程，我們分 析利用原核表現系統產製的忌熱性腸毒素 是否如預期般，以不可溶的方式存在。由 結果顯示，在 IPTG 誘導的狀況下，雖然 可誘導多量的蛋白質產生，但都以可溶性 的狀態存在，因此在純化時只需將細菌打 破，即可進入純化步驟。 在純化蛋白質的步驟方面，因為重組 型忌熱性腸毒素為 N 端含有 6 個 histidine 的融合蛋白質，另外因為忌熱性腸毒素具 有與糖基 galactose 結合的能力，因此我們 利用含鎳金屬鉗合樹脂及 galactose resin 兩 種樹脂進行親合性色層分析法。經由一連 串 的 純 化 步 驟 後 ， 我 們 發 現 只 有 利 用 galactose resin 才能純化出忌熱性腸毒素。 Sixma et al. [5] 利用 X-ray 繞射分析忌熱性
腸毒素的結果顯示，在忌熱性腸毒素的蛋 白質立體結構中，N 端被折疊在內部，而 C 端暴露在外，位於 N 端的 histidine 因為無 法暴露，所以不能順利與鎳結合，因此經 由其他學者的立體結構分析，與我們進行 純化的分析，得到相同的結論。 因 為 忌 熱 性 腸 毒 可 以 與 GM1 上 的 galactose 結合，因此我們利用親和性樹脂 immobilized D-galactose resin 進行純化。在 三小時的操作時間內，可自 1 公升細菌液 中，純化出約 1.3 公克之忌熱性腸毒素， 其純度至少 99﹪。進一步為了瞭解重組型 忌熱性腸毒素的抗原性及功能方面是否與 野外型相同，我們進行西方雜合反應及 GM1—酵素連結免疫吸附試驗分析。將野 外型與重組型忌熱性腸毒素利用蛋白質電 泳分析後，轉移至濾紙上，以野外型忌熱 性腸毒素所產製的多價抗體偵測，再利用 標示酵素的二次抗體及受質加以呈色，結 果發現抗體可以成功地偵測到野生型及重 組型忌熱性腸毒素，顯示重組型忌熱性腸 毒素仍保持其抗原性。另外，利用 GM1— ELISA 測定並比較野外型與重組型忌熱性 腸毒素結合 GM1的能力，結果顯示隨著蛋 白質濃度的增加，吸光值也隨之增加，顯 示野外型與重組型忌熱性腸毒素都具備與 GM1結合的能力，而且結合的動力學也非 常相似。因此，利用大腸桿菌大量產製的 重組型忌熱性腸毒素具備與野外型忌熱性 腸毒素相同的特性，並具備有容易生產、 容易純化的特性，可以應用於產業界的大 量生產用。 （三）大腸桿菌忌熱性腸毒素作為腸道標 的性佐劑可行性之探討 現今許多疾病的感染是病原由口或是 呼吸道侵入。就免疫反應而言，傳統針劑 疫苗無法誘發黏膜性免疫反應的產生，以 製造多量的分泌型IgA，防止呼吸道及胃腸 道病原的感染。一般而言，誘發黏膜性免 疫反應必須將抗原直接與黏膜面接觸，藉 由腸道免疫所活化的淋巴球移行到呼吸 道，而在呼吸道纖毛及黏膜面產生大量具 特異性的IgA，以形成有效的第一道防線，
防止病原著床及增殖。為了要達成此項目 的，便是開發呼吸道病原的口服疫苗以引 起良好之黏膜免疫反應。而開發口服疫苗 除了考慮病原本身外，黏膜性佐劑便成為 主要關鍵。因此在這一部份的研究中，我 們選定引起呼吸道感染的病原胸膜肺炎放 線桿菌為抗原模式，探討大腸桿菌忌熱性 腸毒素作為黏膜性佐劑的可行性。 一般鋁膠或油質佐劑大多是藉由物理 性的混合，與抗原形成油水互溶之膠體粒 子（micelle），而在注射到動物體後，緩 慢地釋放抗原，刺激免疫反應的產生。至 於在生物性黏膜佐劑的操作上，為了考量 使黏膜佐劑能有效的將抗原導引至小腸上 皮M細胞上，因此我們採取化學接合的方 式，將黏膜性佐劑與抗原接合後，再進行 免疫試驗。經由交聯劑戊二醛的處理下， 再藉由親合性樹脂immobilized D-galactose resin的純化及蛋白質電泳分析，可以發現 胸膜肺炎放線桿菌抗原可以有效的與忌熱 性腸毒素結合，而在電泳膠片上同時呈現 這兩群的蛋白質。 在小白鼠試驗中，單獨口服胸膜肺炎 放線桿菌所引發的免疫反應與陰性組相 似，顯示胸膜肺炎放線桿菌在口服後，可 能已遭受胃酸及消化酵素的破壞，無法藉 由腸道免疫系統，誘發體液性免疫反應。 而在口服忌熱性腸毒素-胸膜肺炎放線桿 菌接合組中，在小白鼠的血清、肺及腸道 分別可以誘發1.7、2.7、1.1倍的IgA反應及 1.9、1.2、0.9倍的IgG反應。這些結果呈現， 利用口服方式給予忌熱性腸毒素-胸膜肺 炎放線桿菌接合物，在小白鼠主要都會在 肺部引起高量的IgA反應，其次為腸道，顯 示忌熱性腸毒素可以協助胸膜肺炎放線桿 菌通過消化酵素的破壞，並將胸膜肺炎放 線 桿 菌 導 引 至 小腸M細胞，進入Peyer’s patches，活化淋巴球，而活化之淋巴球進 一步會回歸到胸膜肺炎放線桿菌所感染的 部位呼吸道，誘發黏膜性免疫反應的發 生。另外，在傳統針劑陽性對照組中，在 血清及肺中也可以測到高量的IgA，這一點 是否也涉及活化之淋巴球回歸至黏膜系統 呢？值得深入探討。 四、計畫成果自評 (一) 研究內容與原計畫相符程度 本研究利用 PLG 為包覆材質，以 BSA 為模式蛋白質，製備 water-in-oil-water 的微 球體。此微球體具備有控制釋放的特性。 此外，腸道標的分子—LT 已利用大腸桿菌 進行表現及純化，得到具功能性的 LT。進 一步將 LT 與胸膜肺炎放線桿菌接合後，以 PLG 包覆，再以口服的方式給予小白鼠， 也顯示 LT 可以成功地誘發黏膜性免疫反 應的發生。本研究與原計畫研究內容相符。 (二) 達成預期目標情況 本計畫之進行，已完成計畫的三個主 要項目：（一）微球體的製備、（二）大 腸桿菌忌熱性腸毒素的產製及特性分析、 （三）大腸桿菌忌熱性腸毒素作為腸道標 的性佐劑可行性之探討。 (三) 研究成果的學術或應用價值 本計畫的研究主軸為探討疫苗微球體 包覆技術的特性分析，目的在於增加疫苗 投與途逕的多樣性。本項實驗結果應可成 功的與下游產業結合，建立量產技術、標 準制程規範、到實際應用於疫苗之價值。 在將來製程成熟後，便可有效地轉移至廠 商，提高動物用疫苗之整體競爭力，進而 可將此一研究成果推展應用於人用疫苗 上，拓展獸醫在生醫材料上之研究，使實 驗所得的結果得到最大之邊際效應。 (四) 主要發現或其他有關價值 本研究利用 PLG 為包覆材質，以 BSA 為 模 式 蛋 白 質 ， 已 成 功 地 製 備 大 小 約 11~160 μm 的微球體。此微球體表面大多 呈現平滑狀態，在釋放試驗的測試下，具 備有控制釋放的特性。此外，腸道標的分 子—LT 已利用聚合 連鎖反應選殖，並利 用大腸桿菌進行表現及純化，得到具功能 性的 LT。進一步將 LT 以口服的方式給予 小白鼠，也顯示 LT 具備 M 細胞標的的特 性，可以成功地誘發黏膜性免疫反應的發 生。進一步將結合 LT 及微球體包覆技術， 以完成 M 細胞標的型口服疫苗的雛形。 (五) 是否適合在學術期刊發表或申請專利
本研究相關之結果已發表於 Journal of Chinese Society of Veterinary Science [6,7] 及 Archives of Virology [8]。
五、參考文獻
[1] Beardsley, T. 1995. Better than a cure. Sci. Am. 272: 88-95.
[2] Bowersock, T.L., HogenEsch, H., Suckow, M., Porter, R.E., Jackson, R., Park, H., and Park, K. 1996. Oral vaccination with alginate microsphere systems. J. Control. Releas. 39: 209-220.
[3] McGee, J.P., Stanley, S.D., and O’Hagan, D.T. 1995. Zero order release of protein from poly (DL-lactide-co-glycolide) microparticles prepared using a modified phase separation technique. J. Controlled Release 34: 77-86.
[4] Alonso, M.J., Cohen, S., Park, T.G., Gupta, R.K., Siber, G.R., and Langer, R. 1993. Determinants of release rate of tetanus vaccine from polyester microspheres. Pharma. Res. 10: 945-953.
[5] [5] Sixma, T. K., S. E. Pronk, K. H. Kalk, E. S. Wartna, B. A. M. van Zanten, B. Witholy and W. G. J. Hol. 1991. Crystal structure of a cholera toxin-related heat-labile enterotoxin from E. coli. Nature 351: 371-377
[6] Ho, T.Y., Wu, S.L., Hsiang, C.H., Hou, B.H., and Hsiang, C.Y. 1998. Characterization and morphologic analysis of bovine serum albumin-loaded poly (DL-lactide-co-glycolide) microspheres. J. Chin. Soc. Vet. Sci. 24: 128-134.
[7] Ho, T.Y., Hsiang, C.Y. and Chang, T.J. 1998. Review: new trends in development of pseudorabies vaccines. J. Chin. Soc. Vet. Sci. 24: 1-13.
[8] Ho, T.Y., Hsiang, C.Y., Hsiang, C.H. and Chang, T.J. 1998. DNA vaccination induces long-term humoral immune responses against pseudorabies virus. Arch. Virol. 143: 115-125.
