行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
糖
鍵與分子量對臭氧降解寡醣之影響(1/2)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2214-E-002-024-執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學食品科技研究所 計畫主持人： 葉安義 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中
華
民
國 92 年 5 月 28 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果
報告
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計畫類別：■個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：NSC 91-2214-E-002-024
執行期間：
91 年
8 月 1 日至 92 年
7 月
31 日
計畫主持人：葉安義
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立台灣大學食品科技研究所
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
糖 鍵與分子量對臭氧降解寡醣之影響（1/2）
Effects of glycosidic bond and molecular weight on the ozonolysis of
oligosaccharides (1/2)
計畫編號：NSC 91-2214-E-002-024
執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人：葉安義 教授 國立台灣大學 食品科技研究所
一、
中文摘要 本 研 究以 四種 雙醣 （包 括 麥芽 糖 （maltose）、纖維二糖（cellobiose）、海藻糖 （trehalose）、幾丁二糖（chitobiose））為原 料 以 不 同 劑 量 的 臭 氧 （ 10mg/min 、 32mg/min、52mg/min、72mg/min、87mg/min） 探討於 70O C 下 糖 鍵 結（α-1,4、β-1,4、 α-1,1）對臭氧氧化降解雙醣的影響。實驗 結果發現麥芽糖與纖維二糖的單醣產率並 無差異，顯示臭氧於降解α form 與β form 之鍵結時，並無顯著性的差異。麥芽糖與纖 維二糖的單醣產率均低於海藻糖，顯示α -1,1 的鍵結較易受臭氧氧化而斷裂。幾丁二 糖（具有胺基）的單醣（葡萄糖胺）產率高 於纖維二糖（不具胺基）的單醣（葡萄糖） 產率，顯示胺基的存在，有助於單糖的產生。 關鍵詞：雙 醣 、 糖 鍵 結、 臭 氧 降 解 Abstr actThe ozonolysis of four disaccharides (maltose, trehalose, cellobiose, and chitobiose) has been studied using different ozone dosages (10mg/min 、 32mg/min 、 52mg/min 、 72mg/min、87mg/min) at 70oC. The α and β form of glycosidic bond did not significantly affect the act of ozonolysis. As the yield of monosaccharide from trehalose was higher than that from maltose or cellobiose, theα-1,1
glycosidic bond appeared to be more favorable thanα-1,4 or β-1,4 during ozonolysis. The presence of amide group on the glucose unit enhanced the yield of monosaccharide from chitobiose. The effects of ozone dosage on reaction rate and reaction order were also discussed.
Keywords: disaccharide, glycosidic bond, ozonolysis 二、緣由與目的 N-乙醯幾丁寡糖和幾丁寡糖是由幾 丁質或幾丁聚醣經水解所得聚合度為 2-10 的寡醣，分子量比幾丁質或幾丁聚醣小，可 溶於水，並具有許多生理活性，如活化吞噬 細胞、抗癌及抑菌性等。 幾丁寡醣的製備包括酸水解、酵素水 解、氧化降解、超音波降解等多種方法（陳 等，1996）。酸水解不具有選擇性，可使用 鹽酸、硫酸、硝酸（Allan and Peyron, 1995）、 磷酸（Hasegawa 等、1993）、醋酸等，鹽酸 的酸性較強，產率較高，故為最常用者，產 品以聚合度 1-4 的幾丁寡醣為主（Chang 等、 2000），其中以單醣為最多。反應後之溶液 有高濃度的鹽酸，需謹慎處理以免造成環保 問題，但是會增加成本。幾丁質酵素（Aiba, 1994）、幾丁聚醣酵素、纖維酵素、半纖維 酵素、溶菌酵素（Aiba, 1992）等是水解常用
的酵素，通常以混合酵素方法進行（Zhang
等、1999），可以在薄膜反應器內降解（Jeon
and Kim, 2000），雖然酵素有選擇性，但原料
不溶於水，水解速率低，所得產品中 N-乙醯 幾丁六醣與七醣的含量低（Cheng and Li,
2000），且酵素價格昂貴。氧化降解法以 H2O2 為主要氧化劑，輔以 NaClO2或 HCl 進行水 解，反應條件較強酸水解溫和，但是所得的 產品也是以聚合度 1-4 的幾丁寡醣為主（戴, 1999）。超音波可以進行部分降解，但是難 以產生聚合度 2-10 的寡醣。 臭氧是一種強氧化劑，可破壞許多有 機物的共價鍵結，產生降解的功能。臭氧的 使用方法簡便，價格便宜，無殘留的問題， 常被應用在水及空氣的消毒、淨化工程以及 廢水處理上，以臭氧降解有機物是環保工業 中常用的技術。以臭氧降解幾丁聚醣，發現 可以獲得幾丁五醣與六醣，但是隨著反應的 進行，溶液的 pH 值逐漸下降，顯示在反應 的過程中有酸的產生（陳, 2002）。酸的產生 可能是因為醣類受到臭氧氧化而開環，羥基 氧化成酸；或者是醣類並未開環但其中的羥 基氧化成酸，使幾丁寡醣具有酸根。 為瞭解臭氧降解醣類的過程中，鍵結 對臭氧降解醣類的影響。本研究以雙醣為起 始 反 應 物 ， 探 討 糖 鍵 的 氧 鍵 方式 結對 臭 降 解的影響。 三、材料與方法 A. 實驗材料 （一）雙醣 海 藻 糖 （ trehalose ）， 麥 芽 糖 （maltose），纖維二糖（cellobiose） 購 自美國 Sigma 公司。Chitobiose（幾丁 二糖）購自日本 Seikagaku 工業株式 會社。 （二）化學藥品
1. Potassium iodide ， Sodium
thiosulfate 購 自 德 國 Riedel-deHaen 公司。 2. Acetonitrile（氰甲烷）購自美國 Mallinckrodt HPLC 分 析 級 試 藥。 B. 實驗方法 秤取 2.5g 雙醣（海藻糖、麥芽糖、纖維 二糖）溶於 500mL 的去離子水溶液中，在 70OC 下通入臭氧（10mg/min、32mg/min、 52mg/min、72mg/min、87mg/min）進行臭氧 降解反應，分別於不同時間（0~4 小時）取 樣，測定降解產物的 pH 值，經 HPLC 測定 單糖的生成量。 由於幾丁二糖價格昂貴，故於低濃度下 進行反應。秤取 0.3g 纖維二糖或幾丁二糖溶 於 500mL 的去離子水溶液中，在 70O C 下以 臭氧（10mg/min、32mg/min、52mg/min、 72mg/min）進行臭氧降解反應，分別於不同 時間（0~2 小時）取樣，測定降解產物的 pH 值，經減壓濃縮後以 HPLC 測定單糖的生成 量。 降解反應的進行，乃將乾燥氧氣通入臭 氧產生機（SG-01A，住友精密工業公司，日 本），由高壓放電的板型電極，（操作電壓約 為 210 Volts，最大電流為 2.5A，放電室內壓 力為 0.9~1.1kg/cm2），放電產生臭氧。將臭 氧直接導入 KI 溶液中，以分析產生量。調 整閥門，將臭氧導入反應器中進行降解，由 sample port 收集溶液樣品，以進行分析。 C. 分析方法 （一）臭氧的定量 本 研 究 採 用 Standard Method 20th edition（1998）所認可的 Iodometric 碘定量 法，利用 KI 吸收液將臭氧吸收（如下所示 之反應式）。由於臭氧會將碘離子氧化成碘 分子，再以還原劑滴定，由還原劑的使用 量、當量濃度、與通氣時間等推算臭氧濃度。
O3 ＋2I-+H2O → I2＋O2＋2OH
2-分析步驟如下： 1. 直接將臭氧通入兩個裝有 2％KI 吸 收液（至少 200mL）的曝氣瓶(gas washing bottle)中，通氣約 10 分鐘。 2. 將 已 吸收 臭 氧之 KI 吸收液（ 兩 瓶），倒入燒杯中加入 10mL 之 2N H2SO4使 pH 值維持在 2.0 以下。 3. 以 0.1N 之 Na2S2O3滴定至碘的黃色 幾乎消失，加 1~2mL 澱粉指示劑， 繼續滴定至藍色消失，計其滴定量 A。 4. 計算臭氧濃度。 Ozone dose，mg/min＝[A ×N × 24]/T A：Na2S2O3滴定量，mL N：Na2S2O3的當量濃度 T：臭氧通氣時間，min （二）pH 值測定 以 pH meter ( SUNTEX,pH Meter,SP-2200,Taiwan ) 在室溫下測定 之。 （三）雙醣與單醣的分析 雙醣經臭氧降解後的產物，應以單醣 為主要成分，與一些酸類，以高效率液相層 析儀（HPLC）進行定性及定量分析。使用 的設備與操作條件如下： 系統：PU-980（JASCO,Japan） 管 柱 ： Hyperisil HS APS2 （ 4.6×250mm, 5µm,England） 移動相：acetonitrile：H2O＝65:35 流速：1mL/min 注射量：20µL
偵檢器：RI detector（JASCO RI-930,Japan） 恆溫：40℃（管柱恆溫箱,尚偉股份有限公司） 積分軟體：SISC. Co. 以高效率液相層析儀（HPLC）分析 臭氧氧化降解雙醣的產物，與標準品比對， 測定單醣與雙醣的生成量。 標準品單醣（glucose、glucosamine） 及 雙 醣 （ trehalose 、 maltose 、 cellobiose 、 chitobiose）以 acetonitrile：H2O＝65：35 溶
液（移動相）在 Hyperisil HS APS2（靜相） 流速 1ml/min 進行層析，將其分離得到各自 到達 RI 偵測器的時間，單醣較快，之後才 是雙醣。反應生成物以同條件下進行層析， 依此二種醣偵測時間判定成分為何。 （四）單醣產率與雙醣消失率 單醣產率：〔單醣重量 / 反應前雙醣重 量〕*100 雙醣消失率：〔（反應前雙醣重量-剩餘雙 醣重量）/（反應前雙醣重量）〕*100 單位：重量百分比 （五）臭氧降解雙醣的模式與反應動力學分 析 1. 臭氧降解雙醣模式 A → B + C B → C A：雙醣 B：單醣 C：氧化至裂環的產物 A 為未經降解的雙醣（原料），在反應 槽通入臭氧的瞬間，臭氧對 A 進行氧化降 解，產物為 B（單醣）、C（氧化至裂環的產 物）。在 B 產生後，B 也因臭氧隨機氧化降 解而生成 C。 2. 反應動力學分析 雙醣氧化降解後，產生不同分子量 的產物，可表示成 A → B + C+D+E+… 其中 A 為反應物（雙醣），產物 B 可能再降解為 C、D 或 E 等，是一個相當複 雜的反應式，為簡化數據分析的程序，可將 反應式表示為 A →P＋Q A：未經降解的雙醣
P：單醣 Q：氧化至裂環的產物 經由 HPLC 的定量可得到不同時間 反應物的量，可將降解速率（r）表為 -
r
a = dCACB/dt = kCAaCBb … … … （1） CA：成分 A 之體積莫耳濃度 ( mol/dm3 ) k：反應速率常數 n：反應階數 t：反應時間 CB：臭氧的體積莫爾濃度 假設〔O3〕濃度不是限制因子，（1） 式可簡化為假 a 次反應式 -r
A = K’CAa … … … .（2） 其中 K’= k*CBb，此為假（pseudo） b 次反應，故所得反應速率常數將受到臭氧 濃度的影響。 ( 2) 式可表為： ln(-r
A) = lnK’+ nlnCA … … … ( 3 ) 利用微分法( differential method )分析所 得數據，計算 K’與 n。 四、結果與討論 單醣的產率隨反應時間而改變，以纖維 二醣之降解為例，當臭氧劑量低於 87mg/min 時，單醣的產率隨反應時間或臭氧劑量而增 加（圖 1），當臭氧劑量為 87mg/min 時，可 於 1.5 小時內達到最高，隨之，所產生的單 醣可能繼續分解，使單醣的產率下降，但產 率均低於 2.5%，顯示臭氧降解的過程中，需 消耗許多二醣，如圖 2 所示，二醣的消耗隨 時間與臭氧劑量的增加而提高，當臭氧劑量 為 87mg/min 時，反應三小時後，纖維二醣 的剩餘量已很少，當臭氧劑量為 10mg/min 時，反應四小時後，僅耗用 40%的纖維二醣， 故臭氧劑量的提高，有助於降解反應的進 行。臭氧降解的過程中，pH 值呈現下降的趨 勢（圖 3），尤其是反應 0.5 小時，例如，臭 氧劑量為 10mg/min 時，pH 由 6.0 降為 4.0； 臭氧劑量為 87mg/min 時，pH 由 6.0 降為 3.0，顯示有許多酸產生，可能是導致低產率 的原因，所產生的酸為何？則需進一步探 討。麥芽糖、海藻糖與幾丁二糖的降解呈現 類 似 情 形 。 但 產 率 不 同 ， 當 臭 氧 劑 量 為 32mg/min 時，反應四小時後，海藻糖的產率 接近 6%（圖 4），而麥芽糖與纖維二糖的產 率相似，接近 1%，麥芽糖與纖維二糖的糖 鍵之差異為α form 與β form，故結果顯示 其並未影響臭氧降解之機制，海藻糖的糖 鍵為α-1,1，但具較高產量，顯示鍵結方式影 響臭氧之降解，提高臭氧劑量為 87mg/min 時（圖 5），三種雙醣（麥芽糖、纖維二糖與 海藻糖）皆於反應 1.5 小時達到最高產率， 海藻糖仍具有較高的產率（6%），麥芽糖與 纖維二糖間並無顯著性的差異，其最高產率 接近 2%。顯示臭氧劑量的增加並未影響糖 鍵斷裂的機制，但促使單醣（葡萄糖、葡 萄糖胺）產率增加，同時單醣也受臭氧隨機 的氧化降解形成更小分子的產物，不過在反 應初期單醣的生成速率高於單醣被氧化的 速率，所以單醣的產率隨反應時間的增加而 增加，當單醣的生成速率等於氧化速率時單 醣的產率達到最高，之後單醣的氧化速率大 於單醣的生成速率所以單醣的產率隨反應 時間的增加而減少。 幾丁二糖（chitobiose）與纖維二糖的糖 鍵均為β-1,4，不同點為幾丁二糖具有胺 基，纖維二糖不具胺基，實驗結果顯示幾丁 二糖具有較高的單醣產率（圖 6），經以 32 mg/min 之臭氧反應兩小時，幾丁二糖的產率 為 9.5%，但纖維二糖的產率僅略高於 2%， 顯示胺基有助於糖 鍵的斷裂。提高臭氧劑 量，使雙醣的消耗率增加（圖 7），當臭氧劑 量為 72 mg/min 時，每生產 1 莫耳的單醣， 需耗用 10 莫耳以上的雙醣，當臭氧劑量為 32 mg/min 時，每生產 1 莫耳的單醣，所需 耗用的雙醣低於 5 莫耳，提高臭氧劑量可加 速反應，但易使產生的單醣繼續氧化，致使單醣產率下降。
反 應 速 率 隨 著 臭 氧 劑 量 的 提 高 而 加 速，以纖維二醣（起始濃度 0.5 wt.%）為例
（表 1），當臭氧劑量由 32 mg/min 提高為 87
mg/min 時，反應速率由 4.48 x 10-5 mol/L min
增加為 2.43 x 10-4 mol/L min，證實提高臭氧 劑量可加速反應，反應次數（reaction order） 則介於 0.9 – 1.2 間，與臭氧劑量並無明顯的 相關性；降低纖維二醣的起始濃度為 0.06 wt.%時，反應速率呈減少的趨勢，當臭氧劑 量由 32 mg/min 提高為 72 mg/min 時，反應 速率由 3.02 x 10-5 mol/L min 略增加為 5.62 x 10-5 mol/L min，反應次數則介於 0.91-1.0 之 間，顯示雙醣起始濃度影響反應速率。如前 所述，幾丁二醣之單醣產率高於纖維二醣， 於臭氧劑量為 32 與 52 mg/min 時，反應速率 則較低（表 2），顯示反應速率高者，不盡然 具有高的單醣產率。 五、計畫成果自評 由以上之結果，可獲得下列之結論: 1. 在 70OC 下 ， 臭 氧 氧 化 降 解 纖 維 二 糖 （β-1,4）所得到的葡萄糖產率與臭氧氧化 降解於麥芽糖（α-1,4）所得的葡萄糖產率 並無差異，顯示鍵結中的 á form 與 â form 對臭氧氧化降解雙醣並無影響。 2. 在 70OC 下，臭氧氧化降幾丁二糖（具胺 基）所得到的葡萄糖胺產率高於臭氧氧化 降解於纖維二糖（不具胺基）所得的葡萄 糖產率，顯示胺基有助於臭氧氧化降解糖 鍵。 3. 在 70OC 雙醣起始反應濃度下 0.5%下，海 藻 糖 的單 醣 產率 高 於麥芽 糖 與 纖 維 二 糖，顯示α-1,1 的糖 鍵較易受臭氧氧化 而降解。 4. 雙醣的降解速率隨著臭氧劑量的增加而 增加，反應次數介於 0.7-1.4 之間。 本計畫之完成有助於瞭解臭氧氧化降解二 醣之機制，顯然糖 鍵之α form 與βform 對 臭氧氧化降解雙醣並無影響，但官能基（如 胺基）之存在有助於糖 鍵的斷裂，因此， 幾丁二醣的單醣產率最高，接近 10%，因此 以臭氧降解幾丁質以生產幾丁寡醣或水可 溶幾丁多醣是可行的方法，纖維素雖可受到 臭氧之裂解，但產率偏低，意味著原料價格 需非常低，才有可能商業化，提高反應物的 分子量或改變反應條件如能增加產率，則有 助於臭氧氧化多醣，以生產寡醣製程的發 展。 六、參考文獻 陳坤上、黃珮芬、陳聰松、陳幸臣，1996， 幾丁寡醣製備條件之探討，食品科學，23 （6）：874-883。 戴明志。1999。以氧化還原降解法從不同來 源幾丁聚糖製備幾丁寡醣之探討。國立台 灣海洋大學食品科學研究所碩士論文。 陳佳慶。2002。高溫下降解幾丁聚醣製備幾 丁寡醣的研究。國立台灣大學食品科技研 究所碩士論文。台北。
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Figure 1. Glucose yield from cellobiose by ozonolysis with various ozone dosages at 70OC
0 20 40 60 80 100 120 0 1 2 3 4 5 Reaction time（hour） D isapperance percentage（Wt%） 10mg/min 32mg/min 52mg/min 72mg/min 87mg/min
Figure 2. Disapperance percentage of cellobiose at 70OC 圖 2. 纖維二醣於臭氧降解（70O C）中之消 耗率 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 Reaction time（hour） pH 10mg/min 32mg/min 52mg/min 72mg/min 87mg/min
Figure 3. The changes of pH during ozonolysis of cellobiose
圖 3. 臭氧降解纖維二醣過程中，pH 值的變 化
圖 1.纖維二醣經臭氧降解（70OC）之葡萄糖
0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 Reaction time（hour） Y ield of monosaccharide（Wt%） trehalose cellobiose maltose
Fig 4. Yield of monosaccharide during ozonolysis (ozone dose32mg/min) of disaccharides (Initial concentration of disaccharides was 0.5 wt.%) 圖 4. 雙醣經臭氧降解(臭氧劑量 32 mg/min) 之單醣產率 （起始雙醣濃度為 0.5 wt.%） 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 Reaction time（hour） Y ield of monosaccharide（Wt%） trehalose cellobiose maltose
Figure 5. Yield of monosaccharide during ozonolysis (ozone dose87mg/min) of disaccharides (Initial concentration of disaccharides was 0.5 wt.%) 圖 5. 雙醣經臭氧降解(臭氧劑量 87 mg/min) 之單醣產率（起始雙醣濃度為 0.5 wt.%） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 Reaction time（hour） Y ield of monosaccharide（Wt%） cellobiose chitobiose
Figure 6. Yield of monosaccharide during ozonolysis (ozone dose 32mg/min) of disaccharides (Initial concentration of disaccharides was 0.06 wt.%) 圖 6. 雙醣經臭氧降解(臭氧劑量 32mg/min) 之單醣產率（起始雙醣濃度為 0.06 wt.%） 0 5 10 15 20 0 1 2 3 Reaction time（hour） D isapperance of chitobiose molecule/glucosamine molecule 10mg/min 32mg/min 52mg/min 72mg/min
Figure 7. Disapperance of chitobiose molecule / glucosamine molecule at various ozone dosages
圖 7. 於臭氧降解幾丁二醣時，每生產一莫 耳單醣所需消耗之雙醣
Table 1. Reaction rates and order for the ozonolysis of cellobiose 表 1. 纖維二醣之反應速率與反應次數
Ozone dose（mg/min） Reaction order Reaction rate（mol/min*L）x 104
0.5%a 0.06% 0.5% 0.06%
32mg/min 1.08 0.94 0.448 0.302
52mg/min 1.22 1.00 0.930 0.555
72mg/min 1.11 0.92 1.460 0.562
87mg/min 0.90 - 2.430
-a: Initial concentration of disaccharides.
Table 2. The reaction rate and reaction order for ozonolysis of chitobiose 表 2. 幾丁二醣之反應速率與反應次數
Ozone dose（mg/min） Reaction order Reaction rate（mol/min*L）x 105 R2
32mg/min 0.964 1.64 0.878
52mg/min 0.780 3.73 0.970
