類胰島素成長因子飼料酵母之構築與發酵生產

類胰島素成長因子飼料酵母之構築與發酵生產

中 華 民 國 95 年 2 月 7 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

類胰島素成長因子飼料酵母之構築與發酵生產

Construction and production of IGF feed yeast

計畫類別：

5

個別型計畫 □ 整合型計畫

計畫編號：

NSC 93-2313-B002-078

執行期間：

93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日

計畫主持人：

黃健雄

共同主持人：

計畫參與人員：

江承先、胡紹揚

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：

5

精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列

管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：

台灣大學生化科技學系

中 華 民 國 九十五 年 二 月 七 日

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因並將其接合至 pGAPZB 中構築表現質體 pGAP-IGF-2，線性化後電轉形至

Candida utilis 中再以含 zeocin 之 YPD 與糖蜜平板培養基篩選，可得表現 IGF-2

之飼料酵母轉形株。利用南方氏分析法鑑定轉形株。此轉形株於含糖蜜培養基之 搖瓶中培養 48 小時，IGF-2 約佔總可溶性蛋白質之 6.2%，每克乾菌體含 7.17 mg。 利用 Ni-NTA 親和層析法即可純化 IGF-2。N-端定序結果與原態相同，以免疫轉 印分析也確認為 IGF-2。質譜分析顯示分子量為 10717.9 Da，表示並無醣基化。 添加 120 nM 對 Balb/3T3 Clone 31A 細胞株之生長促進效果可達 74.18±10.73%， 生物活性為 4.73±0.50 x 103

U mg-1。培養液中之酒精濃度高於 16 g l-1時會嚴重抑

制生長，corn steep liquor (CSL)則能促進生長。利用固定速率饋料模式於五升發 酵槽中進行饋料批次培養，饋料液中含葡萄糖及 CSL，培養過程酒精控制在 10 g l-1以下，84 小時後菌體量可達 177.58 gDCW l-1，生產力 2.114 gDCW l-1 h-1，對 糖收率 0.423 g g-1_{，IGF-2 佔總可溶性蛋白質之 5.2%，每克乾菌體含 6.23 mg，} 生物活性為 2.95 x 104 U gDCW-1。 關鍵詞: 類胰島素成長因子、電轉形、飼料酵母、轉形株、生物活性。 ABSTRACT

The IGF-2 expression plasmid pGAP-IGF-2, constructed by the standard PCR method using expression plasmid of E. coli pET-IGF-2 as the template, was linearized with

BglII and transformed to Candida utilis by electroporation. The IGF-2 transformant

was obtained by screening from the zeocin-contained YPD agar plates and molasses agar plates sequentially. The transformant was characterized by Southern analysis. After 48 h cultivation in molasses medium in shake flasks, 7.17 mg of IGF-2 per gram of dried cell or 6.2 % of total soluble protein was achieved. IGF-2 could be purified by Ni-NTA affinity chromatography. The N-terminal amino acid sequence of was identical to that of the native IGF-2. Purified IGF-2 was further confirmed by anti-mouse IGF-2 antibody and the molecular mass was 10717.9 Da by the mass spectrum analysis, showing that there was no glycosylation. The bioactivity was determined by measuring the extent of growth promotion of Balb/3T3 Clone 31A cell line. A growth stimulation ratio of 74.18±10.73% was obtained in the presence of 120 nM of purified IGF-2. The bioactivity was 4.73±0.50 x 103 U mg-1. Ethanol of over 16 g l-1 in the medium would inhibit cell growth dramatically; however CSL could enhance the cell growth. While fed-batch culture with constant feeding of glucose and CSL in a 5-L fermentor, the cell concentration of 177.58 gDCW l-1 was obtained after 84 h cultivation and enthanol concentration in the medium was controlled under 10 g l-1. The productivity was 2.114 g DCW l-1 h-1 and the yield based on glucose was

0.423 g g-1. The IGF-2 content was 5.2% of total soluble protein or 6.23 mg per gram of dried cell. The bioactivity was 2.95 x 104 U gDCW-1.

Keywords: Insulin-like growth factor, electroporation, Candida utilis, transformant, bioactivity. 二、緣由與目的 本計畫乃為具體落實本研究室與中研院細胞與個體生物所吳金洌教授研究室有 關吳郭魚類胰島素成長因子利用大腸桿菌轉形株發酵生產研究之成果，將該基因 轉殖入Candida utilis中，探討此帶有類胰島素成長因子基因之新穎機能性飼料酵 母轉形株之構築方法及利用糖蜜原料於五升發酵槽之最適生產條件，建立穩定且 經濟可行之生產製程，以提供製備微粒飼料之所需，供國內外水、畜產業之使用， 拓展我國生技產業之領域。此含類胰島素成長因子之飼料，預期將會促進魚苗之 成長，縮短上市所需時間，有效提升市場競爭力。目前利用大腸桿菌表現之IGF 重組蛋白質，於活體內、外之試驗均具有顯著之生物活性[Chen et al. 2000; Hu et al. 2004]，而含IGF大腸桿菌菌體之飼料應用於赤鰭笛鯛及吳郭魚之養殖試驗也 顯現促進生長之效果，為了進一步普及IGF之飼料應用及克服安全性問題與可能 之消費者心理影響，乃再將IGF-2轉殖至飼料酵母中表現，以將國內有關類胰島 素成長因子之研發成果儘速順利推廣應用。 三、結果與討論 IGF-2 飼料酵母之構築與篩選 將完整之IGF-2基因片段經PCR放大後，於EcoRI與XbaI之切割位置接入表現載體 pGAPZB，得到pGAP-IGF-2 (圖一)。以BglII線性化後利用電穿孔法將其轉形至

Candida utilis BCRC 21645中[Kondo et al. 1995]。由於糖蜜中無法顯現zeocin之抗

性，因此乃先於含100 µg/mL zeocin之YPD平板培養基篩選出轉形株，再從中挑 選出能於糖蜜平板培養基上生長之單一菌落進行IGF-2之表現分析。篩選IGF-2 優良轉形株，抽取轉形株基因體，以PCR方法鑑定轉形株(圖二，Lane 5)。

4 搖瓶培養與IGF-2之表現 取1 mL甘油保存菌液接種於含50 mL糖蜜培養基之250 mL三角瓶中，於30℃、125 rpm培養24小時。接5 mL此活化培養液於含100 mL糖蜜培養基之500 mL Hinton 瓶中，再於相同條件下培養24小時為種培養，將種培養接於含100 mL糖蜜培養 基之500 mL Hinton瓶中進行培養實驗。離心收集48小時培養液菌體，以PBS緩衝 液清洗兩次，將菌體懸浮於含0.3 mg/mL lyticase之PBS緩衝液中，使濃度為OD 100，以玻璃珠研磨破菌。將破碎菌液離心，上清液以16.5%之Tricine SDS-PAGE 分析IGF-2之表現(圖三B)，densitometer分析後，由標準曲線(圖三A)求得IGF-2表 現量佔可溶性蛋白之6.2%，菌體內含量約7.17 mg gDCW-1_。 [圖三]

五升發酵槽之饋料批式培養 如圖四所示，在最適生產條件下，培養 84 小時後之菌體乾重為 177.58 gDCW l-1_， 對糖收率 0.423 g g-1_{。當培養至第 52 小時菌體濃度達 137.27 gDCW l}-1 時，培養 液黏度急速上升，此時溶氧趨近零，酒精濃度也快速上升，培養終了達 10.25 g l-1。生長因培養液黏度之上升而漸趨緩，整個培養之生產力為 2.114 gDCW l-1 h-1。 [圖四] [圖五] 生物活性分析

利用對Balb/3T3 Clone 31A細胞株之生長促進效果來表示生物活性，結果如圖五 所示，隨添加濃度的提高，生長促進效果也相對提升。以生長促進效果達100% 時所需之IGF-2量為一生物活性單位之定義，如圖酵母IGF-2生長促進效果達 100%所需之IGF-2量為211.30±22.16 ng，因此純化之酵母IGF-2之生物活性為 4.73±0.50 x 103 U mg-1，若與大腸桿菌從內涵體復性而純化得到之IGF-2活性 7.55±1.16 x 103 U mg-1相較，酵母菌之IGF-2活性約為大腸桿菌之62.65%。於五升 發酵槽以饋料批式培養得到之酵母菌體內IGF-2含量為6.23 mg g-1 DCW，此相當 於每克乾酵母菌體含生物活性2.95 x 104 U。

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pastoris 之操作系統，以 pGAPZB 載體成功構築 IGF-2 食、飼料酵母 Candida utilis

之表現菌株，可利用糖蜜培養基表現 IGF-2，為首先將 IGFs 於食、飼料酵母中 表現之研究。但此構築菌在完成大部分本計畫所擬定之工作後，雖仍具 zeocine 抗性，卻已無法正常表現 IGF-2，因此積極探討可能原因，導致成果報告延遲至 今。 以 PCR 檢測構築菌，證實 IGF-2 基因仍存在 C. utilis 轉形株之染色體上，但 GAP promoter 的前半段序列則可能部份遺失或發生變異，因此乃重新構築菌種。 檢視重新構築之轉形株，表現載體 pGAPZB-IGF-2 雖正確嵌入 C. utilis 之染色體 中，但轉形效率明顯較已知研究低，且不能有效篩選出表現 IGF-2 的菌種，此可 能是因利用異源載體來構築表現菌種所導致。顯然當初為儘速達成構築 IGF-2 飼 料酵母之構築所採用之手段，並不是一可行之操作策略。由於 IGF-2 飼料酵母之 應用潛力與龐大商機，本研究室已著手研發異源蛋白(IGF-2)在此食、飼料酵母 中有效表現之方法。 五、重要參考文獻 1.江承先. 2005. 類胰島素生長因子第二型飼料酵母之生產。台大微生所碩士論文。 2.Hu SY, JL Wu and JH Huang. 2004. Production of tilapia insulin-like growth factor-2 in

high cell density cultures of recombinant Escherichia coli. J Biotechnol. 107:161–171 3. Chen JY, JC Chen, CY Chang, SC Shen, MS Chen and JL Wu. 2000. Expression of

recombinant tilapia insulin-like growth factor-I and stimulation of juvenile tilapia growth by injection of recombinant IGFs polypeptides. Aquaculture 181:347-360.

4. Kondo K, T Saito, S Kajiwara, M Takagi and N Misawa. 1995. A transformation system for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA. J Bacteriol. 177: 7171-7177.

5.Hu SY. 2004. Studies on the expression and production conditions of tilapia insulin-like growth factor-2 in Escherichia coli and Candida utilis. Doctor Dissertation. Institute of Microbiology and Biochemistry. National Taiwan University. Taipei, Taiwan.

6.Chen JY, CY Chang, JC Chen, SC Shen and JL Wu. 1997. Production of biologically active recombinant tilapia insulin-like growth factor-II polypeptides in Escherichia coli cells and characterization of the genomic structure of the coding region. DNA Cell Biol 16:883-892. 7.Kondo K, Y Miura, H Sone, K Kobayashi and H Iijima. 1997 High-level expression of a